CN102229890A - 一种复合蛋白酶及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合蛋白酶及其制备方法和用途。本发明还公开了产生该复合蛋白酶的新的弗氏链霉菌菌株。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.4186。本发明还公开了该微生物的获得方法及其用途。

Description

一种复合蛋白酶及其制备方法和用途

技术领域

本发明主要涉及微生物学和生物化学领域，更具体的，本发明涉及一种新颖的弗氏链霉菌菌株及其所产复合蛋白酶的性质和用途。

背景技术

角蛋白是一种双键结构十分牢固蛋白质，其化学成分与一般蛋白质一样，其特点是分子形状似纤维，由多个肽链平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们集聚成为不溶性的动物蛋白质。角蛋白组分可分为α型和β型。a-角蛋白是角蛋白的优势形式，α-角蛋白存在于毛发、羊毛、羽毛、羽茎、指甲、蹄、角等结构蛋白中，具有很好的伸缩性能。β-角蛋白富含甘氨酸，丙氨酸、丝氨酸和一些由酪氨酸、脯氨酸、组氨酸组成的大侧链，在自然界中以天然存在的蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白为代表。

角蛋白以各种动物的毛发、羽毛、蹄、角等作为主要形式大量存在于自然界中，是一种抗性很强的硬蛋白，不溶于水、稀酸或稀碱溶液，也不易被大多数蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)所水解。角蛋白是禽类加工中产生的废弃物之一羽毛中的主要成分，其粗蛋白含量可达89-97％，而其中约有85-90％的蛋白质为角蛋白，并且富含多种动物所需要的必需氨基酸另外，还含有常量元素、微量元素以及一些未知的生长因子。因此羽毛蛋白是一种非常有应用前景的饲料蛋白源，但由于角蛋白的特殊结构，在动物体内很难被直接消化利用。以往用高温高压蒸煮或酸、碱水解的方法虽然可以改善蛋白质的消化率，但存在能耗大，产品的营养质量易被破坏，三废不易处理，环境污染严重等问题。角蛋白酶是一类能够高效水解天然角蛋白的酶类，可显著提高角蛋白的消化率，并且有些角蛋白酶还同时对除角蛋白外的多种蛋白质有水解作用。

在饲料工业中，角蛋白酶可将羽毛、猪毛等废弃物转化为高营养的饲料蛋白。利用角蛋白酶可有效的解决这一问题，它的优点在于更为经济，提高废弃角蛋白的利用率，同时产品营养价值好，而且无污染。我国的羽毛资源及其丰富，年产量数十万吨，但目前这部分优良的蛋白源未能得到有效利用，既造成了资源的浪费，又污染环境，而我国饲料蛋白资源严重匮乏，按照我国饲料工业的发展规划，到2010年饲料蛋白的缺口将达到800万吨。因此，羽毛蛋白饲料资源的开发与利用有着及其重要的意义。

角蛋白酶的研究工作已有几十年的历史，自然界中许多微生物均能分泌角蛋白酶，能特异性的分解角蛋白，使其降解为多肽和氨基酸。自1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌(Equina)能分解角蛋白以来，已先后发现30余种微生物具有降解角蛋白能力，包括细菌中的地衣芽孢杆菌(Bacilcuslincheniformis)、嗜热杆菌(thermophilic Bacillu)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和嗜热厌氧菌闪光杆菌(Fervidobacterium pennavorans)，放线菌中的弗氏链霉(Streptomyces fradiae)、密旋链霉菌(Streptomyces pactum)、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)、纯白高温放线菌(Thermoactinomyces candidus)和嗜热禾生链霉菌(Thermotolerant Streptomycesgraminofacients)及真菌中的须发藓菌(Trichophyton mentagrophytes)、串孢属菌(Catenularia sp)和烟曲霉(spergillus fumigatus)等等。这些微生物对自然界中的羽毛、毛发、蹄足等角蛋白有一定的降解和转化能力。

国内对角蛋白酶的研究还基本停留在产角蛋酶菌的分离、筛选，以及酶学性质的初步研究，但未对这些菌株产生的蛋白酶系进行系统的分析和纯化，不能确定这些菌株分解角蛋白的能力是由一种酶实现的，还是由包括角蛋白酶在内的混合蛋白酶完成的；并且这些菌株的产酶水平及其所产蛋白酶的性能都难以到达产业化应用的要求。因此，到目前为止，国内还未有角蛋白酶的商品化生产和实际应用。

国外已进行了大量的角蛋白酶分解菌筛选、角蛋白酶的分离提纯的工作，分子生物学上研究则主要集中于对地衣形芽孢杆菌的角蛋白酶因研究，不但已测出序列，而且已成功地转subtilis菌株及E.coli中，得到较好的结果。但由于其所得到的均为单一的角蛋白酶，从而使其应用效果和应用范围都受到了很大的限制。

研究发现，肽与蛋白质相比，具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，低分子肽不会产生过敏反应等优点。除此之外，还具有众多的生理活性，如促进发酵、抗氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳、促进乙醇代谢等活性。而且与氨基酸和蛋白质相比，更易被人体吸收利用。生物活性肽早期主要从动物、植物及昆虫等生物体内分离提取，但其具有含量少、周期长、成本高等缺点。随着科学的发展与进步，科学家逐渐注意到：在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的方法水解这些多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生物活性肽，为能生产出更好满足人类保健需要的食品基料提供了新的机遇。

蛋白质水解物生产方式多种多样，包括化学法、生物法与合成法，其中化学法是利用酸碱水解蛋白。但反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构型，产生了有毒物质已处于被淘汰边缘。与酸水解和碱水解比较，酶法水解蛋白质具有多种优点：蛋白质的酶水解是一种不完全、不彻底的水解，其产物主要是肽而不是氨基酸。反应条件温和，反应时间短，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物易分离，成本低。而通过基因工程、化学合成的方法生产生物活性肽需要相当大的投入，且其安全性还需要进行研究。因此酶法水解蛋白质制备活性肽是目前生产活性肽的主要方法。反应产物与原料蛋白、相同组成的氨基酸相比具有特殊的理化性能与生理功能，所以肽基蛋白水解物成为蛋白制品的发展方向。

生物方法生产肽类制品时，底物的选择主要是基于蛋白的营养价值、成本、口感、抗原性、溶解性和功能性，目前较常用的原料包括酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白(大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白及黄豆粉等)、胶原蛋白(鱼鳞、猪皮等)、玉米蛋白(DDGS、DDG、玉米淀粉加工后的下脚料等)、大米蛋白(米糟)以及茶蛋白(茶渣)。尽管这些蛋白原料价格相对便宜，但其大部分为工业生产的下脚料及废弃物，其中的蛋白含量相对较少，且难以被普通的蛋白酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)水解消化，并且蛋白原料中所含的非蛋白组分会影响蛋白的水解、水解产物的风味和质量。为提高产品转化率、底物原料利用率、改善水解产物的风味和质量(如底物中的糖与蛋白质及多肽的美拉德反应等)，底物的预处理必不可少。通常要对蛋白原料中的蛋白质进行提纯，提高底物的蛋白质纯度，尽量的除去其余的杂质。

酶是决定底物利用率、产品性能的主要因素，内肽酶可以降低产品中游离氨基酸的相对含量，外肽酶能选择作用于疏水性氨基酸，去掉或减轻产物中的苦味。为提高底物转化率，并保证好产品风味与高的产品质量，需要合理的将内肽酶和外肽酶配合使用，但酶的复配使用工艺复杂(对于不同的蛋白底物，需要不同的内肽酶和外肽酶种类，并且还要调整内肽酶和外肽酶的复配比例)，且成本较高。并且在复配过程中，由于不同酶的最适作用条件不同，以及不同酶之间的相互作用，往往会使复配酶解达不到理想的作用效果。

因此，本领域还需要提供有效的复合型蛋白水解酶。

发明内容

本发明旨在提供一种有效的复合型蛋白水解酶。

在本发明的第一方面，提供了一种弗氏链霉菌，所述弗氏链霉菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.4186。

在本发明的第二方面，提供了如上所述的本发明提供的弗氏链霉菌菌株和/或其代谢产物的用途，用于制备复合蛋白酶。所述的复合蛋白酶可分解角蛋白、或含有角蛋白的物质，所述的含有角蛋白的物质选自羽毛、兽角、或蹄。

在本发明的第三方面，提供了一种用于水解蛋白质的组合物，所述的组合物含有如上所述的本发明提供的弗氏链霉菌菌株和/或其代谢产物。

较佳地，所述的组合物含有6种蛋白酶，它们的分子量分别为20KDa±5KDa、30KDa±5KDa、35KDa±5KDa、40KDa±5KDa、67KDa±5KDa和100KDa±5KDa。

在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的用于水解蛋白质的组合物的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)在含有如上所述的本发明提供的弗氏链霉菌菌株的培养物中分离得到如上所述的本发明提供的用于水解蛋白质的组合物；或

(a′)在含有如上所述的本发明提供的弗氏链霉菌菌株的培养物中将细胞破壁或裂解，在所得到的裂解液中分离得到如上所述的本发明提供的用于水解蛋白质的组合物。

在上述制备方法中，所述含有如上所述的本发明提供的弗氏链霉菌菌株的培养物中含有角蛋白、大豆分离蛋白、胶原蛋白、和/或谷原蛋白或其水解物；所述的角蛋白包括羽毛、毛发、兽角、和/或蹄。

在本发明的第五方面，提供了一种蛋白质的水解方法，所述的方法包括步骤：

(i)将如上所述的本发明提供的弗氏链霉菌菌株和/或其代谢产物和角蛋白和/或含有角蛋白的物质在40℃至90℃、pH4至11下进行混合；或

(i′)将如上所述的本发明提供的用于水解蛋白质的组合物和角蛋白和/或含有角蛋白的物质在40℃至90℃、pH4至11下进行混合；

所述的含有角蛋白的物质选自羽毛、毛发、兽角、或蹄。

在另一优选例中，所述混合在厌氧条件下进行。

本发明提供的水解方法中，在混合前将所述含有角蛋白的物质在小于等于120℃或/和pH≥10的条件下进行预处理。

本发明提供的水解方法中，，在混合中以所加的角蛋白和/或含有角蛋白的物质在5-6小时后至少溶解60％的酶加量。

据此，本发明提供了有效的复合型蛋白水解酶。

附图说明

图1是本发明菌株的菌体及孢子染色图。

图2是本发明菌株的平板菌落图。

图3是本发明菌株的菌体生长曲线。

图4是本发明菌株发酵过程中角蛋白酶活力增长曲线。

图5是本发明菌株发酵过程中发酵液上清的SDS-PAGE图；其中

M为分子量标记(Molecular Mark)，1为24小时发酵液上清，2为32小时发酵液上清，3为36小时发酵液上清，4为40小时发酵液上清，5为44小时发酵液上清，6为48小时发酵液上清，7为52小时发酵液上清，8为56小时发酵液上清，9为60小时发酵液上清，10为64小时发酵液上清。

图6是本发明菌株产生的复合蛋白酶对羽毛的分解实验图；其中

A是酶解前，B是酶解3小时，C是酶解6小时，D是酶解9小时。

图7显示了本发明菌株分泌的复合蛋白酶对角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白和大豆分离蛋白底物的最适反应pH；其中A是对角蛋白底物的，B是对胶原蛋白底物的，C是对酪蛋白底物的，D是对大豆分离蛋白底物的。

图8显示了本发明菌株分泌的复合蛋白酶对角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白和大豆分离蛋白底物的pH稳定性；其中A是对角蛋白底物的，B是对胶原蛋白底物的，C是对酪蛋白底物的，D是对大豆分离蛋白底物的。

图9显示了本发明菌株分泌的复合蛋白酶对角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白和大豆分离蛋白底物的最适反应温度；其中A是对角蛋白底物的，B是对胶原蛋白底物的，C是对酪蛋白底物的，D是对大豆分离蛋白底物的。

图10显示了本发明菌株分泌的复合蛋白酶对角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白和大豆分离蛋白底物的热稳定性；其中A是对角蛋白底物的，B是对胶原蛋白底物的，C是对酪蛋白底物的，D是对大豆分离蛋白底物的。

图11显示了硫酸镁、氯化钙、硫酸钠和硫酸钾对本发明菌株分泌的复合蛋白酶活力的影响；其中A是硫酸镁的，B是氯化钙的，C是硫酸钠的，D是硫酸钾的。

图12显示了硫酸镁、氯化钙、硫酸钠和硫酸钾对复合蛋白酶活力的影响；其中A是硫酸钠的，B是硫酸钾的，C是氯化钙的，D是硫酸镁的。

图13是本发明菌株分泌的复合蛋白酶分离纯化后所得主要组分的SDS-PAGE图；其中

1为分子量标记(Molecular Mark)，2为纯化样品MQ5，3为纯化样品MQ2，4为纯化样品MQ1，5为纯化样品MQ3，6为纯化样品MQ4，7为纯化样品MQ6。

图14是羽毛角蛋白酶解液凝胶色谱图(Superdex Peptide 10/300GL)。

图15是羽毛角蛋白酶解液质谱图。

图16是胶原蛋白酶解液凝胶色谱图(Superdex 75 10/300GL)。

图17是大豆分离蛋白酶解液凝胶色谱图(Superdex Peptide 10/300GL)。

图18是大豆分离蛋白酶解液质谱图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，找到了一种能够分泌复合蛋白酶的弗氏链霉菌菌株(保藏号为：CGMCC No.4186)，发明人又称其为Streptomycesfradiae FB201或FB201。多种试验表明，本发明提供的弗氏链霉菌菌株具有强的蛋白水解能力，能在比较短的时间内分解天然产物中的多种硬蛋白，如角蛋白、胶原蛋白、大豆分离蛋白、谷原蛋白及茶蛋白等，并且该菌种具有高的蛋白酶组合物表达水平。因而，发明人通过该种微生物还分泌得到了一种酶组合物——复合蛋白酶，该酶组合物同样具有强的蛋白水解能力，有很好的pH稳定性和热稳定性，有高的比活力，并且同时具有外肽酶和内肽酶活性。基于此完成了本发明。

如本文所用，术语“本发明的弗氏链霉菌菌株”、“本发明提供的弗氏链霉菌菌株”、“复合蛋白酶的产生菌Streptomyces fradiae FB201”、或“FB201”可互换使用，都是指分类命名为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的菌种，该菌株属于链霉菌属，保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年9月17日，保藏号为CGMCC No.4186。

如本文所用，术语“本发明的酶组合物”、或“复合蛋白酶”可互换使用，都是指经FB201分泌得到的具有酶解蛋白质作用的多种酶的组合。

本发明所述的弗氏链霉菌菌株FB201是通过以下方法获得：

(1)菌株的分离与筛选：从养鸡厂周围富含羽毛的土壤中采样，以羽毛粉琼脂平板进行富集筛选，即先用无菌水将土壤样品制成菌悬液，然后再以不同的稀释度涂平板，30℃培养3天；挑选有明显透明圈的单菌落，用羽毛粉琼脂斜面划线分离纯化3-5次，纯化后的菌株用改良后的高氏1号培养基进行扩培，分别取扩培后的菌株接入以羽毛粉为唯一碳源和氮源的液体培养基(1％羽毛粉，0.05％NaCl，0.03％K₂HPO₄，0.04％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄·7H₂O；pH7.2-7.5)中，37℃、150rpm培养2-3天，进行进一步的筛选；取摇瓶发酵后的培养液上清，以偶氮角蛋白为底物，用欧洲标准法(如Tomarelli RM，Charney J(1949)The use of azoalbumin as a substrate in the colorimetric determinationof peptic and tryptic activity.J Lab Clin Med 34：428-433)测定角蛋白酶活力，挑选出高酶活的菌株；

(2)将以上筛选出的高酶活菌株在改良高氏1号培养基斜面上进行富集培养，收集孢子，用无菌的磷酸盐缓冲液制成孢子悬液，然后用NTG进行诱变处理，用羽毛粉琼脂平板筛选出正突变的菌株，用羽毛粉琼脂斜面划线分离纯化3-5次，再用摇瓶发酵进行复筛，最终分离筛选到角蛋白酶的高产菌株；

(3)筛选得到的角蛋白酶高产菌株，其所分泌的角蛋白酶是一种复合酶，对多种不同的蛋白质底物都表现出很好的水解能力。并且若在发酵过程中加入相应的蛋白质底物作诱导，可明显提高发酵所产复合蛋白酶液对该种蛋白底物的酶活力和水解能力。

分离筛选所用的培养基为：

羽毛粉琼脂(g/L)：NH₄Cl 0.5，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.3，KH₂PO₄ 0.4，MgSO₄·7H₂O0.1，酵母膏0.1，羽毛粉10，琼脂20(pH7.2-7.5)。

改良高氏1号培养基(g/L)：KNO₃ 1，可溶性淀粉10，玉米淀粉5，糊精5，K₂HPO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，NaCl 0.5，FeSO₄ 0.01，琼脂20(pH7.2-7.4)。

摇瓶发酵培养基(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 1.4，KH₂PO₄ 0.35，MgSO₄·7H₂O 0.5，CoCL₂ 10ppm，羽毛10(pH7.0-7.2)。

菌株的初步鉴定：

根据《放线菌的分类和鉴定》、《链霉菌鉴定手册》以及《微生物学实验手册》对其进行形态特征、培养特征和生理生化测定等方面的初步鉴定。

菌株为革兰氏阳性放线菌，气丝淡洋红至肉桂褐，孢子丝直、柔曲至螺旋型，孢子卵圆形、长圆形、柱形，表面光滑，不产生黑色素。能在14-42℃温度范围内生长，最适生长温度为31-35℃，生长pH为5-11，最适生长pH为7-8。

蔗糖硝酸盐琼脂：气丝落英淡粉色和粉色，基丝无色和微黄色，在大部分培养基内无可溶色素。

克氏合成1号琼脂：气丝荷花白色，基丝麦芽糖黄色，可溶色素无和淡黄色。

葡萄天冬素琼脂：气丝落英淡粉色，基丝微黄色。

高氏合成1号琼脂：气丝荷花白色、浅粉色，基丝淡黄色。

淀粉合成琼脂：气丝微白色，基丝无色。

瓦氏肉汤琼脂：气丝白色，基丝无色或风帆黄色。

高氏有机2号琼脂：气丝无或很少，微白色，基丝微黄色或淡锈色。

马铃薯琼脂：气丝粉白色或粉色，基丝浅风帆黄色或山鸡褐色，可溶色素芒果棕色或淡栗棕色。

马铃薯块：无气丝，基丝橙色，无可溶色素。

明胶液化，无色素。牛奶凝固并迅速胨化。淀粉水解。纤维素上生长，硝酸盐还原，不产生类黑色素和H₂S。

利用葡萄糖、D-果糖、蔗糖、以及D-半乳糖、D-甘露糖、麦芽糖、淀粉、甘油、乙酸钠、柠檬酸钠，不利用D-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、棉子糖、肌醇、甘露醇以及乳糖、D-山梨醇、草酸钠。

对该菌的16s rRNA进行了测定(上海生工)，并通过使用BLAST和多序列比对程序CLUSTAL W比对该菌的16s rRNA序列和在GenBank中的参考序列。结果显示，其16s rRNA的碱基序列与Streptomyces fradiae NBRC 12176、NBRC13439和NBRC 3360等之间具有99％的一致性。基于所选菌株的形态、生理生化特性和16s rRNA的研究结果，确定该菌株为Streptomyces fradiae的一个新的亚种。

菌株的发酵：

用冷冻管保存的菌悬液或试管斜面接装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，置于恒温摇床上30℃、200rpm培养17-20h后，全部接入装有2.5L发酵培养基的5L的发酵罐中，37℃、150rpm发酵2-3d。发酵液离心，收集上清液，即为复合蛋白酶液，置于4℃保存。

所用培养基为：

种子培养基(g/L)：可溶性淀粉5，玉米淀粉2.5，糊精5，K₂HPO₄·3H₂O1.4，KH₂PO₄ 0.35，MgSO₄·7H₂O 1，NaCl 0.5，蛋白胨20，酵母粉2，CaCO₃ 0.5，CoCL₂ 10ppm(pH7.2)。

发酵培养基(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 1.4，KH₂PO₄0.35，MgSO₄·7H₂O 0.5，CoCL₂ 10ppm，羽毛10(pH7.0-7.2)。

另一方面，本发明筛选到的弗氏链霉菌菌株FB201及由其产生的复合蛋白酶均有良好的活性，故而由该微生物得到的酶组合物，对各种蛋白质，尤其对角蛋白或含角蛋白的物质也具有良好的体外活性。因此，由该微生物分离出来的酶组合物也可以使用。

FB201所产生的粗酶液是一种复合蛋白酶，具有很好的复合蛋白酶性质及强的蛋白水解能力，其最适pH为9.0左右，最适温度为50℃，具有很好的pH稳定性和热稳定性。在不同的pH条件下保温1小时后，在pH5.0至pH9.0的范围内残余酶活在80％以上，在pH3.0至pH11.0的范围内，残余酶活在50％以上；在pH8.5至pH9.5的范围内50℃作用1小时，残余酶活在70％以上，60℃作用1h，残余酶活约为20％。

本发明所得到的菌株还可用来分离编码角蛋白酶的基因及、或用来插入另一种微生物中编码的角蛋白酶的基因。在这种情况下，关系到相似的按经验实施或可实施的方法，其中将源自该菌株编码角蛋白酶的基因嵌入到大肠杆菌、芽孢杆菌或酵母中，然后培育，以获取角蛋白酶。

不论是本发明提供的弗氏链霉菌菌株，还是用本发明的酶组合物，都不仅可以处理不溶性的蛋白质，而且也可以处理可溶性蛋白质。分解可进行得很完全。在一般情况下，酶解除了会产生个别氨基酸外，大部分的酶解产物均为具有生物活性的短肽。

用本发明的酶组合物及本发明的方法水解蛋白质，尤其是硬蛋白(如角蛋白、大豆分离蛋白、谷原蛋白、胶原蛋白等)，所产生的低聚肽及寡肽具有很好的理化性质和生物活性，并且无苦味产生。

本发明的酶组合物，可从含本发明提供的弗氏链霉菌菌株的培养物中分离掉培养基残余物，并在必要时，加以浓缩而得到。也可从含有该微生物菌株的培养物中洗去细胞而得到酶组合物。为了得到所述种类的酶组合物，在菌种培养或发酵过程中加入相应的蛋白质底物，以产生诱导作用，则更为有利。

本发明的酶组合物可以含有一种或多种酶，并且具有蛋白酶活性，同时具有以下的一些酶学特性：

最适温度值(pH9.0时)在40-70℃范围内，尤其在50℃时。

最适pH值(温度50℃时)在pH7.0至pH11.0的范围内，尤其在pH9.0处。

pH8.5至pH9.5的范围内，50℃作用1小时，残余酶活在70％以上；60℃作用1小时，残余酶活约为20％。

温度45℃至55℃，在pH5.0至pH9.0的范围内作用1小时，残余酶活在80％以上；在pH3.0至pH11.0的范围内作用1小时，残余酶活在50％以上。

经过分离纯化证明，该复合蛋白酶体系中至少有6种不同的蛋白酶分子，SDS-PAGE及凝胶分子筛表明其分子量分别约为20KDa、30KDa、35KDa、40KDa、67KDa和100KDa。

下列抑制剂在所述浓度下对酶活力的抑制效果如下：

本发明的酶组合物及本发明的方法可以同其他酶或酶组合物，在稳定性相当的情况下，直接结合使用。此外，也可在先或在后结合使用。即可先用本发明的酶组合物及本发明的方法将大分子的蛋白质，尤其是不溶性的蛋白质水解成可溶性肽，进而促使其继续分解成寡肽或氨基酸。

本发明提供的复合蛋白酶对多种高抵抗性的硬蛋白均表现出较强的水解活性，同时具有内切蛋白酶活性，氨肽酶及羧肽酶的外切蛋白酶活性：

底物名称	酶活力(U/ml)
		偶氮角蛋白	35
角蛋白粉	1357
		胶原蛋白	6487
大豆分离蛋白	4565
		酪蛋白	8385

蛋白酶组合物反应体系中的pH及温度对不同蛋白质底物的酶活性有不同的影响；不同的金属离子及蛋白酶抑制剂对酶组合物的角蛋白酶活性及普通蛋白酶活性均表现出不同的激活与抑制作用；测得蛋白酶组合物的内切酶活力为6560U/ml，氨肽酶活力为3476U/ml，羧肽酶活力为102U/ml。这些结果充分表明，本发明分离筛选得到的角蛋白酶产生菌，所表达分泌的蛋白酶组合物，是一种复合蛋白酶，并且这种结论在蛋白酶组合物分离纯化的过程中得到进一步的证实。

本发明的酶组合物可由一种或多种酶组成。如果这种酶组合物从含有本发明新微生物的混合培养物中获得，则也可以含有其他微生物的异种酶。

在多次试验中，测定了该种酶组合物的蛋白酶活性，同一样品不同批次测定的结果并无明显差异(差别＜5％)，说明酶活性测定稳定。将该酶组合物置于30℃及40℃3d，每隔12h取样一次，测定蛋白酶活力，在1-3天之间未发现大的活性衰减(＞10％)，即说明该蛋白酶组合物稳定。将该蛋白酶组合物在未加任何防腐剂及、或采取任何防腐措施的情况下，置于4-10℃下2-3个月，未发现有腐败、变质的现象出现，并且蛋白酶活性也没有大的衰减，说明该蛋白酶组合物稳定，而且有一定的抗菌能力。

在使用金属离子考察其对酶组合物蛋白酶活性的影响时，先将金属离子用高纯水配制成母液，常规金属盐的母液浓度为1-2mol/L，重金属盐的母液浓度为50-100mmol/L，将金属盐的母液与酶组合物按照一定的比例混合(具体比例由金属离子的终浓度决定)后，于室温下温育1h，然后加入相应的蛋白质底物，在其最适反应条件下反应40min，用10％的TCA终止反应后，按照蛋白酶活性测定方法测定剩余酶活力。

在使用抑制剂测定酶组合物中蛋白酶活性中心时，先将抑制剂配制成浓度较高的母液，在将抑制剂的母液与酶组合物按照一定的比例混合(具体比例由抑制剂的终浓度决定)后，于室温下温育1h，然后加入相应的蛋白质底物，在其最适反应条件下反应40min，用10％的TCA终止反应后，按照蛋白酶活性测定方法测定剩余酶活力。下面是所用的抑制剂母液：

PMSF	50mmol/L	溶于乙醇中
			EDTA	100mmol/L	溶于高纯水中(调pH至8.0)
碘代乙酸钠	200mmol/L	溶于高纯水中
			pCMB	50mmol/L	溶于稀碱液中(0.05N NaOH)
DTT	50mmol/L	溶于高纯水中
			SDS	500mmol/L	溶于高纯水中

另一方面，本发明提供了用一种或多种酶将肽或蛋白质，尤其将角蛋白或羽毛、毛发或兽角、蹄之类含角蛋白物质水解成低聚肽及、或氨基酸的方法，是将一种含有一个编码的蛋白酶或、及肽酶基因，尤其角蛋白酶基因插入其他微生物中，尤其嗜中温微生物中，在≥40℃时，于水介质中同肽或蛋白质，尤其与角蛋白或含有角蛋白的物质反应；或者将该微生物在水培养基中，在≥40℃的条件下培养，并将所得的培养液在必要时分离处沉淀组分后，与肽或蛋白质，尤其与角蛋白或含角蛋白的物质混合。

所述的水解方法在溶掉≤15％不溶性底物后，将水解产物与剩余底物一起干燥、粉碎，制成蛋白粉，作为饲料及食品添加剂。

所述的水解方法在溶掉至少70％所用的不溶性底物后，将水解产物用一种或多种肽酶进一步处理。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的弗氏链霉菌具有优异的分解多种蛋白的能力，且其分泌的复合酶也具有这样的能力。

(2)本发明的弗氏链霉菌分泌的复合酶生物活性优异。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

在本发明的实施例中，实验条件为：

1.材料

keratin azure，keratin，BAPNA(苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺)，LNA(L-亮氨酸-对硝基苯胺)，马脲酰-L-精氨酸，均购自Sigma公司；大豆分离蛋白，酪蛋白，购自上海生工。

2.试剂

实验所用试剂均为市售的分析纯试剂。

3.本发明中所用到的微生物和生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：张国政等，微生物初筛实验技术(河南科学技术出版社，1990)；阎逊初等，放线菌的分类和鉴定(北京科学出版社，1992)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版，科学出版社，2008)；朱检等，生物化学实验[M](上海科学技术出版社，1995)。

实施例1

复合蛋白酶产生菌株的分离和筛选

1)从福建养殖厂周围富含羽毛的垃圾土壤、下水道淤泥及阴沟水中采样，以羽毛粉为唯一碳、氮源进行连续富集培养。取10g土样于250ml的三角瓶中，用100ml无菌水使其充分悬浮，制成菌悬液，然后再以不同的稀释度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)涂羽毛粉琼脂平板，羽毛粉琼脂培养基由(g/L)：NH₄Cl0.5，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.3，KH₂PO₄ 0.4，MgSO₄·7H₂O 0.1，酵母膏0.1，羽毛粉10，琼脂20(pH7.2-7.5)组成，于30℃倒置培养3d。挑选有明显透明圈的单菌落，用羽毛粉琼脂斜面划线分离纯化3-5次，纯化后的菌株用改良后的高氏1号培养基进行富集培养，改良高氏1号培养基由(g/L)：KNO₃ 1，可溶性淀粉10，玉米淀粉5，糊精5，K₂HPO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，NaCl 0.5，FeSO₄ 0.01，琼脂20(pH7.2-7.4)组成。分别取富集培养后的菌株接入以羽毛粉为唯一碳源和氮源的液体培养基中，37℃、150rpm培养2-3天，进行进一步的筛选，筛选培养基由(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 1.4，KH₂PO₄ 0.35，MgSO₄·7H₂O0.5，羽毛10(pH7.0-7.2)组成。

2)将以上筛选出的高酶活菌株在改良高氏1号培养基斜面上进行富集培养，其菌体形态和菌落形态分别如图1及图2所示，收集孢子，用无菌的磷酸盐缓冲液制成孢子悬液，然后用NTG进行诱变处理，用羽毛粉琼脂平板筛选出正突变的菌株，用羽毛粉琼脂斜面划线分离纯化3-5次，再用摇瓶发酵进行复筛，摇瓶发酵培养基由(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 1.4，KH₂PO₄ 0.35，MgSO₄·7H₂O 0.5，CoCL₂ 10ppm，羽毛10(pH7.0-7.2)组成，37℃、150rpm培养2-3天后，发酵培养基中的羽毛的羽小枝已全部脱落，且被完全水解，只剩下残缺的羽梗。取筛选所得的培养液上清，以偶氮角蛋白为底物，用欧洲标准法(Tomarelli RM，Charney J(1949)The use of azoalbumin as a substrate in the colorimetricdetermination of peptic and tryptic activity.J Lab Clin Med34：428-433)测定角蛋白酶活力，挑选出高酶活的菌株，最终分离筛选到角蛋白酶的高产菌株。

筛选得到的菌株Streptomyces fradiae FB201于2010年9月17日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4186。

3)筛选得到的角蛋白酶高产菌株，有很强的角蛋白水解能力，并且有高的角蛋白酶表达量。

筛选所得到的菌株具有下列的分解性质：

底物	分解
		葡萄糖	+
D-果糖	+
		蔗糖	+
D-半乳糖	+
		D-甘露糖	+
麦芽糖	+
		淀粉	+
糊精	+
		纤维素	+
明胶	+
		甘油	+
乙酸钠	+
		柠檬酸钠	+
D-阿拉伯糖	-
		D-木糖	-
L-鼠李糖	-
		棉子糖	-
肌醇	-
		甘露醇	-
D-山梨醇	-
		草酸钠	-
乳糖	-
		硝酸盐	+
革兰氏染色	革兰氏阳性

菌株发酵所得的酶组合物，对多种不同的蛋白质底物都表现出很好的水解能力：

底物	分解
		酪蛋白	+
羽毛角蛋白	+
		丝蛋白	+
玉米谷原蛋白	+
		大米谷原蛋白	+
大豆蛋白	+
		茶蛋白	+
胶原蛋白	+
		乳清蛋白	+
肌纤维蛋白	+
		毛发	+
动物蹄、角	+

并且若在发酵过程中加入相应的蛋白质底物作诱导，可明显提高发酵所产酶组合物对该种蛋白底物的酶活力和水解能力。如向发酵培养基中加入0.1-0.2％的大豆分离蛋白，发酵后所得的酶组合物对大豆分离蛋白底物的酶活力可提高2-3倍。

实施例2

复合蛋白酶的制备

取实施例1筛选所得高性能的复合蛋白酶产生菌株，划线接种于改良高氏1号斜面上，置于恒温生化培养箱中，于37℃下培养2-3天，待斜面上长出厚厚的菌苔，且菌苔表面呈现出浅的粉红色，取出，置于4℃冰箱中保存备用，否则继续进行培养。改良高氏1号培养基由(g/L)：KNO₃ 1，可溶性淀粉10，玉米淀粉5，糊精5，K₂HPO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，NaCl 0.5，FeSO₄ 0.01，琼脂20(pH7.2-7.4)组成。

挑取部分上面培养所得菌苔，接种于100ml种子培养基中，置于恒温振荡培养箱中，37℃、150rpm培养16-22h，待菌浓(OD600nm)达到0.5-0.8后，取出置于4℃冰箱中保存备用，否则继续培养。种子培养基由(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O1.4，KH₂PO₄ 0.35，MgSO₄·7H₂O 0.5，羽毛10(pH7.0-7.2)组成。

将培养所得的100ml种子接入到2500ml发酵培养基中，在5L的自动控制发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基由(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 1.4，KH₂PO₄ 0.35，MgSO₄·7H₂O 0.5，CoCL₂ 10ppm，羽毛10(pH7.0-7.2)组成，发酵条件为37℃、150rpm，培养8-10h后，以20ml/h的流加速度补入500ml 1w/v％的葡萄糖溶液，然后继续培养40-62h，至培养液的pH上升至8.7-9.0，且培养液中无明显可见的羽毛残渣时，停止培养，取出培养液于10000rpm下离心5min，收集上清液即为复合蛋白酶液。

在发酵过程中，从12小时开始，每隔4小时取样一次，分别测定发酵液中的菌体浓度和角蛋白酶活力，并绘制菌体生长曲线和酶活力增长曲线，如图3和图4所示。将取出的发酵液10000rpm离心5min，取上清液进行SDS-PAGE，结果如图5所示。由图3可知，该菌株在发酵24小时开始进入对数生长期，52小时开始进入稳定期；由图4可知，随着发酵时间的变化，角蛋白酶活性也在不断增长，角蛋白酶活性在60小时达到619U/mL，可见，该菌株有很高的生产能力。

先用少量蒸馏水将整根羽毛润湿，然后将羽毛放入培养皿中，加入10ml蒸馏水，再加入以上所得发酵液上清5ml，置于40℃的恒温箱中水解，如此做3个平行组，分别于水解3hr、6hr、9hr后，各取出一组，将羽毛用蒸馏水清洗干净，拍照，从外观观察羽毛的降解情况，结果见图6。从图6可以看出，复合蛋白酶液对羽毛有很强的水解能力，水解3hr后，羽小枝开始降解，水解6hr后，羽小枝基本完全降解，水解9hr后，羽轴开始降解。

实施例3

蛋白酶活分析方法

(一)角蛋白酶活力测定方法

取10000rpm离心5min的酶液上清400ul于试管中，加入1.6ml 0.4％(w/v)keratin azure(对照组用相同体积的pH9.0，50mM Tris-HCl缓冲液代替)，保鲜膜封口，恒温摇床上50℃、300rev/min反应1h，5000rpm离心15min，取上清于595nm测吸光度值。

一个酶活性单位(U)定义为：595nm处吸光度值每小时增加0.1定义为1个酶活单位。

角蛋白酶活性U按照下面的公式计算：

$U=\frac{(A-A_0)}{0.4\×0.1}\×2$

式中：U——样品角蛋白酶活性，U/ml；

A——样品的测得吸光度，OD；

A₀——对照的测得吸光度，OD；

0.4——测试样品加量，ml；

2——反应体系的总体积，ml；

0.1——吸光值与酶活力的换算系数，OD/U。

由此所测出的复合蛋白酶的角蛋白酶活力为35U/ml。

(二)蛋白酶活力测定方法

取10000rpm离心5min后的酶液上清，用pH9.050mM Tris-HCl缓冲液做10倍梯度稀释，根据显色效果确定合适的试验浓度。取稀释好的酶液500ul于试管中，加入1ml 2％keratin(对照组反应前先加入TCA，其余步骤相同)，于50℃水浴中反应40min，加入2ml 5％TCA终止反应，并于室温下静置30min，取1ml反应液于1.5ml离心管中，在10000rpm离心10min，取上清500ul于另外一支试管中，加入2.5ml 0.8M Na₂CO₃溶液，混匀，再加入Folin试剂500ul，混匀后室温显色30min，660nm处测定吸光度值。

如下绘制植酸酶活力测定标准曲线：将125μg/ml的酪氨酸标准溶液用pH9.050mM Tris-HCl缓冲液稀释成0、25、50、75、100、125μg/ml，按照上述操作步骤一起反应。以酪氨酸的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，并通过回归求出曲线方程(Y＝aX+b)及相关性系数R²。

一个酶活性单位(U)定义为：在50℃，pH9.0时，1ml酶液每小时水解蛋白质底物释放出1μg酪氨酸所需的酶活力定义为1个酶活单位(1Unit)

蛋白酶活性U按照下面的公式计算：

$U=\frac{(A-A_0-b)}{0.5\×(2/3)\×a}\×3.5\×N$

式中：U——样品蛋白酶活性，U/ml；

A——样品的测得吸光度，OD；

A₀——对照的测得吸光度，OD；

0.5——测试样品加量，ml；

3.5——反应体系的总体积，ml；

2/3——反应时间，h；

a——标准曲线的斜率；

b——标准曲线的截距；

N——稀释倍数。

蛋白酶的比活力按下面的公式计算：

Uc＝U/c

其中：Uc——样品蛋白酶比活性，U/mg；

U——样品蛋白酶活力，U/ml；

c——样品溶液中的蛋白质含量，mg/ml。

将反应中的蛋白质底物分别用角蛋白粉、胶原蛋白、大豆分离蛋白或酪蛋白代替，可分别测定复合蛋白酶对角蛋白粉、胶原蛋白、大豆分离蛋白或酪蛋白底物的蛋白酶活力，所得结果如表1所示，从表中可以看出，复合蛋白酶对多种蛋白质都有很强的水解能力。

表1复合蛋白酶对不同底物的活性

底物名称	主要成分	酶活力(U/ml)
			角蛋白粉	β角蛋白	1357
胶原蛋白	胶原蛋白	6487
			大豆分离蛋白	大豆球蛋白	4565
酪蛋白	酪蛋白	8385

(三)内切蛋白酶活性

取10000rpm离心5min后的酶液上清，用pH8.250mM Tris-HCl缓冲液做10倍梯度稀释，根据显色效果确定合适的试验浓度。取稀释好的酶液1.0ml于试管中，再于试管中加入1.0ml pH8.250mM Tris-HCl缓冲液，2.5ml 0.4mg/ml的BAPNA(苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺)溶液，混合均匀，40℃水浴反应10min后，立即0.5ml 30％乙酸终止反应(对照组反应前先加入乙酸，其余步骤相同)，于410nm处测定吸光度值。

一个酶活性单位(U)定义为：在40℃，pH8.2时，1ml的酶液与0.4mg/ml的BAPNA(苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺)反应，410nm处吸光度值每min增加0.01定义为一个酶活力单位。

内切蛋白酶活性U按照下面的公式计算：

$U=\frac{(A-A_0)}{0.1\×T\×0.01}\×3.0\×N$

式中：U——样品内切蛋白酶活性，U/ml；

A——样品的测得吸光度，OD；

A₀——对照的测得吸光度，OD；

1.0——测试样品加量，ml；

5.0——反应体系的总体积，ml；

10——反应时间，min；

N——稀释倍数。

由此所测出的复合蛋白酶的蛋白内切酶活力为6560U/ml。

(四)外切蛋白酶活性

1)氨肽酶活性

取10000rpm离心5min后的酶液上清，用pH8.050mM Tris-HCl缓冲液做10倍梯度稀释，根据显色效果确定合适的试验浓度。取稀释好的酶液0.4ml于试管中，再于试管中加入6ml pH8.050mM Tris-HCl缓冲液，0.4ml 26mM的LNA(L-亮氨酸-对硝基苯胺)溶液，混合均匀，40℃水浴反应10min后，立即置于冰浴中终止反应，5min后于405nm处测定吸光度值。以相同体积的pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液代替酶液，作为空白对照。

一个酶活性单位(U)定义为：在40℃，pH8.0时，1ml的酶液与26mM LNA(L-亮氨酸-对硝基苯胺)反应，405nm处吸光度值每min增加0.01定义为一个酶活力单位。

氨肽酶活性U按照下面的公式计算：

$U=\frac{(A-A_0)}{0.4\×10\×0.01}\×6.8\×N$

式中：U——样品氨肽酶活性，U/ml；

A——样品的测得吸光度，OD；

A₀——对照的测得吸光度，OD；

0.4——测试样品加量，ml；

6.8——反应体系的总体积，ml；

10——反应时间，min；

N——稀释倍数。

由此所测出的复合蛋白酶的氨肽酶活力为3476U/ml。

2)羧肽酶活性

取10000rpm离心5min后的酶液上清，用pH7.65 50mM Tris-HCl缓冲液做10倍梯度稀释，根据显色效果确定合适的试验浓度。取稀释好的酶液0.1ml于试管中，然后加入2.9ml 1mM的马脲酰-L-精氨酸溶液，立即混合均匀，校正零点并立即计时，于254nm处测定其吸光度增值，每隔30s读数一次，5min内吸收度的增值应呈线性，否则酶液应该做适当稀释。

一个酶活性单位(U)定义为：在25℃，pH7.65时，1ml的酶液与1mM马脲酰-L-精氨酸盐溶液反应，254nm处每分钟吸光值增加0.01定义为一个酶活力单位。

羧肽酶活性U按照下面的公式计算：

$U=\frac{(A-A_0)}{0.1\×T\×0.01}\×3.0\×N$

式中：U——样品氨肽酶活性，U/ml；

A——样品的测得吸光度，OD；

A₀——对照的测得吸光度，OD；

0.1——测试样品加量，ml；

3.0——反应体系的总体积，ml；

T——反应时间，min；

N——稀释倍数。

由此所测出的复合蛋白酶的羧肽酶活力为102U/ml。

实施例4

复合蛋白酶的最适反应pH和pH稳定性

在不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的缓冲体系中，分别以角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白为底物，40℃反应条件下，按照实施例3(二)所述方法测定复合蛋白酶对各种底物的酶活力，考察pH对酶活力的影响，结果分别如图7所示，由图可知，反应体系的pH对不同蛋白底物的复合蛋白酶活力有不同的影响，其对角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白底物的最适pH为分别为9.0、9.0、9.5及8.0。

分别用不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的缓冲液将酶液(由实施例2制备)稀释10倍，于室温下静置30min，然后在40℃，分别以角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白为底物，分别在pH9.0、9.0、9.5及8.0条件下，按照实施例3(二)所述方法测定复合蛋白酶对各种底物的酶活力，并计算出残余酶活力，以未经过处理的复合蛋白酶液在相同条件下的酶活力为100％，考察复合蛋白酶的pH稳定性，结果分别如图8所示。由图可知，复合蛋白酶对不同的蛋白质底物均表现出较好的pH稳定性，在pH5.0-10.0的范围内，复合蛋白酶对角蛋白底物的残余酶活力均在70％以上；在pH5.0-11.0的范围内，对胶原蛋白底物残余酶活力均在90％以上；在pH3.0-8.0的范围内，对酪蛋白残余酶活力均在70％以上；在pH4.0-10.0的范围内，对大豆分离蛋白的残余酶活力均在65％以上。

实施例5

复合蛋白酶的最适反应温度和热稳定性

在不同反应温度(30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃)下，分别以角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白为底物，分别在pH9.0、9.0、9.5及8.0条件下，按照实施例3(二)所述方法测定复合蛋白酶对各种底物的酶活力，考察温度对酶活力的影响，结果分别如图9所示，由图可知，反应体系的温度对不同蛋白底物的复合蛋白酶活力有不同的影响，其对角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白底物的最适反应温度分别为50℃、60℃、50℃及65℃。

将酶液(实施例2所制备)于不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)下分别预处理10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min、180min，再分别以角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白为底物，分别在pH9.0、9.0、9.5及8.0条件下，按照实施例3(二)所述方法测定复合蛋白酶对各种底物的酶活力，并计算出残余酶活力，以未经过处理的复合蛋白酶液在相同条件下的酶活力为100％，考察复合蛋白酶的热稳定性，结果分别如图10所示。由图可知，复合蛋白酶对不同的蛋白质底物均表现出较好的热稳定性，对角蛋白底物，在50℃处理30min，仍有70％的残余酶活；对胶原蛋白底物，在70℃处理30min，仍有70％以上的残余酶活，在70℃处理3hr，仍有50％以上的残余酶活；对酪蛋白底物，在50℃处理60min，仍有70％以上的残余酶活；对大豆分离蛋白底物，在50℃处理60min，仍有70％以上的残余酶活，在60℃处理50min，仍有60％以上的残余酶活。

实施例6

金属离子对复合蛋白酶活力的影响

当少量的金属离子与酶分子结合，形成金属酶或金属激活酶后，能更好的保持酶的反应基团处于所需的三维取向，使酶分子稳定于催化活性构象，易于底物分子与酶催化位点的结合，对酶活性有稳定和促进的作用；但由于金属离子本身带电，当溶液中金属离子的浓度较高时(对于不同的金属离子和酶，浓度的高低有不同的含义)，就会有较多量的金属离子结合在酶分子上，改变酶分子的电负性及酶分子内部和表面的疏水性，破坏酶分子的三级、四级结构，并且过多的金属离子会对酶与底物的结合产生空间位阻效应，而导致酶活性的降低；另外一些金属离子可直接与酶的活性位点相结合，对酶有竞争性抑制作用，使酶的活性降低，甚至丧失。

(1)金属离子对复合蛋白酶角蛋白酶活力的影响

在酶反应体系中，分别将常规金属盐的母液与酶组合物(所用酶组合物，即复合蛋白酶由实施例2所制备)按照一定的比例混合(具体比例由金属离子的终浓度决定，金属离子的终浓度见表2)后，于室温下温育1h，然后加入角蛋白(keratin)底物，在pH9.0，50℃下反应40min，用10％的TCA终止反应后，按照实施例3(二)中所述角蛋白酶活性测定方法测定剩余酶活力，以未加金属离子时所测得的酶活为100％，计算出相对酶活力，考察常规金属离子对复合蛋白酶角蛋白酶活力的影响，结果如图11所示。

表2各种离子的最终浓度

在酶反应体系中，分别将重金属盐的母液与酶组合物(所用酶组合物，即复合蛋白酶由实施例2所制备)按照一定的比例混合(具体比例由金属离子的终浓度决定，重金属离子的终浓度见表3)，然后按照与上面相同的方法考察无机盐中的重金属离子对复合蛋白酶角蛋白酶活力的影响，结果如表3所示。

表3重金属离子对复合蛋白酶角蛋白酶活力的影响

由图11可知，在0-50mM的硫酸镁浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为0.1mM时，激活作用最强，酶活约增长70％；在0-50mM的氯化钙浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为1mM时，激活作用最强，酶活约增长70％；在0-500mM的硫酸钠浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为50mM时，激活作用最强，酶活约增长65％；在0-200mM的硫酸钾浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为50mM时，激活作用最强，酶活约增长45％。

(2)金属离子对普通蛋白酶活力的影响

在酶反应体系中，分别将金属盐的母液与酶组合物(所用酶组合物，即复合蛋白酶由实施例2所制备)按照一定的比例混合(具体比例由金属离子的终浓度决定，抑制剂的终浓度见表4)后，于室温下温育1h，然后加入酪蛋白底物，在pH9.0，50℃下反应40min，用10％的TCA终止反应后，按照实施例3(二)中所述蛋白酶活性测定方法测定剩余酶活力，以未加金属离子时所测得的酶活为100％，计算出相对酶活力，考察常规金属离子对复合蛋白酶活力的影响，结果如图12A、12B、12C及12D所示。

表4各种离子的最终浓度

在酶反应体系中，分别将重金属盐的母液与酶组合物(所用酶组合物，即复合蛋白酶由实施例2所制备)按照一定的比例混合(具体比例由金属离子的终浓度决定，重金属离子的终浓度见表5)，然后按照与上面相同的方法考察无机盐中的重金属离子对复合蛋白酶活力的影响，结果如表5所示。

表5重金属离子对普通蛋白酶活力的影响

由图12可知，在0-10mM的硫酸钠浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为1mM时，激活作用最强，酶活约增长25％；在0-50mM的硫酸钾浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为0.5mM时，激活作用最强，酶活约增长15％；在0-5mM的氯化钙浓度范围内，均对酶有激活作用，浓度为1mM时，激活作用最强，酶活约增长15％；硫酸镁对酶活力没有激活作用，且在0-1mM的硫酸镁浓度范围内，对酶活力没有显著影响。

由表2及表3中的结果可知，在低浓度(1mM)时，大部分的重金属离子对角蛋白酶活力并没有明显的激活或抑制作用，而对普通蛋白酶活力则都有明显的激活作用；在高浓度(10mM)时，大部分重金属离子对角蛋白活力及普通蛋白酶活力均表现出强的抑制作用。

实施例7

抑制剂对复合蛋白酶活力的抑制作用

不同抑制剂的对蛋白酶组合物的抑制作用，可以说明酶的活化中心和酶的反应机理。苯基甲基磺酰氟(PMSF)在丝氨酸蛋白酶活化中心，与丝氨酸上的羟基结合，并且不可逆的抑制后者。乙二胺四乙酸(DETA)是一种金属螯和剂，并可有效的抑制金属蛋白酶。碘乙酸钠能够不可逆的抑制半胱氨酸蛋白酶的活性。对氯汞苯甲酸(pCMB)可以与组氨酸蛋白酶活性中心的组氨酸相结合，从而不可逆的抑制组氨酸蛋白酶活性。而二硫苏糖醇(DTT)则可以有效地断裂酶分子中的二硫键，使得主要靠二硫键来维持酶分子空间结构，尤其是活性中心结构的蛋白酶活性降低，甚至丧失活性。

(1)对复合蛋白酶角蛋白酶活力的抑制

在酶反应体系中，将抑制剂的母液与酶组合物(所用酶组合物，即复合蛋白酶由实施例2所制备)按照一定的比例混合(具体比例由抑制剂的终浓度决定，抑制剂的终浓度见表6)后，于室温下温育1h，然后加入角蛋白(keratin)底物，在pH9.0，50℃下反应40min，用10％的TCA终止反应后，按照实施例(二)中所述角蛋白酶活性测定方法测定剩余酶活力，以未加抑制剂时所测得的酶活为100％，计算出相对酶活力，结果如表6所示。

表6抑制剂对角蛋白酶活力的抑制作用

(2)对复合蛋白酶蛋白酶活力的抑制

在酶反应体系中，将抑制剂的母液与酶组合物(所用酶组合物，即复合蛋白酶由实施例2所制备)按照一定的比例混合(具体比例由抑制剂的终浓度决定，抑制剂的终浓度见表7)后，于室温下温育1h，然后加入酪蛋白底物，在pH9.0，50℃下反应40min，用10％的TCA终止反应后，按照实施例3(二)中所述蛋白酶活性测定方法测定剩余酶活力，以未加抑制剂时所测得的酶活为100％，计算出相对酶活力，结果如表7所示。

表7抑制剂对普通蛋白酶活力的抑制作用

由表6及表7中的结果可知，碘代乙酸钠对角蛋白酶活力并没有明显的激活或抑制作用，而对普通蛋白酶却有较为明显的抑制作用；pCMB对角蛋白酶活力有显著的激活作用，而对普通蛋白酶则表现出较为明显的抑制作用；EDTA对角蛋白酶及普通蛋白酶均表现出弱的抑制作用；PMSF对角蛋白有弱的抑制作用，而对普通蛋白酶则有强的抑制作用；DTT对角蛋白酶显示出很强的抑制作用，而对普通蛋白酶的抑制作用则相对较弱。

实施例8

复合蛋白酶的分离纯化

(1)复合蛋白酶液预处理

取实施例2所制备复合蛋白酶液，用孔径0.1um的中空纤维微滤膜进行过滤，收集透过液，将所收集的透过液用截留分子量8KDa的中空纤维超滤膜进行过滤，收集浓缩液，再用真空旋转蒸发仪将所得浓缩液继续浓缩3-5倍。

(2)脱游离蛋白

取最终所得浓缩液与氯仿-正丁醇(V_氯仿∶V_正丁醇＝4∶1)等体积混合后，振摇5min，静置待其分层后，移去下层有机相和中间的蛋白沉淀层，取上面水层继续与等体积的氯仿-正丁醇混合，按上述方法处理后，再取出水层，如此重复3次。

最后将得到的水层用真空旋转蒸发仪浓缩后3-5倍后，装入截留分子量6-8KDa的透析袋，4℃透析过夜，透析外液为20mM pH9.0 Tris-HCl缓冲液，收集透析内液，直接冷冻干燥后，于-80℃冰箱中保存待用。

(3)常压离子交换分离

称取以上所制备的冻干粉25mg，用5ml pH8.6，50mM Tris-HCl缓冲液充分溶解后，上样DEAE离子交换柱进行分离。

色谱条件：Ф28×200mm玻璃柱；DEAE-650C填料；平衡液为pH8.6 50mMTris-HCl缓冲液，洗脱液为pH8.6 50mM Tris-HCl缓冲液(含有1M的NaCl)；0.5ml/min流速；5ml上样量；1管/12min进行收集；0-50％洗脱2CV，50-100％洗脱1CV。

对收集管中的溶液测定280nm处的吸光度值，并按照实施例3(二)中所述的方法测定蛋白酶活力，以管数或洗脱体积为横坐标，A_280nm及蛋白酶活力为纵坐标，绘制色谱图，按照谱图分别收集常压DEAE离子交换柱分离后所得到的两个组分DI和DII，将收集的两个组分真空旋转蒸发浓缩8-10倍，装入截留分子量6-8KDa的透析袋，4℃透析过夜，透析外液为20mM pH9.0 Tris-HCl缓冲液，收集透析内液，直接冷冻干燥后，于-80℃冰箱中保存待用。

(4)常压凝胶过滤分离

分别称取以上所制备DI和DII两个组分的冻干粉各5mg，用1ml pH7.6，20mM磷酸盐缓冲液充分溶解后，分别上样Sephadex G-75凝胶过滤柱进行分离。

色谱条件：Ф16×1000mm玻璃柱；Sephadex G-75填料；平衡缓冲液为pH7.620mM磷酸盐缓冲液，洗脱液为pH7.620mM磷酸盐缓冲液(含有0.1M的NaCl)；0.25ml/min流速；1ml上样量；1管/12min进行收集；100％洗脱1.5CV。

对收集管中的溶液测定280nm处的吸光度值，并按照实施例3(二)中所述的方法测定蛋白酶活力，以管数或洗脱体积为横坐标，A_280nm及蛋白酶活力为纵坐标，绘制色谱图。

按照谱图分别收集DI组分经过常压凝胶过滤柱分离后所得到的六个组分DI-GI、DI-GII、DI-GIII、DI-GIV、DI-GV和DI-GVI，以及DII组分经过常压凝胶过滤柱分离后所得到的五个组分DII-GI、DII-GII、DII-GIII、DII-GIV和DII-GV，再将所收集的11个组分真空旋转蒸发浓缩6-8倍，装入截留分子量6-8KDa的透析袋，4℃透析过夜，透析外液为20mM pH9.0 Tris-HCl缓冲液，收集透析内液，直接冷冻干燥后，于-80℃冰箱中保存待用。

(5)HPLC离子交换分离

分别称取以上所制备11个组分的冻干粉各5mg，用1ml pH8.6 20mMTris-HCl缓冲液充分溶解后，上样Mono Q HPLC离子交换柱进行分离。

色谱条件：Mono Q 4.6/100PE柱；平衡液为pH8.6 20mM Tris-HCl缓冲液，洗脱液为pH8.6 20mM Tris-HCl缓冲液(含有1M的NaCl)；1.0ml/min流速；500ul上样量；紫外检测器波长280nm；0-20％洗脱4CV，20-60％洗脱8CV，60-100％洗脱2CV。

根据HPLC上的色谱图分别收集分离后所得的各组分，对所收集的各组分按照实施例3(二)中所述的方法测定蛋白酶活力，并计算出比活力，结果见表8所示。将所收集的各组分进行SDS-PAGE分析，结果如图13所示，根据标准分子量及电泳图谱(图13)估算目标蛋白的分子量，结果见表8。

表8纯化所得主要目标酶分子的分子量和比活力

编号	分子量(KDa)	比活力(U/mg)
			MQ1	20	25036
MQ2	30	24420
			MQ3	35	36608
MQ4	40	97680
			MQ5	67	10853
MQ6	100	10745

由表8可知，复合蛋白酶液经过以上5个步骤的分离纯化，最终得到6个主要的蛋白酶组分，其分子量分别为20KDa、30KDa、35KDa、40KDa、67KDa和100KDa，比活力分别可达到25036U/mg、24420U/mg、36608U/mg、97680U/mg、10853U/mg和10745U/mg，由此可知，本发明的菌株发酵所产生的复合蛋白酶是含有至少6个蛋白酶组分的复合蛋白酶系。从图13可以看出，纯化所得的6个主要组分均为单一的条带，达到了电泳纯。

按照实施例3(二)所述方法，分别以角蛋白、胶原蛋白、酪蛋白及大豆分离蛋白为底物，以上纯化所得6个蛋白酶组分(MQ1-MQ6)的蛋白酶活力，考察6种蛋白酶组分对4种蛋白质底物的水解能力，结果如表9所示。从表中可以看出，复合蛋白酶的各蛋白酶组分对不同的蛋白质底物有不同的水解能力。组分MQ1和MQ2对胶原蛋白有很强的水解能力，对胶原蛋白底物的酶活力最高可达到6781U/ml；组分MQ3和MQ4对角蛋白有很强的水解能力，对角蛋白底物的酶活力最高可达2114U/ml；组分MQ5和MQ6对大豆分离蛋白有很强的水解能力，对大豆分离蛋白底物的酶活力最高可达到5144U/ml；组分MQ1、MQ2、MQ5和MQ6均对酪蛋白有很强的水解能力，对酪蛋白底物的酶活力最高可达到8415U/ml。由此进一步说明，本发明所得到的复合蛋白酶是一种优质、高效的蛋白酶组合酶系，对多种蛋白质都有很强的水解能力，可广泛的应用于工业生产中。

表9复合蛋白酶主要蛋白酶组分对不同蛋白质的水解作用

实施例9复合蛋白酶对角蛋白等硬蛋白的水解

将实施例2所制备的复合蛋白酶液用真空旋转蒸发仪浓缩5倍后，用于以下的酶解实验，其角蛋白酶活力为3000U/ml。

水解度DH按照下式计算：

$\mathrm{DH}(\%)=\frac{(N_2-N_1)\×V}{N_0}\×100$

式中：N₂——酶解反应后酶解液的可溶性蛋白含量，mg/mL；

N₁——酶解反应前溶液的可溶性蛋白含量，mg/mL；

N₀——参加酶解反应的大豆蛋白的总蛋白量(原料的粗蛋白含量×原料的加入量，原料的粗蛋白含量按照凯氏定氮法进行测定)，mg；

V——酶解反应液体积，mL。

(1)水解羽毛角蛋白

按固液比1∶9(w/v)将鸭毛粉与水混合，用10％(w/w)的NaOH调节pH至9.0后，升温至80℃，并在此温度下保温30min，使羽毛粉充分湿润。待温度降至40℃以下，按照羽毛粉的质量，加入5％(v/w)的复合蛋白酶浓缩液，再补加50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)至鸭毛粉与反应体系的固液比达到1∶15(w/v)。将反应体系充分混合均匀后，升温至40℃，并在此温度下搅拌(80rpm)水解28-32hr。酶解结束后，迅速升温至80℃，并保温30min，对酶进行灭活。

按照以上条件，复合蛋白酶对羽毛角蛋白的水解度可达到62-65％，酶解上清液中的可溶性蛋白含量为30-35mg/ml。凝胶过滤色谱和质谱分析的结果表明，酶解上清液中多肽的分子量均在6kDa以下(图14和图15)。

(2)水解胶原蛋白

按固液比1∶9(w/v)将胶原蛋白与50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)混合，用10％(w/w)的NaOH调节pH至9.0后，升温至50℃，并在此温度下保温30min。按照胶原蛋白的质量，加入3％(v/w)的复合蛋白酶浓缩液，将反应体系充分混合均匀后，在50℃下搅拌(80rpm)水解5-6hr。酶解结束后，迅速升温至80℃，并保温30min，对酶进行灭活。

按照以上条件，复合蛋白酶对胶原蛋白的水解度可达到84-87％，酶解上清液中的可溶性蛋白含量为61-65mg/ml。凝胶过滤色谱的结果表明，酶解上清液中多肽的分子量均在6.5kDa以下(图16)。

(3)水解大豆分离蛋白

按固液比1∶9(w/v)将大豆分离蛋白与50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)混合，用10％(w/w)的NaOH调节pH至9.0后，升温至50℃，并在此温度下保温30min。按照大豆分离蛋白的质量，加入2％(v/w)的复合蛋白酶浓缩液，将反应体系充分混合均匀后，在50℃下搅拌(80rpm)水解5-6hr。酶解结束后，迅速升温至80℃，并保温30min，对酶进行灭活。

按照以上条件，复合蛋白酶对大豆分离蛋白的水解度可达到79-82％，酶解上清液中的可溶性蛋白含量为68-73mg/ml。凝胶过滤色谱和质谱分析的结果表明，酶解上清液中多肽的分子量均在10kDa以下(图17和图18)。

由此可以看出，本发明所制备的复合蛋白酶对角蛋白、胶原蛋白和大豆分离蛋白等多种硬蛋白都有很高的水解效率，水解产物大多数为分子量1-10kDa的多肽，水解产物无苦味、无异味。

菌种保藏

本发明的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)FB201已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4186，保藏日为2010年9月17日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种弗氏链霉菌，其特征在于，所述弗氏链霉菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.4186。

2.权利要求1所述的弗氏链霉菌和/或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备复合蛋白酶。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的复合蛋白酶可分解角蛋白、或含有角蛋白的物质，所述的含有角蛋白的物质选自羽毛、兽角、或蹄。

4.一种用于水解蛋白质的组合物，其特征在于，所述的组合物含有如权利要求1所述的弗氏链霉菌和/或其代谢产物。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有6种蛋白酶，它们的分子量分别为20KDa±5KDa、30KDa±5KDa、35KDa±5KDa、40KDa±5KDa、67KDa±5KDa和100KDa±5KDa。

6.一种权利要求4或5任一所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)在含有如权利要求1所述的弗氏链霉菌的培养物中分离得到权利要求4或5任一所述的组合物；或

(a′)在含有如权利要求1所述的弗氏链霉菌的培养物中将细胞破壁或裂解，在所得到的裂解液中分离得到权利要求4或5任一所述的组合物。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有如权利要求1所述的弗氏链霉菌的培养物中含有角蛋白、大豆分离蛋白、胶原蛋白、和/或谷原蛋白或其水解物；所述的角蛋白包括羽毛、毛发、兽角、和/或蹄。

8.一种蛋白质的水解方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(i)将如权利要求1所述的弗氏链霉菌和/或其代谢产物和角蛋白和/或含有角蛋白的物质在40℃至90℃、pH4至11下进行混合；或

(i′)将如权利要求4或5所述的组合物和角蛋白和/或含有角蛋白的物质在40℃至90℃、pH4至11下进行混合；

所述的含有角蛋白的物质选自羽毛、毛发、兽角、或蹄。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在混合前将所述含有角蛋白的物质在小于等于120℃或/和pH≥10的条件下进行预处理。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在混合中以所加的角蛋白和/或含有角蛋白的物质在5-6小时后至少溶解60％的酶加量。

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