JPH04506003A - 治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療剤 本発明は、キモパパイン、キモパパインを含有する改良医薬組成物およびこの改 良組成物の溶液を損傷した、ヘルニア様の、またはその他の異常な哺乳動物を稚 内腎椎盤（ｓｐｉｎａｌ　ｄｉｓｃｓ）中に注入することからなる、このような を椎盤の処置方法に関するものである。本発明はさらにまた、本発明に係るキモ パパインの製造方法、この方法で使用するペプチドおよびアフィニティ　りロマ トグラフィ　マトリックス、ならびにキモパパインに対して生じさせた単一特異 性抗体調製物に関するものである。

キモパパインはボボー植物【カリ力　パパイア（Ｃａｒｉｃａ　ｐａｐａｙａ） のラテックス中に存在するシスティンブロティナーゼである。キモパパインには 、臨床上の用途、特にｒケモヌクレオリシスＪ　（ｃｈｅｍｏｎｕｃｌｅｏｌｙ ｓｉｓ）として知られているプロセスにより、脱出した。またはヘルニア様のを 椎盤の処置または坐骨神経痛の処置に用途が見い出されている（　Ｓｍ１ｔｈ　 Ｌ、によるＪ、　Ａｍｅｒ、　Ｍｅｄ。

Ａｓ５ｏｃ、　１８７．１３７〜１４０頁（１９６４））。

キモパパインの精製および特徴確認は、ＪａｎｓｅｎおよびＢａ１ｌｓによって 初めて行なわれた（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

１３７．４０５〜４１７頁（１９４１））。彼等はこの酵素の調製に酸沈殿およ び塩析の処理を使用した。さらに近年に、イオン交換クロマトグラフィにもとづ く精製方法か使用された。すなわち、たとえばＣＢ２０９８９９７　（Ｓｍｉｔ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）およびＣＢ２１５６８２１　（Ｓｉ ｍｍｏｎｓ）には両方ともに、キモパパインを他の既知のシスティン　ブロティ ナーゼから分離するために、カチオン交換樹脂を使用することが記載されており 、これらの方法は両方ともに、工業的規模でのキモパパインの製造に使用されて いる。しかしながら、生成する物質は、特にカチオン交換クロマトグラフイエ程 を組合せた、小規模の多段階法を用いて、ＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔに よって製造されたキモパパイン（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊｏ、２２３．８１〜８８頁（１９８４））に比較して、その比活性は比較的低 いことが見い出されている。このＢｕｔｔｌｅらによる生成物は高い比活性を有 するが、得られる収率は非常に低く、かつまたこの方法は商業的規模で使用する のには適していない。現在、Ｂｕｔｔｌｅらによって、この物質が最近になって 単離され、特徴確認されたブロティナーゼ、パパイア　ブロティナーゼ！■によ って汚染されており、このパパイア　ブロティナーゼｔＶはカチオン交換樹脂か らキモパパインと一緒に溶出されることが見い出された（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ 、　、２６１４６９〜４７６頁（１９８９年７月）〕。従って、カチオン交換ク ロマトグラフィは、パパイア　ブロティナーゼＩＶ夾雑物を実質的に含有してい ないキモパパインを調製するために使用することができる程度にまで、キモパパ インをパパイア　ブロティナーゼＩＶから分離することはできない。

アフィニティ　クロマトグラフィを使用することに関する刊行物もある。Ｐｏｌ ｇａｒは、多くの他の技術の中で、アガロース−水銀系カラムにおけるアフィニ ティ　りロマトグラフィを使用するキモパパインの精製方法を開示しており　（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、６５８．２６２〜２６９頁（ １９８１））。そしてまたＤｕｂｏｉｓ等は小規模技術を用いて、カリ力　パパ イア　ラテックスからシスティン　ブロティナーゼを分離することを報告してい るＣＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　（１９８８）　、３６ ９．７３３〜７４０頁）。この種のアフィニティ　りロマトグラフィでは、不活 性マトリックスに結合させた水銀系リガンドとそこにさらされるタンパク質のチ オール基との間で相互反応が生じる。すなわち、キモパパイン以外のタンパク質 、特にパパイア　ブロティナーゼ（Ｖのような他のシスティン　ブロティナーゼ もまた、このようなカラムに結合することができ、引続いてキモパパインととも に溶出されうる。

近年に、化学雑誌に、ヒト　カテプシンＢ　（Ｒｉｃｈ等によるＢｉｏｃｈｅｍ 、　Ｊ、　、２３５．７３１〜７３４頁、１９８６）およびヒストリシン（Ｌｕ ａｃｅｓおよびＢｕｒｒｅｔｔによるＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　、２５０．９０ ３〜９０９頁、１９８８）などの特定のブロティナーゼをエンタモエバヒストリ チ力（Ｅｎｔｏｍｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）から精製するために、不 動化したペプチド誘導体を用いるアフィニティクロマトグラフィの使用が記載さ れた。この試みは現在、キモパパインの精製法には使用されておらず、工業的規 模で用いるのに適した、改良されたキモパパイン精製方法に対する要求が明らか に残されている。

セリン　ブロティナーゼ　キモトリプシンのインヒビターである、成る種の合成 ペプチド誘導体は、ＷＯ３４１００３６５に記載されている。

本発明者らはここに、夾雑物、特にパパイア　ラテックス中に存在するパパイア 　ブロティナーゼＩｖを含む他のシスティン　ブロティナーゼを含有していない 。高活性のキモパパインを精製、単離するための新規な方法を発見した。

本発明は、実質的に純粋であり、活性形体の当該酵素を高割合で含有するキモパ パインを提供する。

本発明によるキモパパインは、パパイア　ラテックス中に見い出される免疫学的 に異なるプロティナーゼ、すなわちパパイン、パパイア　ブロティナーゼＩＩＩ （Ｐ　ＰＩＩＩ）　（これらはともに、Ｂｕｔｔｌｅおよびｅａｒｒｅｔｔによ りＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２２３．８１〜８８頁（１９８４）に記載されて いる〕および特に最近発見されたパパイア　ブロティナーゼＩＶ　（Ｐ　Ｐ　ｍ を実質的に含有していない。

従って、本明細書中で使用されているものとして、「実質的に含有していない」 の用語は、「実質的に免疫学的に純粋」の用語でも定義することができ、本発明 によるキモパパインとＢｕｔｔｌｅ等によって単離され、特徴確認されており（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、（１９８９年７月）、２６１．４６９〜４７６頁〕、以 下に簡単に説明する。純粋ＰＰ［Ｖに対して生じる特異性抗体との間にいかなる 実質的な交さ反応も存在せず、かつまたＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔによ り以前に開示された〔上記刊行物（１９８４）〕、パパインおよびＰＰ［［［に 対して生じる特異性抗体とのいかなる実質的な交さ反応も存在していないことを 意味する。ＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅ　ｔ　ｔの方法により製造された、い わゆる「純粋な」キモパパインは実質的な量（約１４％）のＰＰＩＶを含有する ことが見い出されており、そしてまた、これによって固有に生じる抗−キモパパ イン抗体生成物が本発明による精製キモパパインおよび精製ｐｐｘｖの両方に対 して特異性を宵することは、特に留意されるべきことである。本発明によるキモ パパインは、ＰＰ［Ｖ、　ＰＰ　Ｉｌｌおよびパパインをそれぞれ、０．２％よ り少ない量で、好ましくは多くて０．１９６の量で含有する。

抗原と抗体との間の交さ反応は、当技術で周知の慣用の技術によって測定するこ とかできる。このような技術には、たとえば、融合ロケット免疫電気泳動法およ び二重免疫拡散法（ＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔによる上記刊行物（１９ ８４）に記載〕、単純放射免疫検定法、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）および酵素 結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。

酵素調製物のそれぞれに存在する活性酵素の量は一般に、特定検定条件の下での 特定基質に対するその比活性で示される。本明細書て用いるものとして、ｒ　Ｂ ＡＰＮＡに対する比活性」の用語は、合成基質Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アル ギニンｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）を用いて、標準検定条件の下で検定し た場合における、生成ｐ−ニトロアニリンのピコモル／秒／生成物の乾燥重量ｍ ｇ　（ｐ　ｍｏｌ　／ｓｅｅ　／ｍｇ）で表わされるブロティナーセ活性を意味 するものとする。公知のキモパパイン医薬製剤に使用されている標準検定条件は 、ｒＢＡＰＮＡ検定法ＮＯ，ＩＪまたはｒｓｍｉｔｈ検定法」の部分で以下に詳 細に説明し、またこれから誘導される比活性は、３７°ＣおよびｐＨ６，０にお けるＢＡＰＮＡ（１ｍＭ）に対する比活性で表わす。本発明によるキモパパイン は、３７°Ｃおよびｐ）１６．０において、ＢＡＰＮＡ（１ｍＭ）に対して８０ ０〜１７００単位／ｍｇ、好ましくは１０００〜１７００単位／ｍｇ、たとえば ３７°Ｃおよびｐｉ（６，０で評価して、１２００〜２５００単位／ｍｇの比活 性を存するものと定義される。好適態様においては、本発明は３７°Ｃおよびｐ Ｈ６，０において、ＢＡＰＮＡ（１ｍＭ）に対して少なくとも１３００単位／ｆ ｆ１ｇの比活性を存するキモパパインを提供する。

プロテイナーゼ活性は、キモパパインおよびその他のシスティン　プロティナー ゼに関する広大な刊行物全体の中で、合成基質ＢＡＰＮＡからのｐ−ニトロアニ リンの放出として非常に広く認められているか、示されている比活性数値間を直 接に比較するには問題がある。正確な数値は、特に正確な条件、たとえば検定に 用いられるｐＨ１温度、緩衝剤組成および基質濃度に係る多くの因子に帰因する 。ＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔによって調製されたキモパパイン〔上記刊 行物（１９８４））は、彼等の論文中では、ＢＡＰＮＡに対して、２５６７　ｐ 　ｍｏｌ　／ｓｅｅ／ｍｇに相当する０、１５４μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を 存するものとして示されている。しかしながら、ＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅ ｔｔにより使用されている検定条件は、キモパパインの公知医薬指針に用いられ ている条件とは異なっており、これらの比活性は直接に比較することはてきない 。

ＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔにより調製された物質は、従来報告された最 高比活性を有するキモパパイン調製物であると信じられるので、本発明に係る初 期研究は、彼等の論文で特定されている検定条件を用いて行なわれた。本明細書 において、この方法をｒＢＡＰＮＡ検定法Ｎｏ、　２Ｊと記し、この方法から誘 導される比活性は、４０℃およびｐＨ６，８におけるＢＡＰＮＡ　（２，５ｍＭ ）に対する比活性の用語で表わし、検定条件かキモパパイン医薬製剤に関して用 いられている条件とは異なることを明確にする。

一つの検定法から得られた結果を、池の検定法から得られた結果に置き換えるた めに、単純な変換因子を適用することは科学的に正しいことではないが、この検 定法を用いて得られる結果は、慣用の医薬板ＢＡＰＮＡ検定法Ｎｏ、１を用いて 得られるものに比較して、２〜３倍高いことが見い出された。しかしながら、本 発明に係る初期研究では、４０℃およびｐｆ（６，８における本発明による純粋 キモパパインのＢＡＰＮＡ　（２，５ｍＭ）に対する比活性は、３０００〜４５ ００単位／ｍｇ、たとえば３５０Ｏ〜４５００単位／ｍｇであると定義できるこ とか証明された。

その研究か最近公開され（上記刊行物、１９８９年７月）、以下て簡単に説明す るように、本発明の発明者等は、従来技術によって調製されたキモパパインの従 来未知の夾雑物質、すなわちパパイン　ブロティナーゼＩＶ（Ｐ　Ｐ　ＩＶ）を 単離し、特徴を確認した。ＰＰ［ＶはＢＡＰＮＡに対して不活性であるが、アゾ カゼインに対してはブロティナーゼ活性を育する。さらにまた、アゾカゼインに 対するｐ　ｐ　ｔｖ活性は１ＪＭまでの濃度のニワトリ　シスタチンによって実 質的に阻害されないことが見い出された。本発明によるキモパパインのアブカゼ インに対する活性は、この濃度のニワトリ　シスタチンによって、少なくとも９ ５％阻害される。本明細書で使用するものとして、「アゾカゼインに対する活性 」の用語は、以下に記載する標準検定条件の下に、誘導体化タンパク質基質アゾ カゼインを用いて検定した場合に、生成される三塩化酢酸可溶性ペプチドの量７ 時間／生成物の単位乾燥重量による、ブロティナーゼ活性を表わす。好ましくは 、本発明によるキモパパインは、ｌμＭまでの濃度のニワトリ　シスタチンによ って、少なくとも９７％、さらに特に９８〜１００％阻害される、アゾカゼイン に対する活性を有する。

本出願人は、本発明によるキモパパインが夾雑タンパク質を含有せず、かつまた この酵素の活性形を高割合で含有するものとして、初めて調製された実質的に純 粋なキモパパインであると信じている。この進歩は、そこに夾雑しているタンパ ク質が、たとえばイオン交換および既知のアフィニテイ　カラムにおいて、キモ パパインとともに精製されるという発見の後に、はじめて達成できたものである 。引続く研究によって、この夾雑物はＰ　Ｐ　ＩＶとして単離され、特徴確認さ れた。ＰＰ［Ｖの調製に使用する方法は、純粋キモパパインの調製には適用でき ないが、Ｐ　Ｐ　ＩＶの調製は２つの重要なパラメーターを提供した。これによ って、純粋キモパパインの特徴か確認できたのである。すなわち、１）ＰＰＩＶ 特異性抗体に対する純粋キモパパインの交さ反応性は存在せず、そしてまた２） ニワトリ　シスタチンの存在下におけるアゾカゼインに対する活性は、純粋キモ パパインとＰ　Ｐ　［Ｖとては相互に異なっている。これら２つの特徴は、キモ パパインの精製に適する方法の開発にとって必要な基本的道具である。

本発明によるキモパパインのほとんど全部の意図する活用分野において、本発明 のキモパパインが選択されることは容易に明らかなことである。純粋な酵素調製 物は、酵素の特徴、たとえばそれらの触媒的特異性および構造に関して、充分に 確認しようとする者にとって核心的重要性を有する。

従って、本発明のもう一つの態様によって、本発明によるキモパパインを含有す る組成物が提供される。この組成物はＰ　Ｐ　［Ｖを実質的に含有していない。

本発明のキモパパインは、３７℃およびｐＨ６，０において、ＢＡＰＮＡ（１ｍ Ｍ）に対して８００〜１７００単位／ｍｇの比活性を有する。組成物は、適当な 重量の分離した単位形態であることができ、たとえば適量のキモパパインが脱気 したバイアルまたはアンプル中に、無水条件の下に密封されている形態であるこ とができる。このような組成物は、この酵素の酸化による不活性化を実質的に防 止するために、還元剤、たとえばジチオスレイトール、システィン遊離塩基、ま たはその酸付加塩などをさらに含有することができる。別様には、組成物は、塩 の形態で提供される可逆性システィン　ブロティナーゼインヒビター、たとえば ナトリウム　テトラチオネートまたは塩化第二水銀をさらに含有することができ る。これらの可逆性インヒビターは、この酵素の活性部位をブロックし、これに よって酵素を再活性化する還元剤により置き換えられるまで、酸化によるその不 活性化を防止する。その他の慣用の添加剤、たとえば重亜硫酸ナトリウムなどの 保存剤、ＥＤＴＡなどのキレート試薬および塩化ナトリウムなどの担体を、所望 により添加することができる。

純粋な酵素製剤を使用することはキモパパインの臨床用途、たとえばケモヌクレ オリシスにおいて特に重要である。このような処置に対するアレルギー反応が被 処置患者の３％余りで生じることがあることが報告されている。粉末状パパイア 　エキスは食品工業て広く使用されており、ケモヌクレオリシスに対するアレル ギー反応の多くは、このような製品による前感作によるものと考えられている。

しかしなから、哺乳動物に外来タンパク質抗原を注入すると常に、アナフィラキ シ−ショックの危険がともなうことも周知である。堅実な医療処置においては、 この処置で最適の効果を得、かつまたアレルギー反応の危険を最低にするために 、このようなタンパク質はいづれも、入手できる最も純粋な、そしてまた最も活 性な形態で用いなければならない。

従って、本発明の好適態様により、本発明によるキモパパインを含有する医薬組 成物か提供される。この組成物はＰ　Ｐ　［Ｖを実質的に含有していない。この キモパパインは、３７°ＣおよびｐＨ６，０において、ＢＡＰＮＡ　（１ｍＭ） に対して８００〜１７００単位／ｍｇの比活性を有する。医薬組成物はまた、好 ましくは医薬的に許容される無毒性の還元剤、たとえばシスティン遊離塩基また はその酸付加塩、たとえばＬ−システィン塩酸塩ｌ水和物をさらに含有する。一 般に、還元剤はキモパパイン４０００単位当りで約０．５〜３ｍｇの量で存在さ せる。この量は、たとえばキモパパインの１５〜９０重量％に相当する。しかし ながら、本発明による医薬組成物はまた、いづれの慣用の医薬的に許容される稀 釈剤、賦形剤または担体も含有することができ、たとえば重亜硫酸ナトリウムな どの保存剤、ＥＤＴＡなどのキレート試薬および塩化ナトリウムなどの担体を所 望により添加することができる。

本発明によるキモパパインを含有する医薬組成物は眼医療、たとえば眼病巣の処 置に、あるいは癒傷組織、たとえば焼面、潰瘍、圧壊死、とこずれおよびその他 の除活力化組織か存在する損傷の壊死組織除去に使用することができる。これら の組成物は一般に、局所施用に適する形態、たとえば傷口に直接に施用できるか 、またはこの組成物を含浸した包帯を傷口に適用できるような無菌の溶液、ゲル 、懸濁液または軟膏として提供することができる。

好ましくは、本発明によるキモパパインは整形外科用途に対して調剤される。こ のような医薬組成物は通常、非経口投与用の単位投与形態に調剤することができ 、たとえば適当な担体中の、または使用前に再構成するのに適した濃縮物形態の 無菌の発熱性物質を含有していない溶液または懸濁液の形態に調剤することがで きる。異常な、または損傷したを稚内を椎盤のを髄中に注入することによって、 ここを治癒または処置する用途に適した投与単位形態は、本発明によるキモパパ イン５００〜５０００ＢＡＰＮＡ単位（３７℃およびｐＨ６，０において１ｍＭ のＢＡＰＮＡ中で検定して）および還元剤、たとえばナトリウム　システィネー ト塩酸塩を、脱気したバイアル中に充填したものからなることができる。好適投 与単位形態は名目上、キモパパイン２０００または４０００　ＢＡＰＮＡ単位（ １ｍｌｉ［ＢＡＰＮＡ、３７°Ｃ１ｐＨ６，０）を含有する。投与単位形態は広 くは、たとえば脱気した容器に充填されており、所望により適当な担体、たとえ ば塩化ナトリウムと混和されているキモパパイン２〜５ｍｇ、好ましくは２．５ 〜３．５　ｍｇ、およびナトリウムシスティネート塩酸塩０．２〜３ｍｇ、好ま しくは１．０〜２、０　ｍｇからなることかできる。

以下に示す実験において、２６の血清試料はいづれも、ＣＢ２０９８９９に記載 の方法により製造された市販のキモパパイン製剤、Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ　 （登録名）に対して、自然獲得ＩｇＥ抗体を有することが見い出された。これら の血清は、本発明によるキモパパインに対するＩｇＥ抗体およびパパイア　ラテ ックス中に見い出される３種の他のシスティン　ブロティナーゼ、すなわちパパ イン、ＰＰ［［ＩおよびＰ　Ｐ　［Ｖに対するＩｇＥ抗体を含有することも、本 発明によって、実験的に証明された。しかしながら、キモパパイン、ＰＰＩ［Ｉ およびＰ　Ｐ　［Ｖに対する平均１ｇＥレベルは、検出されたＩｇＥのほぼ７５ ％がＰＰ［Ｉ［およびＰＰＩＶに相当するものであることを示した。これらの結 果は、これらのタンパク質が実質的に免疫原性を有し、従来入手できた形態のキ モパパイン中に含有されている抗原性夾雑物の主要部分を構成しており、驚くほ ど大きい潜在的抗原性害毒を示すことを明白に示している。従って、本発明によ る医薬組成物は、従来技術の組成物にまさる実質的な利点を有する。

本発明はまた、哺乳動物の損傷した、ヘルニア様の、またはその他の異常なを稚 内を椎盤を、ケモヌクレオリシスによって処置する方法に関するものであり、こ の方法は、上記を椎盤中に、本発明によるキモパパインの医薬的に許容される溶 液を、このを椎盤の部分を選択的に溶解するのに充分の量で注入することからな る。

本発明はさらにまた、哺乳動物対象における異常なを椎盤を処置するもう一つの 方法に関するものであり、この方法は、 ｉ）を椎盤中に針を装入し、 ｉｉ）この針の位置をＸ線によって確認し、次いで１ｉｉ）本発明によるキモパ パインの医薬的に許容される溶液を、当該を椎盤の部分を選択的に溶解するのに 充分な量で、このを椎盤中に注入する、 ことからなる。

本発明はまた、キモパパインの精製方法に関するものであり、この方法は、 ａ）可逆性キモパパイン阻害性ペプチドがキモパパイン分子の活性部位に結合す るように、このペプチドのＮ−末端に、場合によりスペーサー　アームを介して 、共有結合している支持マトリックスからなる活性部位特定アフィニティ　りロ マトグラフィ　マトリックスとともに、粗製キモパパインの水溶液をインキュベ ートし、次いてｂ）適当な溶出剤によって、キモパパインを溶出する、ことから なる。

本発明によるキモパパイン精製に、出発材料として使用する粗製キモパパインは 、新鮮なパパイア　ラテックスのエキス、市販の噴霧乾燥ラテックス製剤から得 られる溶液、パパイン濃縮物または部分的に精製されているキモパパインである ことができ、あるいは通称［純粋Ｊなキモパパインの市販製品の溶液であること ができる。

しかしながら、パパイア　ラテックスのようなパパイアの比較的完全なエキスは 、除去が望まれる他の天然産生成分を非常に実質的な量で含有していることは当 業者に認識されている。従って、好ましくは、このような成分の実質的部分を、 たとえば濾過または遠心分離による不溶性物質の分離によって除去し、その後で 、この精製キモパパイン溶液をアフィニテイ　りロマトグラフイ　マトリックス とともにインキュベートする。しかしながら、本発明者によって、酸沈殿工程が 特に存利であることが見い出されており、この工程中に、不純物の実質的部分か 沈殿する。

はぼ５０年間にわたり、キモパパインの精製に使用されてきた酸沈殿法では、粗 製キモパパインの水溶液のｐＨをｐＨ２はとまで低く減少し、放置し、次いでキ モ１＜　１＜イン溶液を分離する。驚くべきことに、本出願人はここに、この方 法に用いられる正確なｐＨが、生成するキモｌ々）くイン溶液のＰ　Ｐ　［Ｖ汚 染に対して臨界的な影響を及ぼすことを証明した。キモパパインの精製における 粗製物質の初期工程であると従来考えられてきた、この処理の注意深い追跡およ び制菌によって、Ｐ　Ｐ　［Ｖによる汚染が劇的に減少されることがここに見い 出された。さらにまた、このＰ　Ｐ　［Ｖタンパク質が慣用の技術によっては、 キモパパインと一緒に精製されることも、ここに見い出された。

従って、本発明はまた、キモパパインの精製方法を提供し、この方法は、 １、粗製キモパパインを含有する水性混合物を、１．２〜１．８のｐＨで沈殿さ せ、 ２、この混合物からＷＩａキモパパインの水溶液を分離し、次いで ３、この粗製キモパパインの溶液を中和し、そしてまた必要に応じて、塩析する 、 ことからなる。

好ましくは、この精製工程中に少なくとも１回の、たとえばＢｕｔｔｌｅおよび Ｂａｒｒｅｔｔにより上記刊行物（１９８４）に記載されているような慣用のカ チオン交換クロマトグラフィを行ない、上記生成物から残留タンパク質夾雑物を いづれも除去する。商品名Ｍｏｎｏ　−ＳまたはＳ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈ Ｐ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）として市販されているものなどのカチオン交換樹脂 による高速クロマトグラフィ、たとえばＦＰＬＣ”を最終工程として使用すると 特に好ましい。

本発明の特に好ましい態様においては、キモパパインの精製方法は、 ｉ）粗製キモパパインを含存する水性混合物を、２．０より小さいｐＨで沈殿さ せ、 ｉｉ）この混合物から粗製キモパパインの水溶液を分離し、 １ｉｉ）この粗製キモパパイン溶液を中和し、そしてまた必要に応じて、脱塩さ せ、 ｉｖ）可逆性キモパパイン阻害性ペプチドがキモパパイン分子の活性部位に結合 するように、このペプチドのＮ−末端に、場合によりスペーサー　アームを介し て、共有結合されている支持マトリックスからなる活性部位特定アフィニティ　 りロマトグラフイ　マトリックスとともに、工程（ｉｉｉ）から得られる溶液を インキュベートし、次いて Ｖ）適当な溶出剤によって、キモパパインを溶出する、ことからなる。

上記の好適なカチオン交換クロマトグラフイ工程は、所望により、上記アフィニ ティ　クロマトグラフィの直前に、または後で、別の工程として、または追加の 工程として使用できることは当業者にとって明白である。

粗製キモパパインを含存する水性混合物は、水または水性緩衝液、たとえばリン 酸塩または酢酸塩緩衝液中に懸濁されている、たとえば新鮮なパパイア　ラテッ クス、噴霧乾燥パパイア　ラテックスまたはパパイア濃縮物（たとえば、Ｐｏｗ ｅｌｌ　＆　５ｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄ、英国または５ｉｅｂｅｌｓ　、米国から 市販されている噴霧乾燥ラテックス）からなることができる。好ましくは、この 混合物を酸沈殿処理する前に、慣用の方法により、たとえば濾過または濃縮によ って、不溶性物質を除去する。この混合物に有機酸または無機酸、好ましくは塩 酸などの水性無機酸を徐々に加えることによって、この混合物のｐＨを、１．０ 〜２．０、好ましくは１．２〜１．８、さらに特に約１．５のｐＨに減少させる ことにより酸性にすることができる。

沈殿した物質は、慣用の方法により、たとえば濾過または遠心分離により除去す ることができる。生成した酸性粗製キモパパイン溶液は、ＰＰＩＶおよびパパイ ンが失われており、かつまたＰＰＩ［Ｉが少ない程度にまで失われていることが 見い出された。

この酸性粗製キモパパイン溶液は、いづれかの引続くクロマトグラフィ工程に付 する前に、この溶液をアルカリ性剤、たとえば水酸化ナトリウム水溶液で中和し 、次いで好ましくは、慣用の方法で、たとえばゲル濾過または透析により、この 溶液から過剰の塩を除去する必要があることは当業者にとって明白である。さら に別の沈殿した物質はいづれも、濾過または遠心分離により除去することができ る。

これらの酵素の活性は、還元剤、たとえばジチオスレイトールまたはシスティン により、あるいは痕跡量の重金属、たとえば水銀をキレート試薬、たとえばＥＤ ＴＡ。

またはキレート形成樹脂、たとえばＣｈｅｌｅｘ（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ、英国）の商 品名で販売されているもので除去することにより、活性化させることによって明 白に増強することができることはシスティン　ブロティナーゼ分野で周知のこと である。システィン　ブロティナーゼの活性部位の基本的特徴であることが知ら れており、そしてまたその活性にとって必須である遊離チオール基の存在が、こ のような処置によって最適にされる。好ましくは、重金属の除去は、ＥＤＴＡ含 有緩衝液に対する透析によって行なう。別法として、カチオン交換クロマトグラ フイ工程を使用する場合には、重金属はキモパパインを還元剤により活性化させ ることによって除去することができる。この場合には、重金属はカチオン交換カ ラムに結合され、引続いてこのカラムから洗出される。

有利には、中和後に得られる粗製キモパパイン溶液を還元剤、たとえばシスティ ンで処理し、活性部位の最大露呈を確保し、次いで適当なタンパク質含有量、た とえば３０ｍｇ／ｍｌまで稀釈する。この中和された粗製キモパパイン溶液を次 いで、活性部位特定アフィニテイ　りロマトグラフイ　マトリックスと一緒にイ ンキュベートする。これによって、キモパパインは、そこに結合されている阻害 性ペプチドに、その活性部位を介して特異的に結合される。キモパパイン溶液は 、たとえば３５〜４０ｍ１／時間／ｃｍ２の速度で、アフィニティ　りロマトグ ラフィ　マトリックスのかラムに適用することができる。

アフィニティ　りロマトグラフイ　マトリックス１リツトルに対し、約１〜４ｇ のキモパパインを結合させることができる。

アフィニティ　りロマトグラフィ　マトリックスは、ゲルまたは膜マトリックス なとの支持マトリックスからなり、阻害性タンパク質はそこに共存結合されてい て、この結合によって不動化されている。好適には、この支持マトリックスは、 たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の商品名で販売されている ものなどのアガロース　ゲルであるが、Ｚｅｔａ（Ａｎａｃｈｅｍ）の商品名で 販売されているもののような誘導体化セルロース系膜物質を使用することもでき る。このペプチドのＮ末端は、直接に、またはスペーサー　アーム、たとえばＥ ＣＨ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の商品名で販売されて いる好適ゲル　マトリックスによって付与されるような９炭素原子のスペーサー 　アームを介して結合させることができる。このゲル　マトリックスの遊離のカ ルボキシ基と阻害性ペプチドの遊離アミノ基との間のペプチド結合の生成をもた らすカップリングは、慣用の方法て、たとえば水溶性カルボジイミド、たとえば Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ ＥＤＣ）により助長される酸触媒縮合によって、達成することができる。一般に 、カップリングは、ゲル　マトリックスと阻害性ペプチドの溶液とを一緒に、Ｅ ＤＣの存在の下に、たとえば室温で２４時間、おだやかに攪拌することによって 達成される。ゲル　マトリックスに対するペプチドの適当なカップリング割合は 、たとえばペプチド３−４このアフィニティ　りロマトグラフィ　マトリックス は、使用前にカラムに前充填することかできる。しかしながら、使用されるクロ マトグラフィ　マトリックスがゲル　マトリックスである場合には、バッチ式イ ンキュベーション工程を利用することもでき、次いで所望により、このマトリッ クスをカラムに充填し、引続いて酵素の溶出を行なうこともてきる。好適には、 このマトリックスを使用する前に、水性緩衝液で充分に洗浄し、痕跡量の未結合 ペプチドおよび縮合触媒を除去する。製造に使用する場合には、アフィニティ　 りロマトグラフィマトリックスのカラムは、好ましくはその場での洗浄、たとえ ば水性エタノールによる洗浄に対して耐性であるべきであり、この場合には、こ のカラムは再使用することができる。

可逆性キモパパイン阻害性ペプチドは、支持マトリックス上に不動化されている 場合には、粗製キモパパイン調製物中に見い出される他のシスティン　ブロティ ナーゼ、特にＰ　Ｐ　［Ｖの活性部位に結合することができるが、引続いてそこ から分離することかできるペプチドである。

好適な阻害性ペプチドのグループの中で、Ｃ末端アミノ酸はアルデヒド誘導体、 たとえばセミカルバゾン、メトキシイミンまたはフェニルアラニンもしくはフェ ニルアラニン類縁体のオキシムを包含する。さらに特に、Ｃ末端アミノ酸は、フ ェニルアラニン誘導体、たとえばＤ−またはＬ−フェニルアラニン　セミカルバ ゾン（ＰｈｅＳｃ）、メトキシイミン（ＰｈｅＭｏ）またはオキシム（Ｐｈｅ（ ｌｘ）　、あるいはフェニルアラニン類縁体の誘導体、たとえばＤ−またはＬ− アラニン　セミカルバゾン（ＡｌａＳｃ）　、Ｄ−またはＬ−シクロへキシルア ラニン　セミカルバゾン（　Ｃｈａｓｅ）、あるいはＤ−またはＬ−ロイシン　 セミカルバゾン（ＬｅｕＳｃ）であることができる。下記のＣ末端ジペプチド類 は有利なキモパパイン阻害性ペプチドであることが見い出された、すなわち：　 Ｌ　−Ａｌａ　−　Ｌ　−ＰｈｅＳｃ　。

Ｌ　−Ａｌａ　−Ｄ　−ＰｈｅＳｃ　、　Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｄ　−ＰｈｅＳｃ　 、　Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−ＰｈｅＳｃ　、　Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−ＰｈｅＭ ｏ　、　Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−ＰｈｅＯｘ　、　Ｌ　−Ｔｙｒ　−Ｌ　−Ｐｈ ｅＳｃ　、　Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−ＣｈａＳｃおよびＬ　−Ａｌａ　−　Ｌ　 −ＬｅｕＳｃ　ｏ　ジペプチドＬ−Ｐｈｅ　−　Ｌ　−　ＰｈｅＳｃは、Ｌｕａ ｃｅｓおよびＢａｒｒｅ　ｔ　ｔにより開示されている（２５０、９０３〜９０ ９頁、１　９　８　０）。

特に好適なペプチドはジペプチド類、特にＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ　、　Ｌ 　−Ａｌａ　−　Ｄ−ＰｈｅＳｃおよびＬ−Ｐｈｅ−Ｄ−ＰｈｅＳｃである。こ れらの新規な阻害性ペプチドそれ自体およびこれらのペプチドを含有する新規な アフィニティクロマトグラフィ　マトリックスは、本発明のもう一つの態様を構 成する。

このアフィニティ　りロマトグラフィ　マトリックスからキモパパインを溶出す るのに先立ち、このマトリックスは、たとえばｐＨ４〜５のクエン酸塩または酢 酸塩緩衝液のような水性緩衝液で洗浄し、非特異的結合物質を除去することか望 ましい。この洗浄用緩衝液およびまた溶出用緩衝液には、疏水性相互反応および マトリックスと粗製キモパパイン成分との間の他の非特異的結合反応を減少させ る試薬を添加すると、特に有利であることが見い出された。このような試薬は、 たとえばＥＤＴＡ。

イソプロパツールおよびエタンジオールを包含する。

キモパパインは次いて、このマトリックスから適当な溶出剤を用いて溶出する。

適当な溶出剤は、阻害性ペプチドに対する活性部位の親和性を減じることによっ て、あるいはペプチドを活性部位から選択的に位置変更することによって、不動 化阻害性ペプチドとそこに結合しているキモパパインとの間の結合を分断する。

阻害性ペプチドに対するキモパパインの親和性は、たとえばその活性部位の特性 をイソプロパツールのような変性剤により、またはキモパパインの活性ｐＨ範囲 以上または以下のｐＨを存する溶出剤により、減少させることかできる。しかし ながら、このような溶出剤は、溶出された酵素の不可逆的不活性化が生じないよ うなものてなければならないことは当業者にとって明白である。別法として、キ モパパインは、阻害性ペプチドに堅く結合する成分、たとえば別種のシスティン 　ブロティナーゼを過剰量で含有する溶出剤によって選択的に転置させることも てきる。

しかしながら、本発明の好適態様においては、溶出剤は、キモパパインの活性部 位に競合的に結合する可逆性システィン　ブロティナーゼ　インヒビターを含有 しており、これによって、キモパパインを不動化阻害性ペプチドから転置させる 。慣用のインヒビターには、たとえば低分子量ジスルフィド類、たとえば２，２ ′−ジピリジルジスルフィド、ヒドロキシエチルジスルフィド、メチル−２−ピ リジルジスルフィドおよびナトリウム　テトラチオネート、ならびに水銀系試薬 、たとえば塩化第二水銀、ｐ−クロロマーキュリベンゾエートおよびメルサリル が包含される。キモパパインと不動化阻害性ペプチドとの間の親和性が、使用さ れる特定のペプチド、溶出剤緩衝液のｐＨ１イオン強度および組成、ならびに使 用される温度によって異なることは当業者にとって明白である。従って、キモパ パインの溶出に要求されるブロティナーセ　インヒビターの正確な性質および濃 度はまた、変えられる。さらにまた、水銀系試薬は一般に、ジスルフィド試薬よ りも迅速に、結合キモパパインと平衡になるので、このようなインヒビターを用 いると、連続溶出を使用することができる。結合キモパパインとゆっくりにだけ 平衡になるインヒビターは、キモパパインの溶出に先立ち、たとえば１〜２時間 またはそれ以上の時間にわたり、マトリックスをインヒビターとともにインキュ ベートする必要があることかある。しかしながら、溶出フラクションのタンパク 質含存量およびブロティナーゼ活性は慣用の方法て追跡することができ、そして また溶出側のイオン強度または種類およびマトリックスとインヒビターとのイン キュベーション時間は、キモパパインをマトリックスから効果的に、かつまた選 択的に転置するために変えることができる。少ない量のタンパク質を含有するか 、または少ない量のキモパパイン活性を有する溶出フラクションは次いで、廃棄 することかできる。

好ましくは、溶出剤のｐＨは、キモパパインと阻害性ペプチドとの間の相互反応 を弱めるのに充分に低く、たとえばｐＨ４〜５、さらに特にｐＨ４，５である。

適当な溶出剤には、たとえばクエン酸ナトリウム（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（ １ｍＭ）を含有する水性エタンジオール（３３％）中のヒドロキシエチルジスル フィド（１００ｍＭ）、ｐＨ４，５；　クエン酸ナトリウム（５０ｒｎＭ）およ びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有する水性エタンジオール（３３％）中のメチルピリ ジルジスルフィド（３０ｍＭ）、Ｉ］Ｈ４，５；水酸化ナトリウム（５０ｍＭ） およびＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を含有し、酢酸でｐＨ４，５に調整されている水性 エタンジオール（３３％）中のメルサリル酸（１０＋ｎＭ）および酢酸ナトリウ ム（５０ｍＭ）を含有する水性エタンジオール中の塩化第二水銀（１０ｍＭ）　 、ｐＨ４，５が含まれることか見い出された。塩化第二水銀は特に好適な可逆性 システィンブロティナーゼ　インヒビターである。

本発明による好適方法におけるアフィニティ　りロマトグラフィ工程は、ＢＡＰ ＮＡに対する活性に関して測定して、あるいはＥ−６４またはヨード酢酸による 活性部位滴定によって、この方法により精製されたキモパパインの比活性を明白 に増加させる。活性形体のキモパパインは、好んで結合され、そしてまた溶出さ れ、従って、粗製物中に存在する不活性形体のキモパパインおよびいくつかの他 のシスティン　ブロティナーゼとは異なっている。アフイニテイ　クロマトグラ フィによって精製された、本発明による新しく調製したキモパパインは一般に、 少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに特に少なくとも９０％ の活性酵素を含有する。

一般に、精製キモパパインは、溶出液から採取し、その後で貯蔵するか、または 使用する。好ましくは、この酵素の活性部位からシスティン　ブロティナーゼ　 インヒビターを転置させるために、溶出されたキモパパインはさらに精製する。

インヒビターは、システィンなとの還元剤の過剰量を添加することによって転置 させ、所望によって、任意に慣用の技術、たとえばゲル濾過または透析を用いて 、この転置されたインヒビターを分離する。

別法として、インヒビターはまた、特殊な樹脂上への吸着によって分離すること ができ、たとえば低分子量ジスルフィド類はグルタチオン　アフィニティ　カラ ムに吸着させることができ、そしてまた水銀系試薬はキレート形成樹脂に吸着さ せることができる。好適には、インヒビターは、この酵素をカチオン交換カラム に結合させたまま、還元剤、たとえばシスティンで活性化し、引続いてインヒビ ターをカラムから洗出することによって分離する。採取された精製キモパパイン は好ましくは、たとえば冷凍乾燥によって凍結乾燥させた後に、貯蔵する。

本発明によるキモパパインの特徴は、当業者に知られている方法によって確認す ることができる。このような方法には、たとえばＮ−末端アミノ酸分析、Ｅ−６ ４またはヨード酢酸による活性部位滴定およびその場合の不活性化率、ドデシル 硫酸ナトリウムまたはマルチゾナルカソダル　ポリアクリルアミド　ゲル電気泳 動および異なるブロテｌアーゼ基質に対する活性が含まれる。

本発明による新規な阻害性ペプチドは、当技術で既知の方法と同様の方法で調製 することができる。−例として、ジペプチド誘導体は、以下の一連の工程で合成 することができる： ａ）阻害性ペプチドのＣ末端を形成するためのアミノ酸（第一アミノ酸）のＣ末 端は、たとえばイソブチルクロロホーメートおよびＮ−メチルモルホリンの存在 の下に、０、Ｎ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩とを反応させ、ジメチルヒ ドロキシアミド誘導体を生成させることにより、保護することができる。好まし くは、この第一アミノ酸のＮ−末端を初めに、たとえば三級ブトキシカルボニル で保護する。

ｂ）この保護された第一アミノ酸、たとえばジメチルヒドロキシアミド誘導体を 次いで、強酸、たとえば三フッ化酢酸と反応させ、四級アンモニウム塩を生成さ せる。

Ｃ）この保護された第一アミノ酸の四級アンモニウム塩を次いて、第二アミノ酸 誘導体、たとえばＮ−カルボベンゾキシ誘導体と反応させ、ジペプチド誘導体を 生成させることができる。

ｄ）上記で生成されたジペプチド誘導体を温和な還元剤、たとえば水素化ジイソ ブチルアルミニウムまたは水素化リチウムアルミニウムで還元し、このジペプチ ドのＣ−末端部に遊離のアルデヒド基を生成させることができる。

ｅ）上記で生成されたアルデヒドを、たとえばセミカルバゾンとの反応によりセ ミカルバゾンに、メトキシアミン塩酸塩との反応によりメトキシイミンに、ある いはヒドロキシルアミンとの反応によりオキシムに、誘導体化させることができ る。

ｆ）最後に、この保護されたＮ−末端を脱保護することができ、たとえばＮ−カ ルボベンゾキシ基は木炭上１０％パラジウムを使用する接触還元により分離する ことができる。

分析方法の説明 タンパク質測定 可能な場合には、パパイア　ラテックス調製物に関してはＡ□。、１％＝２０． ０を用いるＡ２．。によって、およびまた精製または部分精製キモパパイン調製 物に関してはＡｔｅ。、１％＝１８．３を用いるＡ、。によって測定した（　Ｒ ｏｂｉｎｓｏｎ　、１９７５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｌ　４．３６９５〜 ３７００）。成る種のチオール含有試薬およびジスルフィド化合物は２８０ｎｍ で吸光する傾向を有する。これらか存在する場合には、ｅｉｏ−ＲＶｄ染料結合 検定法（Ｂｉｏ−Ｒ＋ｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）を使用してタンパク 質濃度を測定した。濾過し、噴霧乾燥したパパイアラテックス溶液（Ａ２８゜、 １％＝　２０．０　）を標準として使用した。この方法はＡ２．。におけるより もプロトンの干渉か小さい。精製酵素調製物中のタンパク質は、この生成物の総 乾燥重量によって推定した。

キモパパイン活性の測定 ａ）ＢＡＰＮＡに対する活性（検定法Ｎｏ、ｌ）−ＳｍｉＩｈ検定法 試料をそれぞれ、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびシスティン１．０ｍＭの最終容積に まで加えた。酵素（試料中に存在する場合）を３７°Ｃて５分間活性化させた後 に、予め３７°Ｃに加熱されているＮ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニンｐ− ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）（１，２５ｍＭ）基質溶液の添加により反応を開 始させた。

註）基質溶液は、ＢＡＰＮＡ３００ｍｇを温かいジメチル　スルホキシド中に溶 解し、３７°Ｃに予備加熱されている緩衝液１　４５０ｍ１に、この溶液をゆっ くり加え、次いで追加の緩衝液ｌによって５００ｍ１にすることによって調製し た。この基質溶液は３０°Ｃ以上に保持し、ＢＡＰＮＡの沈殿を防止した。

３７°Ｃにおけるインキュベーションを３０分間続け、次いで酢酸（４Ｎ）１ｍ Ｍの添加により反応を止めた。放出された４−ニトロアニリンを、△Ａ　４１０ の測定により決定した。活性１単位は、これらの条件の下での４−ニトロアニリ ン　ｌピコモル（ε＝　８８００　Ｍ−’ｃｍ−’）　／秒の放出に相当する。

これらの検定条件は、Ｓｍ１ｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、の名称 て出願されたＧＢ２０９８９９７中で用いられている条件に相当し、世界中で販 売されているキモパパインの医薬製剤、たとえばＢｏｏｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ　 ＰＬＣ、英国によりＣｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎの商品名で販売されているキモパ パインおよびＳｉｎｐｏｏｎｇ、韓国によりＤｉｓｋｅｎの商品名で販売されて いるキモパパインの検定に使用されている。これらの活性単位は国際的に認めら れており、一般にｒ　Ｓｍ１ｔｈＢＡＰＮＡ検定単位」として用いられている。

ｂ）ＢＡＰＮＡに対する活性（検定法Ｎｏ、２）試料をそれぞれ、ＥＤＴＡ（１ ｍＭ）およびジチオスレイトール（２ｍＭ）またはシスティン（４ｍ１ｉｌ）を 含有する水性リン酸ナトリウム緩衝液（０，１０Ｍ）　、１）Ｈ６，８に、０． ９７５ｍ１の最終容積まで加えた。酵素（試料中に存在する場合）を４０°Ｃて ５分間活性化させた後に、ジメチル　スルホキシド中のＮ−α−ベンゾイル−Ｄ Ｌ−アルギニンｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）（ｆ　ＯＯｍＭ）２５μｌの 添加により、反応を開始させた。インキュベーションを４０°Ｃて１０分間続け 、次いて水性塩化酢酸ナトリウム（０，１０Ｍ）　／酢酸ナトリウム（０，２０ Ｍ）緩衝液１ｍｌの添加により、反応を停止させた。放出された４−ニトロアニ リンを、ΔＡ、　４１　Ｇの測定によって決定した。これらの条件の下で、活性 １単位は、４−ニトロアニリン１ピコモル／秒（ｅ　＝　８８００　Ｍ−’ｃｍ −’）の放出に相当する。

これらの検定条件は、Ｂｕｔｔｌｅおよび５ａｒｒｅｔｔにより記載され（上記 刊行物、１９８４）、例２１．２３および２６に記載の初期実験で使用されてい る条件に正確に相当する。

ＢＡＰＮＡ検定法Ｎｏ、１とＮ００２とを用いて得られたキモパパイン活性に係 る絶対値は相互に異なっており、方法Ｎｏ、２で得られる数値は方法Ｎｏ、ｌを 用いて得られる数値よりも約２〜３倍高い。

Ｃ）ヨード酢酸を用いる活性部位滴定 ヨード酢酸を用いるキモパパインの活性部位滴定は、Ｚｕｃｋｅｒ等によりＢｉ ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８２８、（＋９８５）、１９６〜 ２０４頁に記載されているＥ−６４を用いる活性部位滴定と同様の方法で行なっ た。キモパパイン溶液を上記ａ）に記載されているとおりに、緩衝液ｌ中に稀釈 し、タンパク質６０μＭ　（Ａ２．、　、　１％＝　１８．３、Ｒｏｂｉｏｓｏ ｎの上記刊行物（１９７５）から計算して、ε２ｔｏ　＝４．３２８４　ｘ　ｌ 　Ｏ’　Ｍ−’ｃｍ−’およびまたＪａｃｑｕｅｔ　らのアミノ酸配列（Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｈｏｐｐｅｒ−３ｅｙｌｅｒ、３７０．４２５〜４３４頁、 １９８９年５月）から計算してＭＷ＝２３６５６）を含有する溶液を生成させた 。

このキモパパイン溶液の各２０μｌを滴定管に入れ、緩衝液１　２０μｍ　（対 照では４０μｍ）とともに、３７℃で５分間インキュベートした。各滴定管に、 ヨード酢酸水溶液（それぞれ、１０．２０．３０．４０．５０および６０ＭＭ） ２０μｌを加え、この混合物を３７°Ｃで１０〜２０分間、予備インキュベート した。上記ａ）に記載のＢＡＰＮＡ基質溶液基質溶液４アｌに予め加熱して加え ることによって、反応を開始させた。インキュベーションを３７℃で続け、３０ 分後に、上記ａ）に記載のとおりにして反応を停止し、次いで放出された４−ニ トロアニリンをΔＡ４１６によって測定した。このようにして得られた活性キモ パパインのモル濃度を４．３２８４　Ｘｌ　０　’　Ｍ−’ｃｍ−’のキモパパ インに関するモル吸光係数にもとづいて、タンパク質モル濃度と比較した。活性 タンパク質の量は次いて、総タンパク質に対するパーセンテージとして表わした 。

ｄ）アブカゼインに対する活性 アゾカゼインに対する活性は、Ｒｏｗａｎ等によりＡｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２６７．２６２〜２７０頁（１９８８） に以前に開示された方法により、ｌμＭより少ない酵素（分子量２４，０００に もとづく）および所望により、ニワトリ　シスタチンＩμＭを用いて測定した。

酵素およびインヒビターの濃度はいづれも、活性分子の濃度を表わす。

単純放射免疫拡散法による免疫学的検定単純放射免疫拡散法は、以下に示すＭａ ｎｃｉｎｉ等の方法（［ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　２．２３５〜２５４頁、１９６５ ）にもとライティる。ＮａＣ１（０，１４Ｍ）を含有する水性リン酸ナトリウム （１０ｍＭ）　、ｐＨ７，３中に入れた、単一特異性ＩｇＧ製剤製剤子育アガロ ース　ｗ／ｖ　）をＧｅｌ　Ｂｏｎｄ■（Ｆ　Ｍ　ＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 　Ｍａｉｎｅ　、米国）上に注ぎ入れ、１、５　ｃｍ離して四角形の凹部（ｒ　 ＝　ｌ　ｍｍ）に切り取った。

対照試料および未知試料をこれらの凹部の中で無作為に分布させ、周縁現象によ る誤りを最小にした。これらの凹部に抗原を加えた後に、プレートを２４時間放 置し、沈殿環を発現させた。これらを次いて、洗浄し、乾燥させ、次いて放置し た。標準曲線を作成するためには、純粋で、温和なカルボキシメチル化抗原を使 用した。この曲線は抗原封環直径の二乗として作成した。有効検定範囲は抗原２ ５〜３００　ｎｇ／凹部であった。

ＰＰ　ＩＶおよびＰＰ　ＩＶに対する抗体の調製ａ）アフィニティ　カラムの調 製 ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）中のα−ＮＨ２ＣＨ２ＣＮ・ＨＣｌ　（２０ ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（２０ミリモル）の攪拌した混合 物に、ブチルオキシカルボニル−Ｌ　−Ｐｈｅ−１１−二トロフェニル　エステ ル（ＩＯミリモル）を加えた。この混合物を２０”Ｃて２時間攪拌し、次いて酢 酸エチル（１００ｍｌ）で稀釈し、水（２回）、水性トリエチルアミン（５回） 、水（３回）、水性重硫酸カリウム（２回）、水（３回）で洗浄し、乾燥させ、 次いで蒸発させた。残留物を酢酸エチル／ヘキサンから結晶化させ、Ｂｏｃ　− Ｌ−Ｐｈｅ　−ＮＨＣＨ２ＣＮ　、融点：１３４．５〜１３５°Ｃを得た。

ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のＢｏｃ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−ＮＨＣＨ２ＣＮの 溶液（５ミリモル）に、氷冷水性三フッ化酢酸（１０ｍｌ）を加えた。この反応 混合物を２０”Ｃで３０分間インキュベートし、次いで４０”Ｃで蒸発させるこ とにより、溶媒を除去した。この残留物をクロロホルムに溶解し、蒸発させ、次 いでこの処理を２回以上繰返した。

生成した粗製三フッ化酢酸をジメチルホルムアミド（ｌ　Ｏｍｌ）中のジイソプ ロピルエチルアミン（７，５ミリモル）の溶液中に溶解し、次いでＨｏｅ　−Ｇ ｌｙ　−ｐ−二トロフェニル　エステル（６，２５ミリモル）およびＮ−ヒドロ キシベンゾトリアゾールｌ水和物（６，２５ミリモル）を加えた。次いて、ｐ− ニトロフェノールを発生させる（金色）に充分なジイソプロピルエチルアミンを 滴下して加え、この混合物を室温で２時間攪拌した。Ｎ。

Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（１，５ｍｌ）を加え、１５分後に、酢酸エチル （６０ｍｌ）を加え、この混合物を水、水性トリエチルアミン、水、水性重硫酸 ナトリウム、水で洗浄し、乾燥させ、次いで蒸発させた。この残留物をシリカ上 でクロマトグラフィ処理し、酢酸エチル／ヘキサン（２０／１）で溶出し、Ｂｏ ｃ　−Ｇｌｙ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−ＮＨＣＨ２ＣＮを泡状物の形態で生成した。

Ｂｏｃ　−Ｇｌｙ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−ＮＨＣＨ２ＣＮ　（３０ｍｇ）を三フッ化 酢酸ニジクロロメタン：アニソール（２５：６５：１Ｏ１１ｍｌ）中に溶解し、 ０°Ｃて３０分間インキュベートした。この混合物を、３４°Ｃで回転蒸発器に より乾燥させ、この残留物を次いでメタノール（１゜５　ｍｌ）および水性Ｎａ ＨＣＯｓ　（０，１Ｍ、　ｐＨ８，０，１，５ｍ１）中に溶解し、リガンド溶液 を得た。

活性化ＣＨ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｏ４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　３　ｇ 乾燥重量）を塩酸水溶液（１ｍＭ、７５ｍ１）中で４°Ｃにおいて一夜にわたり 水和させ、次いで塩酸（１ｍＭ、６００ｍ１）で、引続いて水性ＮａＨＣＯｉ　 （０，１Ｍ、　ｐＨ８，０，３００ｍｌ）により洗浄した。このゲルを水性Ｎａ ＨＣＯｓ　（０，１Ｍ、　ｐＨ８゜０．３０ｍ１）中に懸濁し、リガンド溶液（ 上記）を加え、この混合物を２０°Ｃで一夜にわたり、おだやかに攪拌した。こ のゲルを焼結ガラス　フィルター上に採取し、水性メタノール（５０％　ｖ／ｖ 　、１８０ｍ１）で、次いで水（１８０ｍｌ）で洗浄し、次いで塩酸でｐＨ９， ０に調整した水性エタノールアミン（０，１Ｍ、３０ｍ１）中に懸濁した。

この懸濁液を２０°Ｃて４時間振りまぜ、次いてゲル状物を採取し、水（５００ ｍｌ）で洗浄し、「施用」緩衝液１（リン酸ナトリウム（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ 　（ＩｍＭ）、エタンジオール（３３％）、ｐＨ６，８）中で４°Ｃにおいて保 存した。

ｂ）ＰＰＩＶの精製 ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　”　−Ａｈｘ　−Ｇｌｙ　−Ｌ−Ｐｈｅ−ＮＨＣＨ２ＣＮ のカラム（床容積４　ｍｌ）を「溶出用」緩衝液〔クエン酸ナトリウム（５０ｍ Ｍ）、エタンジオール（３３％）　、ｐＨ４，５，１２ｍ１）で洗浄し、次いで 「施用」緩衝液（上記参照、１２ｍ１）で洗浄した。

噴霧乾燥ババイア　ラテックス（０，５ｇ）を施用緩衝液（１０ｍｌ）中に溶解 し、次いで濾過した（０．２２μｍ孔）。この濾液のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ −Ｒａｄ染料−結合検定法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国 ）を用いて測定した。この混合物に、ジチオールスレイトールを２ｍＭの最終濃 度にまで加え、この混合物を０°Ｃで２０分間、インキュベートした。ラテック ス　タンパク質８０ｍｇを２０℃でカラムに適用しく３８ｍ１／時／ｃｍ”　） 　、引続いて施用緩衝液（８ｍｌ）を、次いで溶出用緩衝液（８ｍｌ）を適用し た。ヒドロキシエチルジスルフィド（５０ｍＭ）を含有する溶出用緩衝液（４ｍ ｌ）を次いで適用し、流れを止め、カラムを２０°Ｃで一夜にわたり放置した。

溶出用緩衝液を含有するヒドロキシエチルジスルフィドによる溶出を再開しく１ ０ｍ１）、溶出フラクヨン（１ｍＭ）を採取した。ＢＡＰＮＡに対して活性を示 すフラクションを集め、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有する水性酢酸ナトリウム／酢 酸（５０ｍＭ）で予め平衡したＭｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ５１５”（カチオン交換）カ ラムに直接に適用し、次いてこの力までの勾配（２１，５ｍＭ　Ｎａ”　／ｍｌ ）で適用しくｂｕｔｔｌｅお（１ｍｌ）を採取した。２つの主要タンパク質ピー クが溶出された。約０．１７ＭＮａ＋で溶出する第一のピークはパパインに相当 し、そして約０．３８ＭＮａ“で溶出する第二のピークはＰＰＩＶに相当す°る 。このＰＰ　ＩＶピーク　フラふジョンを集め、水性ＥＤＴＡ（１ｍＭ）に対し て透析し、凍結乾燥させ、次いで一２０°Ｃて保存した。

純粋なＰＰＩＶはＢＡＰＮＡに対して検出可能な活性を育していないが、ｌμＭ の濃度のニワトリ　シスタチンにより阻害されない、アゾカゼイン−消化活性を 伴う。

ｃ）ＰＰＩＶ特異性抗体の調製 使用前に、純粋なＰＰ　ＩＶ抗原を、Ｚｕｃｋｅｒ等によりＢｉｏｃｈｉｍ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　８２８．１９６〜２０４頁（１９８５）に記載 された方法により、温和にカルボキシメチル化させた。このＰＰＩＶに対する抗 血清を次いで、ウサギに発生させた。この発生は、フロイントの完全アジュバン ト中のこのカルボキシメチル化タンパク質３６０μｇを筋肉内注射し、２週間後 に、完全アジュバント中の１００μｇを皮下注射することによって行なう。

ＴｇＧは、Ｈｅ１ｄｅおよびＳｃｈｗｉｃｋによってＨａｎｄ　ｂｏｏｋ　ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｗｅｉｒ　、Ｄ、Ｍ、編 ）１１巻１７、１〜７．　ｌ　ｌ　、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　、　０ｘｆｏｒｄ に記載されているとおりに硫酸アンモニウム分別によって、引続いてＮａＣ１（ ０，１４Ｍ）含有水性リン酸ナトリウム（１０ｍＭ）　、ｐＨ７，３中に透析す ることによって、抗血清から部分的に精製した。

このＰＰＩＶ特異性ＩｇＧ調製物を使用し、前記の単純放射免疫拡散法によって 、ＰＰ　ＩＶを検定した。

以下の例は、例によって本発明の態様をさらに充分に説明するだけのものであり 、本発明の範囲をいかなる点でも制限するものと考えられるべきではない。

イルーＤＬ−アルギニン、ｐ−ニトロアニリド；　Ｂｏｃ　。

ブチルオキシカルボニル；ＣＢＺ、カルボベンゾキシ：Ｃｈａ　、シクロへキシ ルアラニン、ＤＭＦ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｅ−６４、Ｌ−３−カル ボキシ−２゜３−トランス−エポキシ−プロビオニルロイシルアミド−（４−グ アニジノ）ブタン；ＥＤＣ，Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミド塩酸塩；　ＥＤＴＡエチレンジアミンテトラ酢酸（ジナトリ ウム塩）；Ｇｌｙ、グリシン；Ｌｅｕ、ロイシン；ＭＯ、メトキシイミン、ＯＢ Ｚ、オキシベンジル：Ｏｘ１オキシム；　Ｐｈｅ　、フェニルアラニン；Ｓｃ１ セミカルバゾーン、ＴＨＦ、テトラヒドロフラン：およびＴｙｒ　、チロシン。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ　、　Ｃｈｅｌｅｘ、　Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ、　ＣＨ−Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂ　、ＣｈｙｍｏｆａｓｔＳＤｉｓｋｅｎ　、ＥＣＨ−３ ｅｐｈａｒｏｓｅ　。

Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒ　、　ＦＰＬＣ，Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ、　Ｍｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ 、Ｓ　−３ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ　ＨＰ　、　Ｔｗｅｅｎ　５ＺｅｔａおよびＺａ ｔａｆｆｉｎｉｔｙはいづれも商品名である。

工程はいづれも、別設の記載がないかぎり、室温で行なった。

例　ｌ Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル　セミカルバゾン段階ａ Ａ）０．Ｎ−ジメチルヒドロキシルアミンＨＣＩ　（ｔｏ、２３ｇ）を乾燥Ｎ、 Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１００ｍｌ）へ室温でかきまぜながら加 えた。温度を３０°Ｃ以下に保ちながら、Ｎ−メチルモルホリン（１０，６ｇ） を５分間にわたり加えた。白色沈殿が生じ、混合物をＯ′Ｃに冷却した。

Ｂ）　Ｎ−ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　（２６，５ｇ）を乾燥テトラヒドロ フラン（ＴＨＦ）（２００ｍｌ）に溶かし、−１０°Ｃに冷却した。この溶液に 、温度を一１０″Ｃに保ちつつイソブチルクロロホルメート（１４，３８ｇ）を ５分間にわたり加えた。温度を−ｌＯ℃に保ちなからＮ−メチルモルホリン（１ ０，６ｇ）を１０分間にわたり加え、かきまぜを更に１０分間続けた。

Ｃ）懸濁液Ａを懸濁液Ｂへ一１０°Ｃで１５分間にわたり加えた。混合物を室温 まで温め、次に３時間かきまぜた。

次に、生じた混合物を０℃に冷却し、３−ジメチルアミノプロピルアミン（１０ ，２ｇ）を５分間にわたり加えた。

水（２００ｍｌ）および酢酸エチル（２００ｍｌ）を加え、有機上層を分離し、 （イ）水（２００ｍｌ）、（ロ）Ｋ）ＩＣＯ２水溶液（５％、２００ｍ１）、（ ハ）　ｆ（ＣＩ水溶液（０，５Ｎ、２００ｍ１−）　、および（ニ）水（３Ｘ２ ００ｍｌ）で順次洗浄した。温度を３０°Ｃ以下に保ちながら真空下で回転蒸発 により溶媒を除き、Ｎ−ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒ ドロキサメートを得た。

段階ｂ Ｎ　−ｔ　−Ｂｏａ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメート（ ２，９ｇ）とトリフルオロ酢酸（８ｍｌ）とを−緒に室温で４時間かきまぜた。

次に、温度を３０°Ｃ以下に保ちながら、真空下で回転蒸発により過剰のトリフ ルオロ酢酸を除去した。その残留物へ　ジエチルエーテル（３０ｍｌ）を加えて 溶液とし、次にエーテルを真空下で除いた。このエーテル処理を結晶化が起るま で繰り返した。固体を濾集し、エーテルで洗浄し、次にＰ２Ｏ３上で真空乾燥し てＬ−Ｐｈｅ−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸塩を得た 。

段階Ｃ Ａ）　Ｌ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸 塩（７，１５ｇ）を室温でかきまぜながら乾燥ＤＭＦ　（３０ｍ１）に溶かした 。温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ、Ｎ−メチルモルホリン（２，３５ｇ）を５分 間にわたり加え、得られた混合物をＯ″Ｃに冷却した。

Ｂ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　（４，９６ｇ）を乾燥ＴＨＦ（５５ｍｌ）にか きまぜながら溶かし、混合物を一１０°Ｃに冷却した。イソブチルクロロホルメ ート（３，０５ｇ）を−１０℃で５分間にわたり加え、Ｎ−メチルモルホリン（ ２，３５ｇ）を１０分間にわたり加え、反応混合物を一１０°Ｃで更に１０分間 かきまぜた。

Ｃ）溶液Ａを溶液Ｂへ一１０’Ｃで１５分間にわたり加え、次に混合物の温度を 室温まで上昇させ、かきまぜを３時間続けた。混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジ メチルアミノプロピルアミン（２，２７’ｇ）を５分間にわたり加え、かきまぜ を更に５分間続けた。次に水（５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）を加え、上 層の有機相を分離し、（イ）水（５０ｍｌ）および飽和ＮａＣ１水溶液（５ｍｌ ）、（ロ）ＫＨＣＯ＊水溶液（５％、５０ｍ１）　（ハ）　ＨＣＩ水溶液（０， ５Ｎ、５０ｍ１）および（ニ）水（３Ｘ５０ｍｌ）で順次洗浄した。温度を３０ °Ｃ以下に保ちつつ、真空下で回転蒸発により溶媒を除いた。新たに酢酸エチル （５０ｍｌ）を加え、次に蒸発により除いてＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｐ ｈｅ　−０、Ｎ−ジメチルヒドロキサメートを得た。

段階ｄ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメー１ −（２７，８ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（２８０ｍ１）　ニ溶かし、Ｎ２下で一７０℃ に冷却した。ＴＨＦ中水素化ジイソブチルアルミニウム（ＩＭ、　３７２ｍ１） をＮ２下−７０’Ｃで６０分間にわたり加え、かきまぜを−７０″Ｃで更に６０ 分続けた。Ｎ２下０℃でかきまぜなから、飽和ＮａＣｌ水溶液（４（Ｎ）ｍｌ） およびロッシェル塩溶液（６００ｍｌ）中に加えて反応を失活させ、次に混合物 を室温まで温めた。酢酸エチル（６００ｍｌ）を加え、混合物を濾過し、水層を 分離し、酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を水（６００ｍ ｌ）／飽和ＮａＣ１水溶液（４００ｍｌ）　（Ｘ　３　）で洗浄した。温度を３ ０°Ｃ以下に保ちつつ溶媒を真空下で回転蒸発により除いた。残留物をトルエン から再結晶し、固体をＰ２Ｏ，上で真空乾燥してＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ −Ｐｈｅ−アルデヒドを得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｐｈｅ−アルデヒド（３ｇ）を工業用メ タノール添加酒精（２０ｍｌ）に溶かした。溶液を５０℃に加熱し、濾過して不 溶物を除去した。

Ｂ）セミカルバジドＭＣＩ　（１，３ｇ）の水（１０ｍ１）溶液を水（ｌ　Ｏｍ ｌ）中ＫＨＣＯ＊　（１，１ｇ）の溶液へ加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加え、得られた混合物を５０°Ｃで２時間かきまぜた。酢 酸エチル（５０ｍｌ）と水（１００ｍｌ）を加え、水層を分離し、酢酸エチルで 抽出しく２×２０ｍ１）、合わせた有機相を（イ）　ＫＨＣＯａ水溶液（５％。

５０ｍ１）、（ロ）ＭＣＩ水溶液（０，５Ｎ、５０ｍ１）および（ハ）水／飽和 ＮａＣ１水溶液（５０ｍｌ　／２．０ｍ１ｘ　３）で順次洗浄した。温度を３０ °Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除去してＣＢＺ　−Ｌ　−Ａ ｌａ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　５ｃＣＢＺ　−Ｌ−Ａｌａ　−Ｌ−Ｐｈｅ　Ｓｃ　（６ ８０ｍｇ）をメタノール（９０ｍｌ）に溶かし、不溶物を濾別した。ＣＢＺ−Ｌ −Ａｌａ　−Ｌ−Ｐｈｅ　Ｓｃメタノール溶液を入れた装置をＮ２で掃気し、触 媒（炭木上ＩＯ％パラジウム）（１００ｍｇ）を加えた。閉じた系へＮ２を７５ 分間通した。触媒を濾別し、温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発に よりメタノールを除いた。放置すると残留物は結晶化した。この固体をＰ２Ｏ， 上で真空乾燥してＬ−アラニル−し−フェニルアラニル　セミカルバゾン（Ｌ　 −Ａｌａ　−Ｌ−ＰｈｅＳｃ）を得た。

例２ 例１の段階ａおよびｂに従いＬ−Ｐｈｅ−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートの トリフルオロ酢酸塩をつくった。

段階Ｃ Ａ）　Ｌ−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸塩 （１，９３２ｇ）を乾燥ＤＭＦ（８ｍｌ）に室温てかきまぜながら溶かした。温 度を３０°Ｃ以下に保ちなからＮ−メチルモルホリン（０，６０６ｇ）を５分間 にわたり加え、得られた混合物を０℃に冷却した。

Ｂ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ（１，７９４ｇ）を乾燥ＴＨＦ（１５ｍｌ）中に かきまぜながら溶かし、混合物を一１Ｏ°Ｃに冷却した。イソブチルクロロホル メート（０，８２２ｇ）を−１０°Ｃで５分間にわたり加え、Ｎ−メチルモルホ リン（０，６０６ｇ）を１０分間にわたり加え、反応混合物を一１０℃で更に１ ０分間かきまぜた。

Ｃ）溶液Ａを溶液Ｂに一１Ｏ°Ｃで１５分間にわたり加え、次に混合物の温度を 室温まで上昇させ、かきまぜを３時間続けた。混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジ メチルアミノプロピルアミン（０，６１２ｇ）を５分間にわたり加え、かきまぜ を更に５分続けた。次に水（２０ｍｌ）と酢酸エチル（３０ｍｌ）を加え、有機 相を分離し、（イ）　ＫＨＣＯ。

水溶液（５％、２０ｍ１）、（ロ）ＨＣＩ水溶液（０，５Ｎ。

２０ｍ１）および（ハ）水（２Ｘ３０ｍｌ）で順次洗浄した。

温度を３５°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除き、残留物をイ ソプロピルアルコールから再結晶してＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ−Ｐｈｅ　 −０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートを得た。

段階ｄ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメー ト（４，８９ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（４０ｍ１）に溶かした。乾いたフラスコに水 素化アルミニウムリチウム（０，４９３ｇ）を入れ、乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）を Ｎ２下で加え、室温で１０分かきまぜた後−５０°Ｃに冷却した。

次に乾燥ＴＨＦＨＦ中口ドロキサメート液をＮ、下−５０°Ｃで１０分間にわた り加え、かきまぜを０〜５°Ｃで更に２０分続けた。

反応混合物を一５０°Ｃに冷却し、飽和ロッシェル塩溶液（６０ｍｌ）をＮ２下 で加えた。混合物を室温まで温め、濃ＨＣＩ（ｌ　Ｏｍｌ）を加えて水相をｐＨ ３とし、不溶物を濾別した。酢酸エチルを加え、有機相を分離し、（イ）水（５ ０ｍｌ）、（口）　ＫＨＣＯｓ水溶液（５％、５０ｍ１）、（ハ）　ＨＣＩ水溶 液（０，５Ｎ、５０ｍ１）および（ニ）水（３Ｘ５０ｍｌ）で順次洗浄した。次 に温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により酢酸エチルを除いた。

残留物を一晩放置し、Ｐ、０．上で真空乾燥し、最後にトルエンから結晶化させ ることによりＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅアルデヒドを得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ−Ｐｈｅアルデヒド（０，６４５ｇ）を工 業用メタノール添加層？ｉｌ（１０ｍｌ）に７０″Ｃで溶かした。

Ｂ）酢酸ナトリウム三水和物（０，２２４ｇ）をセミカルバジドＦ（ＣＩ（０， １８３ｇ　）の水（３ｍｌ）溶液に加え、工業用メタノール添加層１（２ｍｌ） を加え、混合物を６０℃に温めた。

Ｃ）溶液Ａを溶液Ｂに加え、Ａを含むフラスコを更に工業用メタノール添加酒精 （３ｍｌ）で洗浄し、この洗液を混合物に加え、これを６０〜７０℃で３０分か きまぜた。

混合物をゆっくり１時間放冷し、氷上に更に１時間放置し、最後に４℃で一晩放 置した。固体を濾葉し、工業用メタノール添加酒精：水（４：１．３　ｍｌ）で 洗浄し、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥してＣＢＺ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｓ ｃを得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｓｃ　（２，１ｇ）をメタノール（ ３１５ｍｌ）に３０°Ｃで溶かし、不溶物を濾別した。セミカルバゾンのメタノ ール溶液を入れた装置をＮ２で掃気し、触媒（炭末上１０％パラジウム）（０， ３５ｇ）を加え、閉じた系中にＮ２を３０分通した。触媒を濾別し、温度を３０ °Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除いた。残留物をＰ、０．上 で真空乾燥しＬ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニルセミカルバゾン（Ｌ −Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｓｃ）を得た。

例　３ Ｌ−フェニルアラニル−し−フェニルアラニルメトキシＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ 　−Ｌ−Ｐｈｅアルデヒドを例２の段階ａ〜ｄ記載のようにしてつくった。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｌ−Ｐｈｅアルデヒド（０，６４５ｇ）を工業 用メタノール添加酒精（３５ｍｌ）に６０〜６５℃で溶かし、不溶物を濾別した 。

Ｂ）酢酸ナトリウム三水和物（０，２２４ｇ）をメトキシルアミンｆ（ＣＩ　（ ０，１３８ｇ’）の水（２５ｍｌ）溶液に６０°Ｃで加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加え、Ｂを含むフラスコを６０℃の水（１０ｍｌ）で洗い 、洗液を混合物と合わせ、６０゜で１／２時間加熱し、次に室温で２時間放冷し た。固体を濾葉し、工業用メタノール添加酒精：水（ｌ：１．６ｍ１）で洗浄し 、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥してＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ−Ｌ　−Ｐｈｅ−メトキシ イミンを得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｌ−Ｐｈｅ−メトキシイミン（５５０ｍｇ）をメタノ ール（３００ｍｌ）に溶かし、不溶物を濾別した。このメタノール性メトキシイ ミンを含む装置をＮ！で掃気し、次に触媒（炭木上１０％パラジウム’）　（１ ００ｍｌ）を加えた。封じた容器にＮ７を通し、４　ｌ／２時間必要に応じ再導 入した。触媒を濾別し、温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により 溶媒を除去しＬ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−メトキシイミン（ Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｍｏ）を得た。

例　４ Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラニルセミカルＡ）Ｏ，Ｎ−ジメチルヒ ドロキシルアミンＨＣＩ（３，８９１ｇ）を乾燥ＤＭＦ　（４０ｍ１）に室温で 懸濁させた。温度を３０℃以下に保ちなからＮ−メチルモルホリン（４，０３２ ｇ）を５分間にわたり加え、次に混合物をかきまぜながら０℃まで冷却した。

Ｂ）　Ｎ　−ｔ−ＢｏＣ−Ｄ−Ｐｈｅ　（１０，０８ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（８０ ｍ１）に溶かし、−１０℃に冷却した。温度を一１０℃に保ちつつこの溶液にイ ソブチルクロロホルメート（５，４７ｇ）を５分間にわたり加えた。温度を一１ ０℃に保ちつつＮ−メチルモルホリン（４，０３２ｇ）を１０分間にわたり加え 、かきまぜを更に１０分間続けた。

Ｃ）懸濁液Ａを懸濁液Ｂに一１Ｏ°Ｃで１５分間にわたり加え、混合物を室温ま で温め、３時間かきまぜた。次に、混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジメチルアミ ノプロピルアミン（３，８８ｇ）を５分間にわたり加え、かきまぜを更に５分間 続けた。水（６０ｍｌ）と酢酸エチル（６０ｍｌ）を加え、有機層を分離し、（ イ）水（６０ｍｌ）、（ロ）ＫＨＣＯｆｆ水溶液（５％、６０ｍ１）、（／’） 　ＨＣＩ水溶液（０，５Ｍ、６０ｍ１）および（ニ）水（３Ｘ６０ｍｌ）で順次 洗浄した。温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除き、 Ｎ　−ｔ−ＢｏＣ−Ｄ　−Ｐｈｅ　−０゜Ｎ−ジメチルヒドロキサメートを得た 。

段階ｂ Ｎ　−ｔ　−Ｒｏｅ　−Ｄ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメート（ １１，３ｇ）を氷で冷却し、トリフルオロ酢酸（３０ｍｌ）を加え、混合物を室 温で３時間かきまぜた。

温度を３０°Ｃ以下に保って真空下で回転蒸発により過剰のトリフルオロ酢酸を 除き、残留物へ　ジエチルエーテル（１００＋ｎｌ）を加えて溶液とする。溶媒 を真空下で除き、結晶化が起こるまでこの方法を繰り返した。固体を濾葉し、ジ エチルエーテルで洗浄し、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥してＤ−Ｐｈｅ−０，Ｎ−ジメ チルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸塩を得た。

段階Ｃ Ａ）　Ｄ−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸塩 ＮＯ，１ｇ）を乾燥ＤＭＦ　（４１ｍ１）中に室温てかきまぜながら溶かした。

温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ５分間にわたりＮ−メチルモルホリン（３，ｘ５ ５ｇ）を加え、得られた混合物を０°Ｃに冷却した。

Ｂ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　（９，４ｇ）を乾燥ＴＨＦ（８０ｍｌ）にかき まぜながら溶かし、混合物を一１０°Ｃに冷却した。

イソブチルクロロホルメート（４，３０７ｇ）を−１Ｏ°Ｃで５分間にわたり加 え、Ｎ−メチルモルホリン（３，１５５ｇ）を１０分間にわたり加え、反応混合 物を一１Ｏ°Ｃて更に１０分間かきまぜた。

Ｃ）溶液Ａを溶液已に一１０°Ｃで１５分間にわたり加え、次に混合物の温度を 室温まで上昇させ、かきまぜを３時間続けた。混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジ メチルアミノプロピルアミン（３，２０ｇ）を５分間にわたり加え、かきまぜを 更に５分間続けた。次に水（６０ｍｌ）と酢酸エチル（６０ｍｌ）を加え、有機 相を分離し、（イ）水（６０ｍｌ）および飽和ＮａＣ１水溶液（６０ｍｌ）、（ ロ）ＫＨＣＯ３水溶液（５％、６０ｍ１）、（／’）　ＨＣＩ水溶液（０，５Ｎ 、６０ｍ１）および（ニ）水（３ｘ６０ｍｌ）で順次洗浄した。温度を３０°Ｃ 以下に保って真空下で回転蒸発により溶媒を除いた。新しい酢酸エチルを加え、 次に蒸発により除いた。残留物をイソプロパツールから再結晶することによりＣ ＢＺ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｄ−Ｐｈｅ　−０，Ｎ　−ジメチルヒドロキサメートを 得た。

段階ｄ ジクロロメタン中水素化ジイソブチルアルミニウム（ＩＭ、１０ｍ１）をＮ２掃 気したフラスコに加えた。すべてのジクロロメタンが蒸発してしまうまでフラス コを５０°Ｃに加温し、系を再びＮ２で掃気した。乾燥ＴＨＦ（ｌ　Ｏｍｌ）を 加え、混合物を一７０℃に冷却した。ＣＢＺ−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｄ　−Ｐｈｅ　− ０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメート　（０，９７８ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（１０ｍ １）に溶かし、水素化ジイソブチルアルミニウム溶液へ一７０°Ｃて１０分間に わたり加え、かきまぜを−７０℃で更に１０分間続けた。反応混合物をメタノー ル（３０ｍｌ）および飽和ロッシェル塩溶液（３０ｍｌ）中−６０°Ｃで失活さ せ、混合物を室温まで温めた。水（５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）を加え 、有機相を分離し、水相を酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相 を水（２Ｘ２００ｍｌ）洗し、濾過した。有機相を分離し、温度を３０°Ｃ以下 に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除いた。新しい酢酸エチルを加え、次 に除去してＣＢＺ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｄ　−Ｐｈｅアルデヒドを得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｄ−Ｐｈｅアルデヒド（４００ｍｇ）を工業 用メタノール添加酒精（ＩＯｍｌ）に６０°Ｃて溶かした。

Ｂ）　６０℃の水（３ｍｌ）中酢酸ナトリウム三水和物（０，２９８ｇ）をセミ カルバジドＨＣＩ　（０，２４４ｇ＞の６０℃におけろ水（３ｍｌ）溶液に加え た。

Ｃ）溶液Ａ、Ｂを合わせ、得られた混合物を６０°Ｃで５時間かきまぜた後４° Ｃで一晩放置した。固体を濾葉し、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥してＣＢＺ　−Ｌ　− Ｐｈｅ　−Ｄ−Ｐｈｅ　Ｓｃを得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ−Ｐｈｅ　−Ｄ−Ｐｈｅ　５ｃ（６００ｍｇ）をメタノール（９０ ｍｌ）に溶かし、不溶物を濾別した。メタノール性セミカルバゾン溶液を入れた 装置をＮ２で掃気し、触媒（炭末上ｌＯ％パラジウム）（１００ｍｇ）を加えた 。閉じた容器にＮ２を２時間通じた。触媒を濾別し、温度を３０°Ｃ以下に保ち つつ真空下で回転蒸発によりメタノールを除き、Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フ ェニルアラニル　セミカルバゾン（Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｄ−Ｐｈｅ　Ｓｃ）を得た 。

例２の段階　ａ　−ｄ記載のようにしてＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ−Ｌ　−Ｐｈｅ アルデヒドをつくった。

Ａ）上記のようにしてつくられたＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅアル デヒド（０，６４５ｇ）を工業用メタノール添加酒精（３５ｍｌ）に６０〜６５ °Ｃで溶かし、溶液を濾過して不溶物を除いた。

Ｂ）酢酸ナトリウム三水和物（０，２２４ｇ）を６０°Ｃの水（２５ｍｌ）中ヒ ドロキシルアミン！（Ｃ１（０，１１４ｇ）の溶液へ加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加え、Ｂを含むフラスコを水（ＩＯｍｌ）で洗浄し、洗液 を混合物へ加え、次にこれを６０〜６５°Ｃで３７４時間かきまぜてから４°Ｃ で２〜３時間冷却した。固体を濾別し、工業用メタノール添加酒精／水（１：　 １．５　ｍｌ）で洗浄し、Ｐ！０．上で真空乾燥してＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　 −Ｌ−Ｐｈｅ　Ｏｘをシ」−一および四−異性体の混合物として得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｏｘ　（５００ｍ１）をメタノール （１３０ｍｌ）に溶かし、不溶物を濾別した。このメタノール性オキシムを入れ た装置をＮ２で掃気し、触媒（炭木上１０％パラジウム）（８３ｍｇ）を加えた 。この封じた容器に次にＮ２を３０分導入した。触媒を濾別し、温度を３０°Ｃ 以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除いた。高真空ポンプを用いて更 に溶媒を除去し、残留物をＰ２Ｏ，上で真空乾燥してＬ−フェニルアラニル−し −フェニルアラニルオキシム（Ｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｏｘ）を得た。

例　６ Ｌ−アラニル−Ｄ−フェニルアラニル　セミカルバゾン段階ａおよびｂ 例４の段階ａおよびｂに従いＤ−Ｐｈｅ−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートの トリフルオロ酢酸塩をつくった。

段階Ｃ Ａ）　Ｄ−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸塩 （５，ＯＯＯｇ）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶かした。温度を３０°Ｃ以下に 保ちつつＮ−メチルモルホリン（１，５７８ｇ）をゆっくり加え、得られた混合 物をＯ″Ｃに冷却した。

Ｂ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　（３，４６３ｇ）を乾燥ＴＨＦ（４０ｍｌ）に かきまぜながら溶かし、混合物を一１Ｏ℃に冷却した。イソブチルクロロホルメ ート（２，１５８ｇ）を５分間にわたり−ｌＯ°Ｃで加え、Ｎ−メチルモルホリ ン（１，５７８ｇ）を１０分間にわたり加え、反応混合物を一１０℃で更に１０ 分間かきまぜた。

Ｃ）二つの溶液ＡとＢを一１０°Ｃで１０分間にわたって混合し、次に混合物の 温度を室温まで上昇させ、かきまぜを３時間続けた。混合物を０°Ｃに冷却し、 ３−ジメチルアミノプロピルアミン（１，５８５ｇ）を加え、水（５０ｍｌ）で 反応を失活させた。酢酸エチル゛（５０ｍｌ）を加え、有機相を分離し、水層を 酢酸エチル（２Ｘ３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、（イ）水（５０ｍｌ ）および飽和ＮａＣＩ水溶液（１０ｍｌ）、（ｏ　）　ＫＨＣＯ３水溶液（５％ 、５０ｍ１）、（ハ）ＨＣ１水溶液（０，５Ｎ、５０ｍ１）および（ニ）水（３ Ｘ５０ｍｌ）で順次洗浄した。温度を３０°Ｃ以下に保って真空下で回転蒸発に より溶媒を除いた。固体を酢酸エチルから再結晶してＣＢＺ−Ｌ−Ａｌａ　−Ｄ −Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートをＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　− Ｄ−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメート（２，９ｇ）を乾燥ＴＨＦ（ ２５ｍｌ）に溶かした。溶液を窒素下で一７０°Ｃに冷却した。ＴＨＦ中水素化 ジイソブチルアルミニウム（ＩＭ、３７１）を−７０℃で１０分間にわたり加え 、かきまぜを更に１０分間続けた。

Ｎ２掃気の下て一３０°Ｃにおいてかきまぜながら飽和ロッシェル塩溶液（１２ ５ｍｌ）およびＴＨＦ　（１２５ｍ１）中に加えて反応を失活させ、次に混合物 を室温まで温めた。酢酸エチル（ｌｏＯｍｌ）を加え、有機相を分離した。

水層を酢酸エチル（２ｘ３０ｍｌ）で抽出し、有機層を合わせて水（３Ｘ　１０ ０ｍ１）洗した。反応混合物を濾過し、温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で 回転蒸発により溶媒を除いた。新しい酢酸エチルを加え、次に除去してＣＢＺ　 −Ｌ　−Ａｌａ　−Ｄ−Ｐｈｅアルデヒドを得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−Ｌ−Ａｌａ　−Ｄ−Ｐｈｅアルデヒド（１，２ｇ）をＴＨＦ（ ２０ｍｌ）および工業用メタノール添加酒精（２０ｍｌ）に溶かし、５０°Ｃに 加熱した。

Ｂ）セミカルバジドＭＣＩ　（１，８ｇ）の熱水（１５ｍｌ）中の溶液を水（’ １５ｍ１）中ＫＨＣＯ３（１，５ｇ　）の熱溶液へ加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加え、得られた混合物を５０℃で４時間かきまぜた。温度 を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除去した。残留物へ水 （５０ｍｌ）を加え、固体を濾葉し、水：工業用メタノール添加酒精（１：　１ ）で洗浄し、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥することによりＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　− Ｄ−Ｐｈｅ　Ｓｃを得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｄ−Ｐｈｅ　Ｓｃ　（７５０ｍｇ）をメタノール（ ５０ｍｌ）に溶かし、不溶物を濾別した。このメタノール溶液を入れた装置をＮ ２で掃気し、触媒（炊米上１０％パラジウム）（ｌｏｏｍｇ）を加えた。閉じた 系中にＮ２を９０分通じた。触媒を濾別し、温度を３０℃以下に保ちつつ真空下 で回転蒸発により溶媒を除き、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥することによりＬ−アラニ ル−Ｄ−フェニルアラニルセミカルバゾン（Ｌ　−Ａｌａ　−Ｄ−Ｐｈｅ　Ｓｃ ）を得た。

例　７ Ｌ−チロシニルーし一フェニルアラニルセミカルバゾン段階ａおよびｂ 例４の段階ａおよびｂに従イＬ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメー トのトリフルオロ酢酸塩をつくった。

Ａ）　Ｌ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸 塩（７，９５ｇ）を乾燥ＤＭＦ　（３０ｍ１）中に室温でかきまぜながら溶かし た。温度を３０℃以下に保ちつつＮ−メチルモルホリン（２，４９ｇ）を５分間 にわたり加え、得られた混合物を０℃に冷却した。

Ｂ）　ＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ　−Ｔｙｒ　（１０ｇ）を乾燥ＤＭＦ（６０ｍｌ ）中にかきまぜながら溶かし、混合物を−ＩＯ℃に冷却した。イソブチルクロロ ホルメート（３，３９ｇ）を−１Ｏ℃で５分間にわたり加えた。Ｎ−ジメチルモ ルホリン（２，４９ｇ）を１０分間にわたり加え、反応混合物を−ｌＯ°Ｃで更 に１０分間かきまぜた。

Ｃ）溶液Ａを溶液Ｂに一１Ｏ°Ｃで１５分間にわたり加え、次に混合物の温度を 室温まで上昇させ、かきまぜを３時間続けた。混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジ メチルアミノプロピルアミン（２，５２ｇ）を５分間にわたり加えた。

次に水（５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）を加え、上層の有機相を分離し、 （イ）水（５０ｍｌ）、（ロ）ＫＨＣＯ。

水溶液（５％、５０ｍ１）、（ハ）　）ＩＣＩ水溶液（０，５Ｍ。

５０ｍ１）および（ニ）水（３Ｘ５０ｍｌ）で順次洗浄した。

温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除き、残留物をイ ソプロピルアルコールから再結晶しＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ−Ｔｙｒ　−Ｌ−Ｐ ｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートを得た。

段階ｄ ＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ　−ＴＹｒ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　−０，Ｎ−ジメチルヒド ロキサメー）（１，０１２ｇ）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かした。ＴＨＦ中 水素化ジイソブチルアルミニウム（Ｉ　Ｍ、　８．５ｍ１）を−７０℃において Ｎ２下に１０分間にわたり加え、かきまぜを更に１０分間続けた。Ｎ２下−６０ °Ｃにおいてかきまぜながらメタノール（２０ｍｌ）およびロッシェル塩溶液（ ３０ｍｌ）中に加えて反応を失活させ、次に混合物を室温まで温めた。水（５０ ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）とを加え、有機相を分離し、水（２００ｍｌ） 洗した。反応混合物を濾過し、温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発 により濾液から溶媒を除去した。次に新しい酢酸エチルを加え、回転蒸発により 除いた。得られた固体をＰ、０．上で真空乾燥しＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ　−Ｔ ｙｒ　Ｌ−Ｐｈｅアルデヒドを得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ　−Ｔｙｒ　−Ｌ−Ｐｈｅアルデヒド（４００ｍ ｇ）を工業用メタノール添加酒精（２０ｍｌ）とＴＨＦ　（ｌ　０ｍ１）に溶か し、６０°Ｃに加熱した。

Ｂ）水（５ｍｌ）中セミカルバジドＨＣＩ　（６００ｍｇ）の熱溶液を水（５ｍ ｌ）中ＫＨＣＯｉ　（５００ｍｇ）の熱溶液へ加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加え、得られた混合物を６０°Ｃて２時間かきまぜた。温 度を３０°Ｃ以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除き、残留物を水で 処理した。

固体を濾葉し、水および工業用メタノール添加酒精で洗浄し、Ｐ、Ｏ，上で真空 乾燥してＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ　Ｓｃを得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−０ＢＺ　−Ｌ　−Ｔｙｒ　−Ｌ−ｐｈｅ　Ｓｃ　（７７０ｍｇ）を乾 燥ＴＨＦ（７０ｍｌ）に溶かし、濾過し、次にその濾液ヘメタノール（２０ｍｌ ）を加えた。セミカルバゾン溶液を入れた装置をＮ２で掃気し、触媒（炭木上１ ０％パラジウム）（１００ｍｇ）を加えた。閉じた系中へＮ２を数時間通じた。

触媒を濾別し、溶媒を蒸発により除いてＬ−チロシニルーＬ−フェニルアラニル セミカルバゾン（Ｌ−Ｔｙｒ　−Ｌ　−Ｐｈｅ　Ｓｃ）を得た。

例　８ Ａ）Ｏ，Ｎ−ジメチルヒドロキシルアミンＨＣＩ　（８，５１ｇ）をかきまぜな がら乾燥ＤＭＦ　（７５ｍ１）に加え、Ｎ−メチルモルホリン（８，８ｇ）を５ 分間にわたり温度を３０℃以下に保ちつつ加えた。白色沈殿を生じた混合物を０ ℃に冷却した。

Ｂ）　Ｎ−ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｌ−Ｃｈａ　（２２，５ｇ）を乾燥ＴＨＦ（２００ ｍｌ）に溶かし、−１０℃に冷却した。温度を一１０°Ｃに保ちつつイソブチル クロロホルメート（１１，９４ｇ）を５分間にわたり加えた。温度を−１０℃に 保ちつつＮ−メチルモルホリン（８，８ｇ）を１０分間にわたり添加し、かきま ぜを更に１０分間続けＣ）懸濁液Ａを懸濁液ＢヘーｌＯ℃で１５分間にわたり加 え、次に混合物を室温まで温め、４時間かきまぜた。

混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジメチルアミノプロピルアミン（８，６ｇ）を５ 分間にわたり加え、かきまぜを更に５分間続けた。水（２００ｍｌ）と酢酸エチ ル（１００ｍｌ）を加え、水層を分離し酢酸エチル（２Ｘ１００ｍｌ）で抽出し た。合わせた有機相を（イ）水（１００ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（２０ ｍｌ）、（ロ）ＫＨＣＯ，水溶液（５％、１００ｍ１）、（ハ）　ＨＣＩ水溶液 （０，５Ｎ、１００ｍ１）、および（ニ）水（３Ｘ１００ｍｌ）で順次洗浄した 。温度を３０℃以下に保ちつつ真空下で回転蒸発により溶媒を除去しＮ　−ｔ　 −Ｂｏａ　−Ｌ　−Ｃｈａ　−０，Ｎ　−ジメチルヒドロキサメート得た。

段階ｂ Ｎ　−ｔ　−Ｂｏｃ　Ｌ　−Ｃｈａ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメー）（２ ６ｇ）およびトリフルオロ酢酸（６５ｍｌ）を０°Ｃて５分間かきまぜ、次に混 合物の温度を室温まで上昇させ、かきまぜを３時間続けた。次に温度を３０℃以 下に保ちつつ過剰のトリフルオロ酢酸を真空下で回転蒸発により除去した。残留 物へジエチルエーテル姿加えて溶液とし、次にエーテルを真空下で除いた。この エーテル処理を繰り返しＬ−Ｃｈａ−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリ フルオロ酢酸塩を黄色油状物として得た。

Ａ）　Ｌ　−Ｃｈａ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸 塩（１７ｇ）を乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶かした。温度を３０℃以下に保ちつ つＮ−メチルモルホリン（３，９５ｇ）を５分間にわたり加え、次に混合物を０ °Ｃに冷却した。

Ｂ）　ＣＢＺ　−Ｌ−Ａｌａ　（９，２５ｇ）を乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）にか きまぜながら溶かし、混合物を一１Ｏ℃に冷却した。イソブチルクロロホルメー ）（５，３５ｇ）を−１０℃で５分間にわたり加え、Ｎ−メチルモルホリン（３ ，９５ｇ）を１０分間にわたり加え、反応混合物を一１０℃で更に１０分間かき まぜた。

Ｃ）溶液Ａを溶液Ｂに−ｌＯ℃で１５分間にわたり加え、混合物の温度を室温ま で上昇させ、かきまぜを３時間続けた。混合物を０℃に冷却し、３−ジメチルア ミノプロピルアミン（３，９８ｇ）を５分間にわたり加え、かきまぜを更に５分 間続けた。次に水（１５０ｍｌ）と酢酸エチル（１５０ｍｌ）を加え、水相を分 離し、酢酸エチル（２ｘ　７５　ｍｌ）で抽出した。合せた有機相を（イ）水（ １２５ｍｌ）、（Ｃ７）ＫＨＣＯ，水溶液（５％、１２５　ｍｌ）　（ハ）ＭＣ Ｉ水溶液（０，５ＮＳ１２５ｍ１）および（ニ）水（３Ｘ１２５ｍｌ）で順次洗 浄した。温度を３０″Ｃ以下に保ちつつ溶媒を回転蒸発により除いた。新しい酢 酸エチルを加え、蒸発により除去してＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−Ｃｈａ 　−０、Ｎ−ジメチルヒドロキサメートを得た。

メート（７，２２ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（１６０ｍ１）に溶かし、Ｎ２下で一７０ ℃に冷却した。ＴＨＦ中水素化ジイソブチルアルミニウム（ＩＭ、８６ｍ１）を −７０°ＣてＮ２下に２０分間にわたり加え、かきまぜを更に２０分続けた。

Ｎ２下０°Ｃでかきまぜながらロッシェル塩溶液（４００ｍｌ）中に入れて反応 を失活させ、次に混合物を室温まで温めた。酢酸エチル（１５０ｍｌ）を加え、 混合物を５分間かきまぜた。反応混合物を濾過し、有機層を分離し、水相を酢酸 エチル（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を水（３×２００ｍｌ）洗 したが、このとき最後の洗浄には飽和ＮａＣｌ水溶液を添加した。温度を３０℃ 以下に保ちつつ回転蒸発により溶媒を除きＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｃｈ ａアルデヒドを油状物として得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｃｈａアルデヒド（８ｇ）を工業用メタ ノール添加酒精（５０ｍｌ）に溶かし、５０°Ｃに加熱した。

Ｂ）水（２５ｍｌ）中セミカルバジドＨＣＩ　（３，０ｇ）の熱溶液を水（２５ ｍｌ）中ＫＨＣＯ，（２，６７ｇ’）の熱溶液へ加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａに加え、得られた混合物を５０°Ｃで３時間かきまぜた。混 合物を放冷し、４°Ｃで一晩放置した。温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ工業用メ タノール添加酒精の大部分を回転蒸発により除き、残留物−・酢酸エチル（５０ ｍｌ）を加えた。有機相を分離し、（イ）水（３０ｍｌ）、（ＣＩ）Ｋｌ（ＣＯ ，水溶液（５％、３０ｍ１）、（ハ）ＨＣ１水溶液（０，５Ｎ、３０ｍ１）およ び（ニ）水（２×５０ｍｌ）（分離を促進するために必要に応じ飽和ＮａＣ１水 溶液を添加）で順次洗浄した。温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ回転蒸発により溶 媒を除去し、固体をイソプロパツールおよびエーテルから再結晶しＣＢＺ　−Ｌ 　−ＡｌａＬ−Ｃｈａｓ（、を得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−Ｃｈａｓｅ　（９００ｍｇ）をメタノール（ ３０ｍｌ）に溶かし、触媒（伐木上ｌＯ％パラジウム）　（ｌ　ＯＯ’ｍｇ）を Ｎ、下で加えた。閉じた系にＮ２を６時間通し、次に触媒を濾別した。温度を３ ０°Ｃ以下に保ちつつ回転蒸発により溶媒を除去し、固体をエーテルで洗浄し、 Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥してＬ−アラニル−Ｌ−シクロヘキシルアラニンセミカル バゾン（Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−ＣｈａＳｃ）を得た。

例　９ Ａ）Ｏ，Ｎ−ジメチルヒドロキシルアミンＨＣＩ　（９，１７ｇ）を室温でかき まぜながら乾燥ＤＭＦ　（１１０ｍ１）に加えた。Ｎ−メチルモルホリン（９， ５１ｇ）を５分間にわたり加え、この間温度を３０℃以下に保った。沈殿を生じ た混合物を０°Ｃに冷却した。

Ｂ）　Ｎ−ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｌｅｕ　（２３，３ｇ）を乾燥ＴＨＦ（２２０ｍｌ ）に溶かし、−１０℃に冷却した。温度を一１０℃に保ちながらイソブチルクロ ロホルメート（１２，９０ｇ）を５分間にわたり加えた。温度を一１０°Ｃに保 ちつつＮ−メチルモルホリン（９，５１ｇ）を１０分間にわたり加え、かきまぜ を更に１０分間続けた。

Ｃ）懸濁液Ａを懸濁液Ｂへ一１０℃で１５分間にわたり加えた。混合物を室温ま で温め、３時間かきまぜた。次に、混合物を０°Ｃに冷却し、３−ジメチルアミ ノプロピルアミン（９，１３ｇ）を５分間にわたり加え、かきまぜを更に５分間 続けた。酢酸エチル（１１０ｍｌ）と水（１１０ｍｌ）を加え、有機層を分離し 、（イ）水（２×１００ｍ１）、（口）ＫＨＣＯ，水溶液（５％、１００ｍ１） 、（／’）　ＨＣＩ水溶液（０，５Ｎ、１００ｍ１）および（ニ）水（３Ｘ　１ ００（Ｉｌｌ）で順次洗浄した。温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ回転蒸発により 溶媒を除き、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメー トを得た。

段階ｂ Ｎ　−ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｌ−Ｌｅｕ−〇、Ｎ−ジメチルヒドロキサメート（２３ ，４ｇ）およびトリフルオロ酢酸（１６５ｍｌ、０°Ｃに冷却）を室温で１８時 間−緒にかきまぜた。

次に温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ回転蒸発により過剰のトリフルオロ酢酸を除 去した。残留物へジエチルエーテルを加えて溶液とし、次にエーテルを真空下で 除いた。

４°Ｃて結晶化が起こるまでこのエーテル処理を繰り返しＬ−Ｌｅｕ−○、Ｎ− ジメチルヒドロキサ゛メートのトリフルオロ酢酸塩を得た。

段階Ｃ Ａ）　Ｌ−Ｌｃｕ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートのトリフルオロ酢酸塩 （１，８ｇ）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）に室温でかきまぜながら溶かした。混合 物を０℃に冷却し、Ｎ−メチルモルホリン（０，６３５ｇ）を５分間にわたり加 えた。

Ｂ）　ＣＢＺ　−Ｌ−Ａｌａ　（１，４０ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（２０ｍ１）に溶 かし、−１０°Ｃに冷却した。イソブチルクロロホルメート（０，８６９ｇ）を −１０°Ｃで５分間にわたり加え、Ｎ−メチルモルホリン（０，６３５ｇ）を１ ０分間にわたり加え、反応混合物を一１Ｏ°Ｃで更に１０分間かきまぜた。

Ｃ）溶液Ａを溶液Ｂへ一１Ｏ℃で１５分間にわたり加え、次に混合物の温度を室 温まで上昇させ、かきまぜを１８時間続けた。混合物を０℃に冷却し、３−ジメ チルアミノプロピルアミン（０，６４ｇ）を加え、次に反応混合物を水（２５ｍ ｌ）および酢酸エチル（２５ｍｌ）で失活させた。水相を分離し、酢酸エチル（ ２×２５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を（イ）水（５０ｍｌ）および飽和 ＮａＣｌ水溶液（分離促進のため）、（ロ）　ＫＨＣＯ，水溶液（５％、３０ｍ １）、（ハ）　ＨＣＩ水溶液（０，５Ｎ、３０ｍ１）および（ニ）水（３×３０ ｍｌ）で順次洗浄した。温度を３０°Ｃ以下に保ちつつ溶媒を回転蒸発により除 き、固体をＰ２Ｏ，上で真空乾燥することによりＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ−Ｌ− Ｌｅｕ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメートを得た。

段階ｄ ＣＢＺ　−Ｌ−Ａｌａ　−Ｌ−Ｌｅｕ　−０，Ｎ−ジメチルヒドロキサメート（ １，９ｇ）を乾燥ＴＨＦ　（４０ｍ１）に溶かし、Ｎ２下て一７０°Ｃに冷却し た。ＴＨＦ中水素化ジイソブチルアルミニウム（Ｉ　Ｍ、　２９．５ｍ１）をＮ ２下−７０℃において１０分間にわたり加え、かきまぜを更に１０分間続けた。

Ｎ２下−６０°Ｃでかきまぜながらメタノール（５０ｍｌ）およびロッシェル塩 溶液（５０ｍｌ）中に入れて反応を失活させ、次に混合物を室温まで温めた。水 （５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）を加え、混合物を濾過し、水層を分離し 、酢酸エチル（２ｘ５０ｍｌ）で抽出した。合わせた存機相を水（３ｘ１００ｍ ｌ）および分離促進のための飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。温度を３０°Ｃ以 下に保ちつつ回転蒸発により溶媒を除き、新しい酢酸エチルを加え、次に回転蒸 発により除きＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｌｅｕアルデヒドを得た。

段階ｅ Ａ）　ＣＢＺ−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−Ｌｅｕアルデヒド（６，７ｇ）を工業用メ タノール添加酒精（５０ｍｌ）に溶かし、５０℃に加温した。

Ｂ）水（３０ｍｌ）中ＫＨＣＯｚ　（９ｇ　）の熱溶液を水（３０ｍｌ）中セミ カルバジドＨＣＩ（１０，８ｇ）の熱溶液へ加えた。

Ｃ）溶液Ｂを溶液Ａへ加え、混合物を５０°Ｃで３時間かきまぜ、室温に一晩放 置した。固体を濾別し、工業用メタノール添加酒精：水（ｌ：１．２０ｍ１）で 洗浄し、Ｐ２Ｏ，上で真空乾燥してＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−ＬｅｕＳ ｃを得た。

段階ｆ ＣＢＺ　−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−ＬｅｕＳｃ　（９５０ｍｇ）をメタノール（１ ００ｍｌ）に溶かし、不溶物を濾別した。更にメタノール（５０ｍｌ）を追加し 、装置をＮ２で掃気した。触媒（伐木上ｌＯ％パラジウム）（１００ｍｇ）をＮ 、下で加え、次に閉じた系へＨｌを１３５分間通じた。触媒を濾別し、温度を３ ０℃以下に保ちつつ回転蒸発により溶媒を除いた。固体をＰ２Ｏ，上で真空乾燥 してＬ−アラニル−Ｌ−ロイシニルセミ力ルバゾン（Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−Ｌ ｅｕＳｃ　）を得た。

例１Ｏ Ｅ　ＣＨ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　”　４　Ｂ　（湿潤重量３ｇ）を焼結ガラスフ ィルター上でＮａＣｌ水溶液（０，５Ｍ、２４０＋ｎｌ）続いて水（１２０ｍｌ ）上で洗浄した。Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を水に溶かして０．１Ｍ　ＥＤＣ溶液とし、このＥＤ Ｃ溶液のｐＨを塩酸または固体酢酸ナトリウムの添加によりｐＨ４，５に安定さ せた。例！記載のようにしてつくったＬ　−Ａｌａ　−Ｌ　−ＰｈｅＳｃ　（１ ０ｍｇ）をメタノール（４００μｍ）に溶かし、ＥＤＣ水溶液０．＋Ｍ、２．４ ｍ１）と共に洗浄後のゲルに加えた。混合物を２０℃で１時間おだやかにかきま ぜ、必要に応じｐＨをｐＨ４，５に再調節し、かきまぜを２０℃で２３時間続け た。次にＬ−グリシンを最終濃度ＩＭとなるように加え、かきまぜを２０℃で更 に３時間続けた。このアフィニティークロマトグラフィーゲルを水性メタノール （５０％、６０ｍ１）、水（６０ｍｌ）および適用緩衝液（６０ｍｌ）で順次洗 浄し、必要時まで４℃で貯蔵した。

例１１〜例１８ アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの調製例２から例９に記載のよ うにつくられたジペプチド誘導体の各々を、例ＩＯ記載の方法と同様な仕方でゲ ルマトリックスに結合させることにより、それぞれ例１１から例１８のアフィニ ティークロマトグラフィーゲルを得た。

例１９ アフィニティークロマトグラフィー 「適用」緩衝液〔リン酸ナトリウム（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ　（１ｍＭ）　、エ タンジオール（３３％）　、ｐ）１６゜８〕＋ジチオトレイトール（２ｍＭ）ま たはシスティン（４ｍＭ）　（ｔ、　５　ｍｌ）中Ｐｏｗｅｌｌ　＆５ｃｈｏｌ ｅｆｉｅｌｄ、　ＵＫから得た噴霧乾燥パパヤラテックス（タンパク質０．０３ ｇ）を、例１Ｏ〜例１８のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの各 々の１ｍｌカラムに適用した。５種類の異なる溶離剤の少なくとも一つを下記の ように使用した： 溶離剤Ａ＝クエン酸ナトリウム（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む水 性エタンジオール（３３％）中ヒドロキシエチルジスルフィド（１００ｍＭ）　 、ｐＨ４，５；溶離前にカラムを一晩平衡化。

溶離剤Ｂ＝クエン酸ナトリウム（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む水 性エタンジオール（３３％）中２，２′−ジピリジルジスルフィド（３０ｍＭ） 　、ｐＨ４，５；溶離前にカラムを一晩平衡化。

溶離剤Ｃ＝クエン酸ナトリウム（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（ｆｍＭ）を含む水 性エタンジオール（３３％）中メチルピリジルジスルフィド（３０ｍＭ）　、ｐ Ｈ４，５；溶離前にカラムを一晩平衡化。

溶離剤Ｄ＝水酸化ナトリウム（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を含む水 性エタンジオール（３３％）中メルサリル酸（１０ｍＭ）、酢酸でｐＨ４、５に 調節。連続溶離。

溶離剤Ｅ＝酢酸ナトリウム（５０ｍＭ）を含む水性エタンジオール（３３％）中 ＨｇＣ１ｚ　（１０ｍＭ）　、ｐＨ４，５：連続溶離。

標準Ｍｏｎｏ　Ｓ　（ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーの後、溶離され た物質のＡ２．。痕跡量の検査により各溶離剤ての溶離を評価した。結果を下記 の表１に要約する：例２０ を、蒸留水（５ｍｌ）と１時間かきまぜ、未溶解物質を４°Ｃで９０００Ｘｇに おいて３０分遠心することにより除去した。ペレットを捨て、上澄のｐＨを２０ 分間にわたり塩酸（ＩＭ）でｐ）１１．８に調節した。かきまぜを４°Ｃで６０ 分続け、必要に応じｐＨをｐＨ１，８に再調節した。

（ｉｉ）　混合物を４°Ｃにおいて９０００Ｘｇて３０分間遠心し、ベレットを 捨てた。

（’１ｉｉ）　（イ）　ＮａＯＨ（５Ｍ）を１０分間にわたり滴加することによ り上澄のｐＨをｐ）１６．８に調節した。紫−青呈色が溶液に現われることが認 められた。

（ロ）得られた紫−青溶液をｌＯ容の「適用」緩衝液（リン酸ナトリウム（５０ ｍＭ　）；　ＥＤＴＡ　（１ｍＭ　）；　エタンジオール（３３％）、ｐＨ６， ８）に対し、緩衝液を３回取替えて十分に透析した。透析後の液を４０００Ｘｇ で１０分遠心し、キモパパインを含むデカンテーション上澄のタンパク質含量を 約３０ｍｇ／ｍｌに調節した。システィンを４ｍＭの最終濃度まで加えることに よりキモパパイン溶液を活性化し、０°Ｃで１５分放置した。

（１ｖ）適用緩衝液であらかじめ平衡化したＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ　（例 １０記載のように調製）結合　ＥＣＨ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｌ１１の８ｍｌカ ラムに活性化したキモパパイン溶液を流速３６　ｍｌ／　ｃｍ”　／時で適用し た。カラムを適用緩衝液（２床容）、エタンジオール（３３％）中クエン酸ナト リウム水溶液（５０ｍＭ）　、ｐＨ４，５（２床容）、および酢酸ナトリウム水 溶液（５０ｍＭ）　；　ＥＤＴＡ　（２５ｍＭ）　；エタンジオール（３３％） 中メルサリル（１０ｍＭ）　、ｐＨ４，５（２床容）で順次洗浄し、次に室温で ２時間インキュベーションした。

（Ｖ）メルサリル（１０ｍＭ）を含む酢酸ナトリウム水溶液（５０ｍＭ）（３床 容）でキモパパインを溶離し、フラクション（４ｍｌ）を集めた。溶離されたフ ラクションの酵素活性を前述したようにＢＡＰＮＡに対する比活性について検定 した。

活性フラクションを集め、Ｎａ”　（５０ｍＭ）　；　ＥＤＴＡ（１ｍＭ）　； 　ＮａＮ５（０，０１％）の「出発」リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）およびＮａ ”　（８００ｍＭ）　；　ＥＤＴＡ（１ｍＭ）　；　ＮａＮ５　（０，０１％） の「制限」リン酸塩緩衝液（１）Ｈ７，２）を用いてＭｏｎｏ　−Ｓ　ＨＲ’　 １０／　１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上での陽イオン交換クロマトグラ フィーにより更に精製した。溶離は２．７ｍＭ／ｍｌの塩勾配、流速２ｍｌ／分 で行なった。フラクション（４ｍｌ）を集め、タンパク質濃度は２８０ｎｍにお ける吸光度を測ることにより見積り、酵素活性はＢＡＰＮＡ加水分解により検定 した。

キモパパイン含有フラクションを集め、蒸留脱イオン水あるいはＥＤＴＡ水溶液 （１ｍＭ）に対して充分に透析し、貯蔵のため凍結乾燥した。

例２１ ｐａｐａｙａのコマーシャル品等噴霧乾燥ラテックス（１ｇ）を水（５ｍｌ）中 ２０°Ｃて６０分間かきまぜた。不溶物質を９０００Ｘｇて４°Ｃにおいて３０ 分遠心することにより除去した。ペレットを捨て、上澄のｐＨを塩酸（Ｉ　Ｍ） の２０分間にわたる液加によりｐＨ１，８に調節した。混合物を４°Ｃて１５分 かきまぜ、５分後にｐＨを調べ、必要に応じ調節した。

（２）沈殿を９（ｌｏＯＸｇで４°Ｃにおいて３０分遠心することにより除去し た。

（ｉｉｉ）　（ａ）水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ）をかきまぜながら液加する ことにより上澄をｐＨ７，０に調節した。沈殿を４°Ｃにおいて９０００Ｘｇで ３０分遠心することにより除いた。

（ｂ）　ＥＤＴＡ　（１ｍＭ）を含むＮａＪＰＯ＜　／ＮａＨｉＰＯ４Ｎａ２Ｈ ＰＯ４５０ｍＭ）　、ｐＨ７，２（緩衝液Ａ）で予備平衡化したＭｏｎｏ　Ｓ　 ＨＲ１０／　１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陽イオン交換カラムに得られた上澄 を適用した。試料適用後、カラｌ、をＡ２ｔＯかセロに戻るまて緩衝液Ａて洗浄 した（２ｍｌＺ分）。次に、カラムに（２，７ｍＭ　Ｎａ”　／ｍｌ）からＮａ ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（０，８０Ｍ　Ｎａ”　）までの勾配を適用し、４ ｍｌのフラクションを集めた。このフラクションをＢ　Ａ　Ｐ　Ｎ　ａに対する 活性について検定した。大きいキモパパインビーク（免疫学的に決定）はＮａ” 　Ｏ，１７〜０．２８Ｍで溶出した。この領域においてＢＡＰＮａに対し活性の あるフラクションを集め、エタンジオールを３３％（Ｖ／Ｖ）まで加えた。後か ら溶出する（Ｎａ”０．４７〜０．５９Ｍ）パパヤブロティナーゼＩＩＩ　ビー ク中のＢＡＰＮＡに対して活性をもつものを含めて他のすへてのフラクションは 捨てた。

（ｉｖ）　Ｌ−Ａｌａ　−Ｌ　−ＰｈｅＳｃ　（例１Ｏ記載のように調製）に結 合したＥ　ＣＨ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ１１のカラム（１５ｍｌ床容）を、エタン ジオール（３３％　Ｖ　／　Ｖ　）中ＥＤＴＡ（１ｍＭ）含有ＮａＨｚＰＯｎ　 ／　ＮａＪＰ０４水溶液（Ｎａ”５０　ｍＭ）　、ｐＨ，６，８（適用緩衝液） で洗浄した（　３９　ｍｌ／時／ｃｍ”）。キモパパイン貯留液（上記）をシス ティン塩基（最終濃度４ｍＭ）の添加により活性化し、０℃で１５分放置した。

次にこれをカラムに適用し、続いて適用緩衝液６０ｍ１を加えた。

（ｖ）次にＨｇＣ１ｚ（１０ｍＭ、４５ｍ１）を含む酢酸ナトリウム（５０ｍＭ ）緩衝液、ｐＨ４，５を適用した。−貫して５ｍｌずつのフラクションを集めた 。これらフラクションをＢＡＰＮＡに対する活性について検定した。

前記カラムによって遅れた活性ビークを含むフラクション（ＨｇＣ１ｚ含存緩衝 液で溶離された）を集め、Ｍｏｎｏ　Ｓカラムに再び適用した。カラムを緩衝液 Ａて洗浄し、次にシスティン塩基（４ｍＭ）を含む７床容の緩衝液Ａをカラムに 適用した。３０分間流れを止めて水銀を酵素から置換する。次に流れを再開し、 カラムを再び緩衝液Ａで洗浄した後、前述したようにＮａＨｚＰ０４／ＮａＪＰ ０４（０，８０ＭＮａ”）までの勾配を適用した。ＢＡＰＮＡに対して活性のあ るフラクションを合わせ、システィン塩基（最終濃度４　ｍＭ）を加え、次にこ の合わせたフラクションを０°Ｃで１５分放置した。

Ｃｈｅｌｅｘ樹脂（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　、　ＵＫ　；　０．５　ｇ）をカラムに 詰め、緩衝液Ａで洗浄した。キモパパインを含む貯留液をこのＣｈｅ　ｔｅｘカ ラムに通し、次にＥＤＴＡ水溶液（１ｍＭ）中に十分に透析し、凍結乾燥した。

キモパパイン精製の進行を表２に要約する。

例２２ キモパパインの調製−家兎でつくり出した特異的【ｇＧ抗体 Ｚｕｃｋｅｒ等（１９８５）（上記）により記述された方法によって、例２１記 載のようにしてつくられた純粋なキモパパインを使用前に温和にカルボキシメチ ル化した。

フロイント完全アジュバント中カルボキシメチル化タンパク質３６０μｇを筋肉 内注射し、続いて２週間後不完全アジュバント中１００μｇを皮下注射すること によりキモパパインに対する抗血清を家兎につくり出した。この抗血清から上記 のＨｅ１ｄｅおよびＳｃｈｗｉｃｋ　（１９７８）により記述された硫酸アンモ ニウム分別、続いてＮａＣ１（０，１４Ｍ）を含むリン酸ナトリウム水溶液（１ ０ｍＭ）（ｐＨ７，３）中に透析することにより［ｇＧをある程度精製した。

例２３ キモパパインの精製およびキモパパインとｐ　ｐ　ｒｖの免疫学的定量 （ｉ　〜１ｉｉ）　Ｐｏｗｅｌｌ　＆　５ｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄ、ＵＫから得た Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａのコマーシャル品等噴霧乾燥ラテックス（１ｇ）を例 ２１　（ｉ　−１ｉｉａ）記載のように調製し、ｐＨ１，８の処理に付した。

（ｉｖ）　Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−ＰｈｅＳｃ　（例１Ｏ記載のように調製）に 結合させたＥ　ＣＨ−５ｅｐｈａｒｏｓｅＲのカラム（床容１５ｍ１）を例２１ 　（ｉｖ）記載のように洗浄した。ｐＨ１，８処理から得た最終の上澄を、エタ ンジオール（３３％ｖ　／　ｖ　）中にＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含むＮａＨｘＰＯ ＜　／ＮａＪＰＯ＜（Ｎａ”　５０ｍＭ）水溶液（ｐＨ６，８）　（適用緩衝液 ）中に透析し、４０００Ｘｇで１０分間遠心し、上澄をジチオトレイトール（２ ｍＭ、最終濃度）の添加により２０°Ｃで１５分間活性化した。次にこれをアフ ィニティーカラム（３９ｍｌ／時／ｃｍ”）に適用し、続いて適用緩衝液６０ｍ １を適用した。ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびメチルピリジルジスルフィド（３０ｍ Ｍ；　ｌ　５ｍ１）　（Ｓａｌｉｈ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ。

（１９８７）、２４７，１８１−１９３による記述のように合成〕を含むクエン 酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ。

ｐＨ４，５）をカラムに適用した。流れを止め、ジスルフィド含有緩衝液を２０ °Ｃて一晩（１８時間）カラムに放置した。

（Ｖ）メチルピリジルジスルフィドを含む同じ緩衝液４５ｍ１を加え、続いて適 用緩衝液３０ｍ１を加えて流れを再開した。−貫してフラクション（５ｍｌ）を 集めた。

これらフラクションをＢＡＰＮＡに対する活性について検定した。メチルビリジ ルジスルフィド含有緩衝液中に溶離されカラムにより遅らされた活性ピークを含 むフラクションを集め、エタンジオール（３３％　Ｖ　／　Ｖ　）中ＥＤＴＡ水 溶液（１ｍＭ）で平衡化しておいた５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｌ　Ｈ−２０（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）のカラム（床容８０ｍ１）に適用した（４０ｍｌ／時／ｃｍ”）。

この緩衝液３００ｍ１を適用することによりクロマトグラフィーを続けた。各フ ラクション（８ｍｌ）を△Ａ　！　？　＋によりモニターし、ＢＡＰＮＡに対す る活性について検定した。

ＢＡＰＮＡに対する活性ピーク（これは更にＡ２，１のピークにより追跡した） からなるフラクションを集め、Ｍｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ１０／１０陽イオン交換カラ ムに適用し、例２１　（ｉｉｉｂ）記載のように操作した。ＢＡＰＮＡに対して 活性なフラクションを合わせた。

噴霧乾燥ラテックスおよびｐｉ（１，８処理、アフィニティークロマトグラフィ ーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーから回収された物質を、前記の単純放 射免疫拡散によりＰ　Ｐ　［Ｖの存在について分析した。例２２記載のように調 製した家兎て産生されるキモパパイン単一特異的抗体によるキモパパインの定量 に対し同じ方法を用いた。

本明細書に記載の方法で精製されかつ単純放射免疫拡散によりＰＰＩＶとＰ　Ｐ 　Ｉｌｌの両方を含まないことが示されたキモパパインを使用して、キモパパイ ンに対する標準曲線をつくった。結果を表３に示す。

表　３ キモパパインの精製およびキモパパインとＰ　Ｐ　［Ｖの免疫学的定量 酸処理　１５７　１．４３３　９２　＜　０．１＋＝検出されず ＊　ＢＡＰＮＡ検定法魔２ 例２４ キモパパインアレルギーの研究 ４０本のヒト血清試料を３　Ｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

ＵＳＡから購入した。これら試料は、キモパパインの市販形であるＣｈｙｍｏｄ ｉａｃｔｉｎ”に対するｔｇＥについて、商品名Ｃｈｙｍｏｆａｓｔとして知ら れる市販試験を既に受けていた。

試料のうち２０本はＣｈｙｍｏｆａｓｔ陽性、また２０本は陰性と称されていた 。これら４０本の試料は「めくら試験」を受け、また下に要約したビオチン−ア ビジン系を利用する修飾された固相酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い ることによりＣｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ”　、Ｐ　Ｐ　ＩＩＩ、ＰＰ［Ｖに対す る、また精製キモパパイン（本明細書中に記載の方法により精製し、単純放射免 疫拡散によりｐｐｔｖおよびＰ　Ｐ　Ｉ［Ｉの両方を含まないことが示されたも の）に対する自然に獲得した］ｇε抗体について更に試験した。

マイクロタイタープレート （右記のように被覆）　試験抗原 ↓ 試験血清 ↓ モノクローン抗ヒト［ｇＥ ↓ ビオチニル化家兎抗マウス１ｇ ↓ アビジン−ペルオキシダーゼ複合体 ↓ 基　質　（ＡＢＴＳ） ↓ 停止し、Ａ４１１１測定 Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔ　ｉｎ”はその満期日付内に使用し、ＰＰＩＶは本明細書 中に記載のように精製し、Ｐ　Ｐ　［１１はＢｕｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔ 　（１９８４）　（前記）に従い精製した。すべての抗原は、使用に先立ちＢｕ ｔｔｌｅおよびＢａｒｒｅｔｔ　（１９８４）（前記）記載のようにヨード酢酸 （１０ｍＭ）を用いる温和なカルボキシメチル化によって不活性化した。

マイクロタイタープレートの各ウェルを炭酸ナトリウム緩衝液（０，０５Ｍ、　 ｐＨ９，６）中試験抗原（１０℃ｇ／ｍｌ）　１００μｌとインキュベーション することによりウェルを試験抗原で被覆した。次に供与馬血清（４％）を用いて 後の工程中の非特異的結合を減らした。ＰＢＳ（０，１％Ｔｗｅｅｎ、２％馬血 清、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０、ｃｚｇ／ｎ＋ｌのヘパリン；ｐＨ７，２，１０ ０μｌ　／ウェル）中試験血清（ｉ／２０希釈）と３７℃で４時間インキュベー ションし、続いてモノクローン抗−ヒトＩｇＥ　（Ｋｅｍｅｎｙ＆　Ｒｉｃｈａ ｒｄｓによりＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８８）　。

１０８．１０５に記述されたようにして調製、ｌμｇ／ｍ１）（１００μｌ／ウ エル）と３７℃で３時間インキュベーションし、次にビオチニル化した家兎抗− マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、デンマークから入手可、ｌμｇ　 ／ｍｌ、ｌ　ＯＯμｌ／ウェル）と室温で一晩インキユベーションした。これら ウェルをアビジン−ペルオキシダーゼ（１０μｌ／ｍｌ、１００μｌ／ウエル） と３７℃で３０分インキュベーションし、緩衝液（１００ｍＭのクエン酸、２０ ０ｍＭ　ＮａＪＰＯ４，Ｉ）Ｈ４，２，１ｔｌｌ　／ｍｌのＨ２０□て活性化） 中基質Ｃ２，２’　−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）、 ＡＢＴＳ、０．５　ｍｇ／　ｎｒｌ　）を加え、ウェルを室温で３０分インキュ ベーションした。１００μｌ／ウエルの１００ｍＭクエン酸、０．０１％ＮａＮ ５の添加により反応を停止し、各ウェルについてＭｉｃｒｏ　Ｅ　Ｌ　Ｉ　ＳＡ 読取り器（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を用いて４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。

ＩｇＥ標準を０．０７５から４．８　ｎｇ／ｍｌ（２，４ｎｇ　［ｇＥ＝　１国 際車位の［ｇＥ）の範囲にわたり検定した。Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（Ｌ ｅａｔｈｅｒ−ｂａｒｒｏｗ、　Ｊ、　Ｒ，、１９８５，Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒ　 ｆｏｒ　Ｉ　ＢＭ　ＰＣ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｂｉｏｓｏｆｔ、６８ヒルズロード、ケンブリッジＣＢ２　 １ＬＡ、ＵＫ）を用いて四つの抗原調製物、ＣｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎＲ，Ｐ　 Ｐ　ＩＩＩ　、　Ｐ　Ｐ　［Ｖ　および例２３記載のようにして調製したキモパ パインの各々に対して指向した［ｇＨの濃度を計算した。

試験した４０本の血清試料中２６本はＣｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ”に対する［ｇ Ｅ抗体を含み、Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ”に対して最も反応性の高い１２本か らＰＰｌ［Ｉ　、ＰＰ［Ｖ　およびキモパパインについて得られた値を下の表４ に示す。平均値および標準誤差値は９回の測定から導いた。

抗−Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ抗体を含むこれら１２本の血清試料のうち、僅か ２本が主要［ｇＥ応答を示し、Ｐ　Ｐ　ｌ［［およびＰＰＩＶに対する抗体が検 出された関連［ｇＨのおよそ７５％を占めることか分かる。

例２５ キモパパインとｐｐｔｖの混合物のニワトリシスタチンによる阻害 キモパパインを例２３記載のようにして精製し、基質としてＢＡＰＮＡを使用し てＥ−６４で活性部位滴定を行なうことにより標準化した（　Ｚｕｃｈｅｒ等、 １９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　８２８．　１９６−２ ０４）。

前記のようにして精製したＰ　Ｐ　ＩＶも、基質としてのアゾカゼインの使用に この方法を適合させることによりＥ−６４で滴定した。

ニワトリシスタチン２型は、Ａ１１８ＳｔａＳｊ等、１９８３゜Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｊ、２１１．　１２９〜１３８記載のようにして精製し、前身てＥ−６４で 滴定したパパインて滴定することにより標準化した。

アゾカゼイン加水分解の検定はＲｏｗａｎ等、１９８８（前記）の方法により行 なったが、ただし基質の添加に先立ち酵素および阻害剤の４０℃、１５分の前イ ンキュベーションを取り入れた。

９本ずつの管２組を取り、４　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび１６ｍＭシスティン 塩基を含む０．４０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１）８６．８）　１２５μｌを 容管に入れた。キモパパインおよびＰ　Ｐ　［Ｖを、最終ブロティナーゼ濃度１ ００ｎｌＪまて種々な割合で加えた。１組の管へはニワトリシスタチンを最終濃 度ｌμＭまで加え、他の組へは同体積の水を加えた。次に管を再びインキュベー ションし、アゾカゼインの加水分解活性について検定した。

酵素混合物によるアゾカゼインの加水分解に及ぼすニワトリシスタチンの効果を 、シスタチン欠如下での同じ酵素混合物により生じた活性の阻害パーセントとし て表わし、表５に示す。

ニワトリシスタチンによる阻害の度合はＰ　Ｐ　［Ｖ濃度と逆比例的に関連する ことが分かる。

例２６ ｐＨ２，２〜１．２における酸沈膜性によるキモパパインの精製 ｉ）　Ｐｏｗｅｌｌ　＆　５ｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄ、ＵＫから得たＣａｒｉｃａ 　ｐａｐａｙａのコマーシャル品等噴霧乾燥ラテックスを蒸留水で２０％（Ｗ／ Ｖ）とし、１時間かきまぜた。未溶解物質を９０００Ｘｇて４℃において３０分 遠心することにより除いた。ペレットを捨て、４°Ｃでかきまぜながら塩酸（Ｉ 　Ｍ）を４０μｌ／分／ｍｌ　の速度で液加することにより上澄のｐＨを下げた 。Ｉ）８４．　（１１およびｐＨ１，０９の標準緩衝液で目盛定めしたＲａｄｉ ｏｍｅｔｅｒ組合せ電極（タイプＧＫ２４０１Ｃ）を使用して混合物のｐＨを絶 えずモニターした。ｐＨ２，２において、またこれより下にｐＨ１，２まで０、 ２　ｐＨ単位の間隔で、酸の添加を止め、４℃でかきまぜを続けなからｐＨを一 定に保った。次に、一部分（出発溶液のｌｏｍｌと等価）を取り出し、貯蔵した 。次のｐＨ間隔に達するまで残りの溶液への酸添加を続けた。

ｉｉ）すべての試料を９０００Ｘｇで４°Ｃにおいて３０分遠心し、ペレットを 捨てた。

ｉｉＤ　各上澄のｐＨをＮａＯＨ（Ｉ　Ｍ　）の液加（４００μｍ７分）により ｐＨ６，８に調節した。各試料を再び９０００Ｘｇで３０分間遠心して更に沈殿 を除いた。

先の実験において、ｐＨ１，８での酸沈殿を２５°Ｃで行なった。

最後の上澄を各々ＢＡＰＮＡに対する活性について、また前記の単純放射免疫拡 散により本発明に係るキモパパインおよびｐｐｔｖの存在について検定した。結 果を表６に示す。これら結果はｐＨ１，８およびその下で４°Ｃでの酸沈殿によ り全タンパク質の＜０．１％の濃度まで、またｐ）１１．８で２５°Ｃでの沈殿 により＜０．５％まてＰ　Ｐ　［Ｖの除去か達成されたことを示している。

例２７ ヒツジに産生された単一特異的１ｇＧ抗体の調製例２１記載のようにして調製さ れた純粋なキモパパインを、Ｚｕｃｋｅｒ等（１９８５）（前記）により記述さ れた方法により、使用前に温和にカルボキシメチル化し、ＮａＣ１（０，１４Ｍ ）を含むリン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）　、ｐＨ７，３中に透析した。フ ロイント完全アジュバント中このカルボキシメチル化タンパク質１００μｇを筋 肉内注射し、続いて１ケ月後、同じ方法で５０℃ｇを投与することにより、ヒツ ジにキモパパインに対する抗血清をつくらせた。Ｈｅ１ｄｅおよびＳｃｈｗｉｃ ｋ　（１９７８）（前出）により記述された硫酸アンモニウム分別法およびそれ に続＜　ＮａＣ１（０，１４Ｍ）含有リン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）　（ ｐＨ７，３）中への透析によって該抗血清から［ｇＧをある程度精製した。

パパイン、パパヤプロティナーゼｍおよびパパヤブロティナーゼｔＶに対する抗 体のＩｇＧ調製物を同様にしてつくった。

個々のカルボキシメチル化抗原を、製造業者の説明書に従って、ＮａＣ１（０， １４Ｍ）を含むリン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）　（ｐＨ７，３）で平衡化 させた商品名Ｚｅｔａｆｆｉｎｉｔｙ（Ａｎａｃｈｅｍ）として供給されるカラ ムに別々に結合させた。潜在的に汚染する、あるいは交差反応する抗体を、これ らカラム中への通過により［ｇＧ調製物から吸収し去るので、その結果最終［ｇ Ｇ調製物はそれらのそれぞれの抗原とは沈殿反応を与えるが、異なる抗原とは沈 殿を生ずる交差反応を起こさない。抗原と結合したカラムはジエチルアミン水溶 液（０，０５Ｍ）（ｐＨ１ｔ、５）によって再使用のため再生され、すぐにリン 酸塩緩衝液で再平衡化させた。

この方法でキモパパイン、ＰＰＩＩＩ　、ＰＰＩＶおよびパパインに対する［ｇ Ｇ抗体の単一特異的調製物がつくられ、そしてこのものは前記の単純放射免疫拡 散により各抗原の定量的検定に使用することができた。

例２８ ヤル品等噴霧乾燥ラテックス（２０ｇ）を脱イオン蒸留水（４°Ｃに予冷、２５ ０　ｍｌ）中０°Ｃて６０分かきまぜた。

ｐＨ４，０１および１．０９の標準緩衝液（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、２５’Ｃ） で校正したＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ組合せ電極（タイプＧＫ２４０１Ｃ）を用いて 絶えずｐＨをモニターしながら、ＨＣＩＣ／Ｎ）をｌＯμｌ／分／ｍｌの速さで 加えることにより、混合物のＩ）ＨをｐＨ１，５に調節した。ｐＨ１，５に達し たとき、１０分の時間をおいてｐＨを安定化させ、この時間中必要に応じｐＨを 更に調節した。

ｉｉ）混合物を１２０００Ｘｇで４°Ｃにおいて３０分遠心し、ペレットを捨て た。

１ｉｉ）（ａ）　ｆｌＨ７，０１の標準緩衝液（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、２５℃ ）で校正したＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ電極を使用してｐＨを絶えずモニタ−ヒツジ 、ＮａＯＨ（Ｉ　Ｍ）を１０μｌ／分／ｍｌの速さで加えることにより上澄液の ｐＨをｐＨ７，０に調節した。ｐＨ７，０に達したとき、１０分の時間をおいて ｐＨを安定化させ、この時間中必要に応じｐＨを更に調節した。混合物を１２（ ｂ）３０容の脱イオン蒸留水（１２時間間隔で２回取り替えた）に対し４°Ｃに おいてこの上澄を十分に透析した。

透析した溶液をＳ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ高性能３５／１００カラム（ｐｌＩＢ ｒｍａｃｉａ）上ての陽イオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。各 実験に対し最高３ｇのタンパク質（Ａ２．。により定量）を使用した。カラムを ＥＤＴＡ水溶液（１ｍＭ）で４°Ｃにおいて前平衡化させた。

試料適用後、カラムをＡ２．。がゼロに戻るまで、ＥＤＴＡ水溶液（１ｍＭ）を 用いてｔｏｍｘ／分て洗浄した。

カラムにＫ”０．５Ｍまでの勾配（Ｋ”　０．１７５ｍＭ／ｍりを適用し、−貫 して２５ｍ１ずつフラクションを集めた。ピークフラクションをＢＡＰＮＡに対 する活性について検定した。

Ｂ　Ａ、　Ｐ　Ｎ　Ａに対し最高の比活性を存するキモパパインを含むフラクシ ョン（Ｋ”０．１７から０．２２Ｍの間で溶出）を集めた。集められたキモパパ インを３０容の脱イオン蒸留水（１２時間間隔て５回取り替えた）に対し４°Ｃ で十分に透析した。この透析物を凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵した。

全体の精製手順を幾つかの場合について繰り返した。

本発明に係るキモパパイン、パパイン、Ｐ　Ｐ　ＩＩＩおよびＰＰ［Ｖを前記の ように単純放射免疫拡散を用いて検定し、例２７記載のようにヒツジで抗体をつ くった。ＢＡＰＮＡに対する活性およびヨード酢酸を用いた活性部位滴定を前記 ＢＡＰＮＡ方法魚１方法−て評価した。精製の進行を表７に示す平均値により要 約する。

例２９ キモパパインの精製−ｐＨ１，５における酸沈殿およびアフィニティークロマト グラフィー ｉ　＝　１ｉｉ）　５ｉｅｂｅｌｓ、　Ｕ　Ｓ　Ａから得たＣａｒｉｃａ　ｐａ ｐａｙａのコマーシャル品等噴霧乾燥ラテックス（５０ｇ）を例２８（ｉ　＝ｉ ｉｉａ）記載のように調製し、ｐＨ１，５処理に付した。

上澄を３０容の脱イオン蒸留水（１２時間間隔で２回取り替えた）に対し４°Ｃ で十分に透析した。

ｉｖ）　Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ−ＰｈｅＳｃ（例１Ｏ記載のように調製）に結合さ せたＥ　ＣＨ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ”のカラムＣ床容３５０ｍ１）を、酢酸ナト リウム（５０ｍＭ）を含むエタンジオール水溶液（３３％　ｖ／ｖ）　（ｐＨ４ ，５）で−晩平衡化させ、次にエタンジオール（３３％　Ｖ／Ｖ）中にＥＤＴＡ （１ｍＭ）を含むＮａＨｔＰＯ４／　ＮａＪＰＯ４水溶液（Ｎａ”　５０ｍＭ） 　（ｐ）１６．８．適用緩衝液）で平衡化させた。

透析した上澄（上記）を細孔寸法０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、３３ ％（Ｖ／Ｖ）までエタンジオールを加えた。溶液のｐＨを調べ、必要に応じｐＨ ７，０に調節した。新しく調製したし一システィン水溶液（２００ｍＭ）を４ｍ Ｍ濃度まで加え、溶液をよく混合し、４℃で１５分間放置した。これを次に４° Ｃにおいて４０ｍ１／時／ｃｍ”までの流速でアフィニティーカラムに適用した 。

カラムをｌＯ床容の適用緩衝液て洗浄した。

■）酢酸ナトリウム（５０ｍＭ）を含むエタンジオール（３３％　ｖ／ｖ）中Ｈ ｇＣ１ｚ水溶液（１０ｍＭ）　（ｐＨ４，５）３床容でキモパパインを溶離し、 ２５ｍ１のフラクションを集めた。ＢＡＰＮＡに対する活性を有するフラクショ ンをためておき、Ｓ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ高性能３５／１００カラム（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）上での陽イオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。

カラムを４℃においてＥＤＴＡ水溶液（Ｉ　ｍＭ）で前平衡化させた。試料充填 後、カラムをＡｘｅｓがゼロに戻るまで１０ｍ１／分でＥＤＴＡ水溶液（１ｍＭ ）により洗浄した。ＥＤＴＡ（１ｍＭ）とＬ−システィン（５００ｍＭ）を含む ３床容のに２ＨＰＯ，／ＫＨ２ＰＯ４水溶液（Ｋ”　５０ｍＭ）　（ｐＨ７，２ ）をカラムに適用し、３０分流れを止めた。更に３床容の新しく調製したシステ ィン緩衝液をカラムに適用し、３０分流れを止めた。カラムを更に６床容のシス ティン緩衝液で洗浄し、次にＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含むに２ＨＰＯ４／ＫＨ，Ｐ Ｏ，水溶液（Ｋ”　５０ｍＭ）　（ｐＨ７，２）で再平衡化させた。

Ｋ”０．５Ｍまでの勾配（０，Ｉ　７５ｍＭ　Ｋ”　／ｍｌ）をカラムに適用し 、−貫して２５ｍ１ずつのフラクションを集めた。ピークフラクションをＢＡＰ ＮＡに対する活性について検定した。Ｋ”０．２から０．２５Ｍで溶離された最 初のピークがキモパパインであった。Ｋ＋約０．４５Ｍで溶離された第二のピー クはパパヤブロティナーゼＩ［［であった。

ＢＡＰＮＡに対し最高の比活性を有するキモパパインを含むフラクションを集め た。集められたキモパパインを３０容の脱イオン蒸留水（１２時間間隔で水を５ 回取り替えた）に対して４°Ｃで十分に透析した。

陽イオン交換カラムから溶離されたキモパパインはシスティン緩衝液によって活 性化しであるので、酸化により不活性化され易かった。活性酵素の酸化による不 活性化を実質的に防止または軽減するため、凸子オン酸ナトリウムの懸濁液（２ ００ｍＭ）を含む管にフラクションを集め各フラクション中のＮａ５４１ｓの最 終濃度を５ｍＭとする。

別法として、集めたキモパパインを窒素下で水に対して透析した。この水は窒素 下で封じた容器中で窒素を０．１ｉｉ分の速度で３０分通じることにより酸素を 追い出したものである。

最後に透析物を凍結乾燥し、−２０°Ｃで貯蔵した。

この全体的精製手順を幾つかの場合について繰り返し、精製の進行（例２８記載 のようにして検定）を表８に示した平均値により要約する。

例３０ マーシャル品等噴霧乾燥ラテックスを調製し、例２８記載のようにｐＨ１，５処 理、透析、およびＳ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅＲ上での陽イオン交換クロマトグラ フィーにかけた。

１ｖ）ＢＡＰＮＡに対し最高の比活性を有するキモパパインを含むフラクション を集め、３３％（ｖ／ｖ）となるまでエタンジオールを加えた。新しく調製した し一システィン水溶液（２００ｍＭ）を４ｍＭの濃度になるまで加え、この溶液 を例２９（ｉｖ）に記載のようにＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＳｃに結合させたＥ　 ＣＨ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ”のカラムに適用した。

Ｖ）酢酸ナトリウム（５０ｍＭ）を含むエタンジオール（３３％　ｖ　／　ｖ　 ）中ＨｇＣｌ　２水溶液（１０ｍＭ）　（ｐＨ４，５）３床容を用いてキモパパ インを溶出し、２５ｍ１ずつフラクションを集めた。ＢＡＰＮＡに対し活性を有 するフラクションを集め、３０容の脱イオン蒸留水（１２時間間隔て５回取り替 えた）に対し４°Ｃで十分に透析した。透析物を凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵し た。

精製の進行（例２８記載のように検定）を表９に要約する。

例３１ 本発明に係るキモパパインの二つの調製品をＢＡＰＮＡ検定法１および２を用い て１同じ日に検定した。タンパク質を全乾燥重量により算定した。キモパパイン 調製品Ａは例２８記載の精製手順によって得たものであり、キモパパイン調製品 Ｂは例２９記載の精製手順に由来する（最終フラクションは四チオン酸ナトリウ ム中に集めた）。三重に実施した検定の結果を表１０に示した。

例３２ 例２９記載のように精製し、該例記載のように窒素下で透析したキモパパインを 凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵した。この凍結乾燥キモパパインは３７℃、ｐＨ６ ，０においてＢＡＰＮＡ　（１ｍＭ　）に対し１３４５単位／ｍｇの比活性を存 した。

精製キモパパインを含有してなる組成物のびん１００個をつくるため、下記のよ うに４３．７５ｇの溶液（小分けする前）をつくる。この大量溶液を処理中ずっ と４から１２℃に保つ。

Ｌ−（＋）システィン塩酸塩−水和物（１８６ｍｇ）を注射用の水約３０ｇに加 え、最終体積中に２２ｍＭの濃度が得られるようにした。溶液のＩ）ＨをＮａＯ Ｈ（ＩＭ）かＭＣＩ　（０，１Ｍ）でｐＨ５，０から５．５に調節した。このシ スティン溶液を精製キモパパイン（３５８ｍｇ）に加えて最終体積中に１１００ ０単位／ｍｌの濃度を得るようにした。

かきまぜた溶液のｐＨをＮａＯＨ（ＩＭ）かＨＣＩ　（０，１Ｍ　）でｐＨ５， ９から６．１に調節し、注射用の水で４３．７５ｇにつくった。この溶液を直列 においた２個の細孔寸法０．２ミクロンのフィルターに通過させて滅菌した。こ の溶液０．４ｇ量を１０１００Ｘ５ガラスびんに詰めた。びんに施栓し、減圧下 で凍結乾燥品することにより水を除去し、凍結乾燥を含むびんを真空下でシール した。

各びんは白色無定形粉末を含み、このものは３．２７　ｍｇのキモパパインと１ ．５２　ｍｇのシスティンナトリウム塩酸塩を含有する（それぞれ１０％の過多 量を許して名目上４０００単位および８μモル）。この組成物は使用直前に注射 用の水２ｍｌを添加することにより一般に再構成され、公称４０００単位のキモ パパインと４ｍＭのし一システィンを含有する注射液が得られる。

手続補正書（蜆） １−事件の表示 治療剤 ザ　ブーツ　カンパニー　ビーエルシー４、代理人 ６、補正により増加する請求項の数 ７、補正の対象 明細書及び請求の範囲翻訳文 国際調査報告 １＋Ｎｅｒｎ幽ＡｍａｓＴｈｔｓ＋−１１６ＰＣＴ／ＥＰ９０１００６４フｍｓ ＋ｔａ＋ｄ＋ｍ　ＡｅＮｔａ！ｌ＠ＲＨ＠、ｐ（τ／、ＥＰ　９０１００６４） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．３７℃およびｐＨ６．０において、ＢＡＰＮＡ（１ｍＭ）に対して８００〜 １７００単位／ｍｇの比活性を有し、かつまた「ＰＰＩＶおよびそれに対する抗 体の調製」と題する本明細書の記載に従い得られうるパパイアプロテアーゼＩＶ （ＰＰＩＶ）、パパインおよびパパイアプロテアーゼＩＩＩ（ＰＰＩＩＩ）をそ れぞれ、０．２％より少ない量で含有するキモパパイン。 ２．３７℃およびｐＨ６．０において、ＢＡＰＮＡ（１ｍＭ）に対して１０００ 〜１７００単位／ｍｇの比活性を有する、請求項１に記載のキモパパイン。 ３．４０℃およびｐＨ６．８において、ＢＡＰＮＡ（２．５ｍＭ）に対して３０ ００〜４５００単位／ｍｇの比活性を有し、かつまた「ＰＰＩＶおよびそれに対 する抗体の調製」と題する本明細書の記載に従い得られるパパイアプロテイナー ゼｌＶ（ＰＰＩＶ）、パパインおよびパパイアプロティナーゼＩＩＩ（ＰＰＩＩ ｌ）をそれぞれ０．２％より少ない量で含有するキモパパイン。 ４．４０℃およびｐＨ６．８において、ＢＡＰＮＡ（２．５ｍＭ）に対して３５ ００〜４５００単位／ｍｇの比活性を有する請求項３に記載のキモパパイン。 ５．１μＭまでの濃度のニワトリシスタチンによって少なくとも９５％阻害され るアゾカゼインに対する活性を有する、前記請求項のいづれか一つに記載のキモ パパイン。 ６．少なくとも７０％の活性酸素を含有する、前記請求項のいづれか一つに記載 のキモパパイン。 ７．前記請求項のいづれか一つに記載のキモパパインを含有する組成物。 ８．担体をさらに含有する、請求項７に記載の組成物。 ９．脱気したパイアルまたはアンプル中に、無水条件の下に密封されている、請 求項７または８に記載の組成物。 １０．還元剤をさらに含有する、請求項９に記載の組成物。 １１．可逆性システインプロティナーゼインヒビターをさらに含有する、請求項 ７〜１０のいづれか一つに記載の組成物。 １２．請求項１〜６のいづれか一つに記載のキモパパインを含有する医薬組成物 。 １３．医薬的に許容される稀釈剤、賦形剤または担体をさらに含有する、請求項 １２に記載の医薬組成物。 １４．脱気したパイアルまたはアンプル中に、無水条件の下に密封されている、 請求項１２または１３に記載の医薬組成物。 １５．医薬的に許容される還元剤をさらに含有する、請求項１４に記載の医薬組 成物。 １６．非経口投与用の単位投与形感である、請求項１２〜１５のいづれか一つに 記載の医薬組成物。 １７．ケモヌクレオリシスに使用するための、請求項１〜６のいづれか一つに記 載のキモパパイン。 １８．ケモヌクレオリシスに使用するための医薬の製造用の請求項１〜６のいづ れか一つに記載のキモパパイン。 １９．損傷した、ヘルニア様の、またはその他の異常な哺乳動物の脊椎内脊椎盤 をケモヌクレオリシスにより処置する方法であって、請求項１〜６のいづれか一 つに記載のキモパパインの医薬的に許容される溶液を、上記脊椎盤の部分を選択 的に溶解するのに充分な量で上記脊椎盤中に注入することからなる方法。 ２０．哺乳動物対象の異常な脊椎盤を処置する方法であって、 ｉ）上記脊椎盤中に針を挿入し、 ｉｉ）この針の位置をＸ線によって確認し、次いで、 ｉｉｉ）請求項１〜６のいづれか一つに記載のキモパパインの医薬的に許容され る溶液を、上記脊椎盤の部分を選択的に溶解するのに充分な量で、上記脊椎盤中 に注入する、 ことからなる方法。 ２１．キモパパインの精製方法であって、ａ）可逆性キモパパイン阻害性ペプチ ドがキモパパイン分子の活性部位に結合するように、このペプチドのＮ−末端に 、場合によりスペーサーアームを介して共有結合されている支持マトリックスか らなる活性部位特定アフィニティクロマトグラフィマトリックスとともに、粗製 キモパパインの水溶液をインキュベートし、次いで ｂ）キモパパインを適当な溶出剤により溶出する、ことからなる方法。 ２２．キモパパインの精製方法であって、１．粗製キモパパインを含有する水性 混合物を１．２〜１．８のｐＨで沈殿させ、 ２．この混合物から粗製キモパパインの水溶液を分離し、次いで、 ３．この粗製キモパパインの溶液を中和し、次いで場合により脱塩する、 ことからなる方法。 ２３．キモパパインの精製方法であって、ｉ）粗製キモパパインを含有する水性 混合物を２．０より小さいｐＨにおいて沈殿させ、 ｉｉ）この混合物から和製キモパパインの水溶液を分離し、 ｉｉｉ）この粗製キモパパインの溶液を中和し、次いで場合により、脱塩し、 ｉｖ）可逆性キモパパイン阻害性ペプチドがキモパパイン分子の活性部位に結合 するように、このペプチドのＮ−末端に、場合によりスペーサーアームを介して 共有結合されている支持マトリックスからなる活性部位特定アフィニティクロマ トグラフィマトリックスとともに、上記工程（ｉｉｉ）から得られた溶液をイン キュベートし、次いで Ｖ）キモパパインを適当な溶出剤で溶出する、ことからなる方法。 ２４．酸沈殿を１．２〜１．８のｐＨで行なう、請求項２３に記載の方法。 ２５．少なくとも１回のカチオン交換クロマトグラフィエ程を組合わせる、請求 項２１〜２４のいづれか一つに記載の方法。 ２６．Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ｐｈｅ −Ｄ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＰｈｅＭｏ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＰｈｅＯｘ 、Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＣｈａＳｃおよびＬ−Ａｌａ −Ｌ−ＬｅｕＳｃから選ばれる可逆性キモパパイン阻害性ペプチド。 ２７．Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ｐｈｅ −Ｄ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＰｈｅＭｏ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＰｈｅＯｘ 、Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＣｈａＳｃおよびＬ−Ａｌａ −Ｌ−ＬｅｕＳｃから選ばれるジペプチド。 ２８．Ｃ末端フェニルアラニン誘導体またはフェニルアラニン類縁体誘導体を含 有する可逆性キモパパイン阻害性ペプチド（ただしこの阻害性ペプチドはＬ−フ ェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンセミカルバゾンではないこともある）の Ｎ−末端に、場合によりスペーサーアームを介して、共有結合されている支持マ トリックスからなる、キモパパイン活性部位特定アフィニティクロマトグラフィ マトリックス。 ２９．上記阻害性ペプチドがＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐ ｈｅＳｃ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＰｈｅＭｏ、Ｌ−Ｐ ｈｅ−Ｌ−ＰｈｅＯｘ、Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−ＰｈｅＳｃ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｃｈａ ＳｃおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕＳｃから選ばれる、請求項２８に記載のキモ パパイン活性部位特定アフィニティクロマトグラフィマトリックス。