CN110845609A - 针对破伤风类毒素的检测抗体对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域,具体的,涉及针对破伤风类毒素的检测抗体对及其应用,所述的单克隆抗体,所述的抗体为抗体2B12和1B23,2B12重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;1B23的重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明还涉及编码所述单克隆抗体2B12、1B23的核酸序列以及由其制备的检测破伤风类毒素的试剂盒。

Description

针对破伤风类毒素的检测抗体对及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体而言,涉及一种针对破伤风类毒素的检测抗体对及其应用。
背景技术
破伤风是由破伤风梭状押宝杆菌的感染引起的。破伤风梭状芽孢杆菌感染于伤口,在缺氧的条件下繁殖并产生外毒素,作用于人中枢神经系统。1974年5月世界卫生大会正式提出扩大免疫计划,防止包括破伤风在内的七种疾病,随后我国也有效推行了破伤风疫苗的接种。破伤风类毒素通过采用化学等方法处理,使其失去毒性而保持抗原性,诱导机体产生免疫应答,并与之发生特异性反应。因此,应以类毒素的免疫学活性为依据对其质量进行评估。通常我们采用动物实验测定其免疫原性,絮状单位法测定其抗原性。絮状单位的测定为常规测定类毒素与相应抗毒素的结合力的方法,其结果为肉眼判断,存在一定误差。因此,人们期望采用简单、快速、灵敏、影响因素少的方法监控生产过程中的破伤风类毒素质量。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏、快速、耐受性强的优点,能够用于破伤风类毒素生产过程中的类毒素的质量控制。
发明内容
本发明首先涉及一组单独和/或联合检测破伤风类毒素(Tetanus Toxoid,TT)的单克隆抗体,所述的抗体为:
(1)单克隆抗体1B12,
其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,SEQIDNO.1:
Figure BDA0002289016360000011
轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示,SEQIDNO.2:
Figure BDA0002289016360000012
(2)单克隆抗体1B23,
其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQIDNO.3所示,SEQIDNO.3:
Figure BDA0002289016360000013
轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQIDNO.4所示,SEQIDNO.4:
Figure BDA0002289016360000014
本发明还涉及编码所述单克隆抗体1B12、1B23的核酸序列。
所述的1B12、1B23单克隆抗体的恒定区(Fc)区为鼠源Fc。
所述的单克隆抗体1B12、1B23都是鼠源抗体。
本发明还涉及所述单克隆抗体1B12、1B23在制备破伤风类毒素得检测试剂中的应用。
本发明还涉及一种检测破伤风类毒素的检测试剂盒,所述的试剂盒包含:
(1)检测有效量的1B12抗体和/或1B23抗体;
(2)必要的显色或定量试剂。
优选的,所述的试剂盒是酶联免疫(ELISA)试剂盒。
更优选的,所述
Figure BDA0002289016360000021
酶联免疫试剂盒为双抗夹心法酶联免疫试剂盒,其中,
(1)使用单克隆抗体1B12为包被抗体或捕获抗体;
(2)使用标记有定量标签的1B23抗体为检测抗体或第二抗体;
所述的有定量标签优选为辣根过氧化物酶或生物素。
附图说明
图1、双抗ELISA检测时的线性范围。
具体实施方式
本发明所使用的主要试剂及其来源为:
anti-TT-1B12单克隆抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示、anti-TT-1B23单克隆抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示;
96孔酶标板购自厦门云鹏科技有限公司;破伤风类毒素标准品购自NIBSC(编号04/150);
其他试剂若无特别说明,均为国产分析纯。
实施例1.双抗体ELISA检测方法的建立
1、线性范围与抗体工作浓度的确定
(1)按照常规包被条件,将包被的一抗anti-TT-1B12(1B12)稀释至3μg/ml进行包被(2-8℃包被16-24小时,包被液配方:Na2CO31.59g,NaHCO32.93g,加纯化水到1L,调pH至9.5-9.6)
(2)次日用PBST清洗掉未结合上的包被抗体,然后加入1%BSA进行封闭(37℃封闭1小时),即制得包被了一抗的酶标板;
(3)使用时,依次加入系列稀释的破伤风类毒素标准品、系列稀释的辣根过氧化物酶标记的anti-TT-1B23单克隆抗体(1B23-HRP),37℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的底物A/B液显色,最后用2M硫酸终止后读取特异性吸光值。
经过试验,结果显示,我们最终得出酶的最佳工作稀释倍数为8000倍;在0.003369-0.0539Lf/ml范围内,吸光值与检测浓度(Lf/ml)呈高度线性相关(R2>0.98)。
实施例2、双抗体ELISA检测方法的验证
1、专属性的验证
将百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、百日咳丝状血凝素(Filamentousheamagglutinin,FHA)、百日咳黏附素(pertactin,PRN)及白喉类毒素(diphtheriatoxoid,DT)稀释至适宜浓度,破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)作为阳性对照品加入,用实施例1制备的检测试剂盒检测,发现除破伤风类毒素外的上述抗原均不能被检出,说明该检测方法特异性好。结果见表1。
表1.专属性的验证
Figure BDA0002289016360000031
*cutoff为空白对照OD均值的2.1倍;其中空白对照OD值低于0.05的按照0.05带入计算。
2、准确度的验证
将破伤风类毒素稀释至高、中、低三个浓度,用实施例1制备的检测试剂盒检测,每个浓度做6次重复。统计高、中、低三个浓度的检测回收率*,发现回收率在90%-110%之间,说明该检测方法的准确度高。结果见表2。
表2.准确度的验证
Figure BDA0002289016360000032
*回收率的计算为:
3、精密度的验证
(1)精密度-重复性
将破伤风类毒素稀释至高、中、低三个浓度,用实施例1制备的检测试剂盒检测,每个浓度做6次重复。统计不同浓度6次检测的变异程度,发现变异系数CV均低于5%,说明该检测方法的重复性好。结果见表3。
表3.精密度-重复性
Figure BDA0002289016360000034
Figure BDA0002289016360000041
(2)精密度-中间精密度
将破伤风类毒素稀释至高、中、低三个浓度,由同一检测人员不同天进行检测;同时由三个检测人员在同一天检测;统计同一检测人员不同检测日期的变异程度及不同检测人员之间的变异程度,发现变异系数CV均低于11%,说明该检测方法的精密度好。结果见表4。
表4.精密度-中间精密度
(3)精密度-线性与范围验证
将破伤风类毒素标准品稀释至线性检测范围内各浓度,重复测定5次,统计各次检测相关系数R2,发现相关系数R2均大于0.98,说明该检测方法的线性好。结果见表5。
表5.线性与范围验证
Figure BDA0002289016360000043
Figure BDA0002289016360000051
最后需要说明的是,以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质,不用做对本发明保护范围的限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉生物制品研究所有限责任公司
<120> 针对破伤风类毒素的检测抗体对及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
1 5 10 15
Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Thr Ser Tyr Gly
20 25 30
Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
35 40 45
Val Ile Trp Ala Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
50 55 60
Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Phe Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
65 70 75 80
Met Asn Ser Val Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Gly Ser Tyr Ala Arg Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu
65 70 75 80
Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ala Leu Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Ser Ile Phe
115
<210> 3
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
20 25 30
Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Asn Cys Asn Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Phe Arg Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Ser Ile Phe
115

Claims (9)

1.一组单独使用或联合使用以检测破伤风类毒素(Tetanus Toxoid,TT)的单克隆抗体,所述的抗体为:
(1)单克隆抗体1B12,其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;
(2)单克隆抗体1B23,其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述的抗体2B12、抗体1B23的恒定区(Fc)区为鼠源Fc。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体,其特征在于,所述的抗体2B12、抗体1B23是鼠源抗体。
4.编码权利要求1-3任一所述的单克隆抗体的核酸片段。
5.权利要求1-3任一所述的单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素的检测试剂中的应用。
6.一种检测破伤风类毒素的检测试剂盒,所述的试剂盒包含:
(1)检测有效量的1B12抗体和/或1B23抗体;
(2)必要的显色或定量试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒是酶联免疫(ELISA)试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述
Figure FDA0002289016350000011
酶联免疫试剂盒为双抗夹心法酶联免疫试剂盒,其中,
(1)使用单克隆抗体1B12作为包被抗体或捕获抗体;
(2)使用标记有定量标签的1B23抗体作为检测抗体或第二抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述的定量标签优选为辣根过氧化物酶或生物素。
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