CN1060519C - 桄榔植物蛋白酶的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从植物中提取的新蛋白酶种及其提取方法。采用砂糖椰子植物作原料，用无机盐沉淀法提取粗酶，经离子交换法提取精酶、所提取的桃榔植物蛋白酶具有耐Na2S4O6、DFP、PMSF、乙醇和高pH的特性。

Description

桄榔植物蛋白酶的提取方法
本发明涉及一种从植物中提取新蛋白酶种的方法。
酶是生物催化剂。根据酶的来源，可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶三类。植物蛋白酶由于资源丰富，不需要采用象微生物发酵培养之类的复杂工艺，因而受到重视。植物蛋白酶是植物组织中含有的天然物质，可以应用到食品、制革、洗涤及医药工业之类的许多领域。植物蛋白酶常常按习惯以植物“属”命名。已经提取形成生产的植物蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、剑麻蛋白酶等。
众所周知，不同的植物蛋白酶，具不同的性质，因而开发新的植物蛋白酶种，就可以扩大用途。如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和剑麻蛋白酶活性最适pH范围在中性，三种酶室温下在50％乙醇中失活。
本发明的目的在于采用非常规的植物蛋白酶提取方法，提取新的，具有耐乙醇和高pH值的植物蛋白酶。
本发明采用无机盐沉淀法(提取粗酶)和高pH去杂离子交换法(提取精酶)从棕榈科(Palmaceae)桄榔属(Areaga)砂糖椰子(Areaga Pinnata、又名桄榔)植物中提取桄榔蛋白酶的工艺过程顺序是：采用砂糖椰子作原料，将其榨取汁液，用硫酸铵加入汁液中去除杂蛋白，经沉淀取沉淀物干燥后得粗酶；或将粗酶用透析膜透析除盐，用碱调pH至碱性，离心后取上清液经层析后再经干燥得精酶。
本发明工艺过程所采用的砂糖椰子植物包括其茎、果柄、果皮和果肉，但以果肉的含酶量最高，在成熟度不同的果实中，又以果实充分长大，但又未成熟变软时的酶得率最多且活性最高。
本发明工艺过程用硫酸铵去除杂蛋白和沉淀时，先用25-35％饱和度硫酸铵加入榨取的桄榔汁液中去除杂蛋白，然后上清补足50％饱和硫酸铵取其沉淀。
本发明工艺过程采用碱调节pH时，所用的碱可是氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铵、铵水，但最好是用氢氧化钠将经透析的粗酶调pH至9．5左右。
本发明工艺过程所采用DE(Diethylaminoethyl)52层析，也可用CM(Corboxymethyl cellulose)52、22，QAE(Diethyl[2hydroxyproyl]aminoethyl)25、50等柱取代进行分离，但分离效果不如DE52。
本发明经DE52柱层析酶能分离9个在280nm处有吸收的蛋白峰，其中2、4、5峰有活性，第5蛋白峰为主要活性成份。经等电聚焦鉴定DE52柱层析成份5，证实DE52层析的酶制剂较纯，等电点在pH3．99左右，将对应等电为pH3．99的位置上切下的胶体进入系统测活，显示该蛋白带有活性，证明该蛋白带确是蛋白酶。用SPS电泳证明酶的分子量为4．4万道尔顿。
采用本发明方法所得到的桄榔蛋白酶，除具有一般的巯基蛋白酶性质外，还表现出以下特性：(1)桄榔蛋白酶比菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶的巯基试剂耐受力要高出两个数量级，5×10-3mol的Na2S4O6和10-3mol的DFP、PMSF对它的活性无影响；(2)桄榔蛋白酶极耐碱，在pH9．6-11之间有最高活性，pH13时酶活性还有pH7时的1／3；(3)桄榔蛋白酶在50-75％的乙醇(30分钟)内都显示出几乎最高活性。桄榔蛋白酶的以上特性，显示了它在生物工程中作为工具的前景。
实施例1：
剥取充分长大的桄榔果实的果肉100克压榨得57ml汁液，边搅拌边加入60ml40％饱和度的硫酸铵溶液，静置12小时后离心(4000转／分)取出上清液，在搅拌下加放固体硫酸铵。使溶液达50％硫酸铵饱和度。静置12小时。离心(10000转／分)取沉淀。加PH9．3的NaOH溶液溶解沉淀。试液用透析膜透析除盐。再用NaOH调已透析后的试液为PH9．3，离心(10000转／分)。取上清液用DE52柱层析分离。取层析成分5冷冻干燥成精酶0．37克、活力485万紫外单位／克。
实施例2：
柱层析前的操作同实施例1。取上清液用CM52柱层析分离，取层析成分1、冰冷干燥成精酶0．52克、活力为293万紫外单位／克。
实施例3：
制备过程按实施例1，将冷冻干燥改成50℃热风干燥，得精酶0．35克，活力为308万紫外单位／克。
实施例4-7：
取砂糖椰子的茎、果实柄、果皮、果肉各1000克。分别榨取汁液。用酪蛋白法直接测汁液活性。结果见表1。
表1
实例 植株部位 汁液榨取率(％) 汁液活性(紫外单位／克)
实施例4   茎     22     68
实施例5 果实柄     26     315
实施例6 果皮     15     0
实施例7 果肉     58     83800
实施例8-10：
将不同成熟度砂糖椰子果实采收后洗净剥取果肉。各称取1000克。分别榨取汁液后照实施例1提取粗酶方法。按所得汁液比例加入硫酸铵提取粗酶。并用酪蛋白法测定各自活性。结果见表2。
表2
实例 果实成熟度 得汁量(克) 得粗酶(克)     粗酶活性(万紫外单位／克)
实施例8 种子刚形成 610  25．3     81．3
实施例9 果实充分长大 580  38．2     117．5
实施例10 果实成熟变软 560   4．1     12．0
实施例11-14：
桄榔酶与现有技术木瓜酶对乙醇耐受性的比较。
将本发明实施例1所得到的精酶用不同浓度的乙醇配制成酶液(1∶10000)。并以木瓜酶作对照40℃预热15分钟后进入测定系统(用酪蛋白法测定蛋白酶水解活性)。表3列出了桄榔酶对不同浓度乙醇在不同作用时间下的耐受性。
表3
Figure 9110315000061

Claims (5)

1．一种桄榔植物蛋白酶的提取方法，其特征在于采用砂糖椰子植物作原料，将其榨取汁液，用硫酸铵加入汁液中去除杂蛋白，经沉淀取沉淀物干燥后得粗酶；或将粗酶用透析膜透析除盐，用碱调pH至碱性，离心后取上清液经层析后再经干燥得精酶，该酶的等电点在pH3．99，分子量为4．4万道尔顿。
2．按照权利要求1所述桄榔植物蛋白酶的提取方法，其特征是采用砂糖椰子的茎、果柄、果皮和果肉作原料。
3．按照权利要求1或2所述桄榔植物蛋白酶的提取方法，其特征是采用已充分长大，但又未成熟变软果实的果肉。
4．按照权利要求1所述桄榔植物蛋白酶的提取方法，其特征是用25-35％饱和度硫酸铵加入汁液去杂，然后上清补足50％饱和硫酸铵取沉淀。
5．按照权利要求1所述桄榔植物蛋白酶的提取方法，其特征是用氢氧化钠或碳酸氢钠或氢氧化铵或铵水调pH至9．5沉降。
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