CN102961741A - 一种破伤风类毒素疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种破伤风类毒素疫苗的制备方法，该方法是以破伤风梭状芽孢杆菌菌株为原料，经过破伤风类毒素的培养、菌液分离、超滤浓缩、盐析和超滤脱盐等步骤制备而成的。本发明先将培养液进行脱毒处理，再进行精制，从而减少板框过滤除去菌体的过程中菌体和其他杂质碎片对板框膜包的堆积引起的孔道堵塞，增加过滤过程中的流畅性；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是切向流超滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的沉淀。本发明缩短了破伤风类毒素疫苗的制备时间，提高了生产效率。

Description

一种破伤风类毒素疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种破伤风类毒素疫苗的制备方法。
背景技术
破伤风类毒素是由破伤风梭菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质，由1315个氨基酸组成，分子量为150 700Da。最初用于人免疫接种的是破伤风原制类毒素，这种类毒素免疫效果好，但接种后副反应很大，甚至有过敏休克死亡的病例。这主要是在原制类毒素中存在着大量水解不完全的蛋白成分，引起过敏反应。为了减轻接种的副反应，1923年Ramon对破伤风原制类毒素进行了精制纯化，制备出了精制破伤风类毒素。通过使用观察，精制破伤风类毒素的接种后副反应比原制类毒素显著减少。
精制破伤风类毒素在生产中要进行脱毒，由于原制毒素中含有大量的培养基成分, 在脱毒过程中, 容易通过甲醛与毒素分子交联, 提纯比较困难，此外, 脱毒后的体积大, 精制操作不便。精制过程中通常采用离心机分离或过滤，但所得到的疫苗制品选择性差，质量不高，纯度低（每毫克蛋白氮含400~600个絮状单位），色泽深，用聚丙烯酰胺电泳检查，仍然是一个多种成分的混合体。
目前国内企业生产破伤风类毒素疫苗的工艺中，菌液分离、破伤风类毒素溶液的浓缩、破伤风类毒素的提纯、脱盐这些过程较为简单粗放，有些工艺不符合GMP要求，有些工艺方法在大生产条件下使用会受到限制。例如菌液分离工艺中，一般大生产要处理的体积要达到500L以上，若采用离心则不太适合，处理的时间会很长，耗费大量的劳动力；若采用帆布过滤除菌，存在过滤不彻底和帆布材料不符合GMP要求的缺陷；板框过滤的缺点是滤板易堵塞，过滤时间过长；切向流过滤不易堵塞，过滤速度也较理想，但对菌体、蛋白的剪切力可能较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种破伤风类毒素疫苗的制备方法，以提高破伤风类毒素疫苗的生产效率和产品质量。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种破伤风类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：将破伤风菌种经传代发酵，甲醛脱毒后，将培养液调节pH至6.9~7.5，过滤除去菌体，将滤液用孔径为10~40KD的超滤膜进行超滤，直至滤液的体积为原体积的1/6~1/8，再向滤液中加入质量体积比为20~30%的硫酸铵盐析，静置24小时后离心分离，将离心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔径为10~40KD的超滤膜超滤，直至滤液中硫酸铵的质量百分含量小于0.025%。
优选的，所述超滤膜的孔径为30KD，所述超滤的压力为10~15psi，流速为200~220L/小时。
优选的，向滤液中加入质量体积比为25~27%的硫酸铵盐析。
所述过滤除去菌体采用的是板框过滤。
本发明先将培养液进行除菌体处理，再进行精制，从而减少板框过滤除去菌体的过程中菌体和其他杂质碎片对板框膜包的堆积引起的孔道堵塞，增加过滤过程中的流畅性；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是超滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的沉淀。本发明缩短了破伤风类毒素疫苗的制备时间，提高了生产效率。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图；
图2是本发明中切向流超滤的工作原理图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种破伤风类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）破伤风类毒素的培养
采用的菌种为破伤风梭状芽孢杆菌，来源于中国食品药品检定研究院，菌号为CMCC64008，检定合格后使用，所述菌种的传代发酵方法如下：种子开启后，经用本领域常规手段发酵该菌株，在种子罐中34~36℃培养40小时，种子罐规格为50L，然后转入大罐培养，采用1000L的发酵系统，培养温度34~36℃，深层间歇搅拌通气法培养67小时后停止培养。发酵完成后，加入甲醛溶液至甲醛终浓度为0.35%（V/V），30~35℃保温30分钟。
2）菌液分离
取50L破伤风类毒素培养液（73Lf/ml），用NaHCO3调节pH至6.9，在压力不大于0.1Mp的情况下，用板框过滤器（型号为JGLB 400*400，重庆轻工机械厂）进行压滤以去除菌体。
3）超滤浓缩
收集滤液，将滤液用30KD超滤膜的超滤系统（超滤系统型号为Sartocon 2 plu，德国赛得利斯）进行切向流超滤浓缩，所述超滤浓缩的步骤为：
连接好超滤系统和精制罐，将超滤系统进口、回流口和废液口分别连接好，开启超滤系统；
确认系统全部阀门打开，将变频调速器调至15~20HZ左右，运转3~5分钟后再将数字调到20~45HZ，使进口与滤出口端压力差达到10~15psi，开始超滤，流速为200L/小时，收集回流端液体；
待滤液的体积为原体积的1/6时，停止超滤浓缩,关掉泵的电源开关。
4）盐析
向滤液中加入质量体积比为27%的硫酸铵盐析沉淀，静置24小时，在低温（2～8℃）离心机上离心，5020g，30min，取糊状沉淀1300ml。
5）超滤脱盐
沉淀用注射用水20000ml完全溶解后，用30KD超滤膜包进行超滤（超滤系统型号为Sartocon 2 plu）进行切向流透析，所述超滤透析的步骤为：
接好超滤系统和精制罐、储水罐，将滤出端连接在废液缸中，进口和回流端与精制罐相连，将储水罐与精制罐连接好，确认全部阀门打开；
将变频器调至15~20HZ左右，运转3分钟后，再将数字调至20~25HZ左右，使进口与滤出口端压力差达到10~15psi，开始超滤，流速为220L/小时，收集回流端液体；
超滤过程中随时观察0.9%氯化钠溶液的流入精制罐的流速要与滤出端的流速相一致，保持精制罐内毒素体积不变，期间检测样品中残余硫酸铵含量小于0.025%为合格标准，停止超滤脱盐。
得到破伤风类毒素疫苗3.2L，浓度为780Lf/ml，批号为20090101。
实施例2
一种破伤风类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）破伤风类毒素的培养
培养方法同实施例1。
2）菌液分离
取50L破伤风类毒素培养液(68Lf/ml)，用NaHCO3调节pH至7.5，在压力不大于0.1Mp的情况下，用压滤器进行压滤以去除菌体。
3）超滤浓缩
收集滤出液，将滤出液用40KD超滤膜的超滤系统进行切向流超滤浓缩，所述超滤浓缩的步骤为：
连接好超滤系统和精制罐，将超滤系统进口、回流口和废液口分别连接好，开启超滤系统；
确认系统全部阀门打开，将变频调速器调至15~20HZ左右，运转3~5分钟后，再将数字调到20~45HZ，使进口与滤出口端压力差达到10~15psi，开始超滤，流速为200L/小时，收集回流端液体；
待滤液的体积为原体积的1/8时，停止超滤浓缩，关掉泵的电源开关。
4）盐析
向滤液中加入质量体积比为25%的硫酸铵盐析沉淀，静置24小时，在低温离心机上离心，5020g，30min，取沉淀500ml。
5）超滤脱盐
沉淀用注射用水3000ml完全溶解后，用30KD超滤膜进行切向流透析，所述超滤浓缩的步骤为：
接好超滤系统和精制罐、储水罐，将滤出端连接在废液缸中，进口和回流端与精制罐相连，将储水罐与精制罐连接好，确认全部阀门打开；
将变频器调至15~20HZ左右，运转3分钟后，再将数字调至20~25HZ左右，使进口与滤出口端压力差达到10~15psi，开始超滤，流速为220L/小时，收集回流端液体；
洗滤过程中随时观察0.9%氯化钠溶液的流入精制罐的流速要与滤出端的流速相一致，保持精制罐内毒素体积不变，期间检测样品中残余硫酸铵含量小于0.025%为超滤合格，停止超滤脱盐。
得到精制破伤风类毒素疫苗2.95L，浓度为720Lf/ml，批号为20090102。
上述两批疫苗的动物免疫效果试验结果见表1。
表1.  20090101、20090102批破伤风类毒素疫苗的效价
批次 效价
20090101 132 IU/ml
20090102 127 IU/ml
现有工艺均值 131 IU/ml
本发明制备获得的两个批次的破伤风类毒素疫苗的各项生化检测结果如下：
表2.  20090101、20090102批破伤风类毒素疫苗的各项生化检测结果
Figure BDA0000255292851
由表2可看出，用本发明方法制得的破伤风类毒素疫苗的纯度与收率有较明显的提高，制备所用的时间明显缩短，工作效率和产品质量得到了改善。而且可大幅减少盐析所用的硫酸铵用量，从以前每批次大约100Kg左右，降低到目前的20Kg左右。

Claims (5)

1.一种破伤风类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：将破伤风菌种经传代发酵，甲醛脱毒后，将培养液调节pH至6.9~7.5，过滤除去菌体，将滤液用孔径为10~40KD的超滤膜进行超滤，直至滤液的体积为原体积的1/6~1/8，再向滤液中加入质量体积比为20~30%的硫酸铵盐析，静置24小时后离心分离，将离心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔径为10~40KD的超滤膜超滤，直至滤液中硫酸铵的质量百分含量小于0.025%。
2.根据权利要求1所述的破伤风类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：所述超滤膜的孔径为30KD。
3.根据权利要求1所述的破伤风类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：所述超滤的压力为10~15psi，流速为200~220L/小时。
4.根据权利要求1所述的破伤风类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：向滤液中加入质量体积比为25~27%的硫酸铵盐析。
5.根据权利要求1所述的破伤风类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：所述过滤除去菌体采用的是板框过滤。
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