CN105039262A - 破伤风类毒素单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种破伤风类毒素单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。本发明将破伤风类毒素免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选产生抗破伤风类毒素的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC？No.10590,其分泌的单克隆抗体效价高达10⁷，亲和常数为1.24×10⁹M^-1，可用于制备破伤风类毒素抗原检测试剂盒，也可以应用于酶联免疫法检测破伤风疫苗生产过程以及成品疫苗中类毒素的含量检测，具有广泛的应用前景与市场价值。

Description

破伤风类毒素单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学与疫苗学领域，具体涉及一种破伤风类毒素单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。

背景技术

破伤风是由破伤风梭菌(Clostridiumtetani)经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生破伤风毒素而引起阵发性肌痉挛的一种特异性感染。破伤风是一种感染性疾病，不是传染性疾病，不在人群中爆发流行，人与人之间不能相互感染。绝大多数病例是由于外伤感染所致，除外伤感染外还有新生儿破伤风等。虽然破伤风的发病率及死亡率在发达国家已显著下降，但是在大部分发展中国家仍然是一个主要的公共卫生问题。死于破伤风的总人数中80％为新生儿，热带地区婴儿破伤风的病死率大85％。

破伤风是疫苗可以预防的传染病中唯一的非传染性疾病，全球自20世纪40年代广泛使用破伤风类毒素(TT)以来，尤其是1974年全球实施扩大免疫规划(EPI)后，破伤风的发病率得到有效控制，发病率和死亡率明显下降。但是，破伤风带来的沉重疾病负担在发展中国家尤其在新生儿时期依然存在，甚至在2002年，全球因新生儿破伤风死亡的人数仍有18万。目前破伤风类毒素与白喉和无细胞百日咳疫苗组成的联合疫苗DTaP已成为许多国家儿童联合免疫的基础。我国现有的破伤风疫苗有5类，分别是吸附精制破伤风类毒素，吸附百日咳、白喉和破伤风类毒素混合制剂，吸附无细胞百日咳、白喉和破伤风类毒素混合制剂，吸附精制白喉和破伤风二联类毒素，成人用吸附精制白喉和破伤风二联类毒素。

破伤风梭菌产生两种外毒素，即破伤风菌溶血素和破伤风痉挛毒素。破伤风菌溶血素是一种氧敏感的血溶素，在引起暴露部位感染的过程中发挥作用，但与发病机制无关。破伤风痉挛毒素也称破伤风毒素，是一种能引起破伤风症状的神经毒素。通过化学方法将破伤风毒素灭活后，制成类毒素，其仍可以保留免疫原性，是破伤风疫苗中的主要组份。

破伤风类毒素是破伤风疫苗中的主要活性成分。目前《中华人民共和国药典》2010年版三部中对于破伤风疫苗中破伤风类毒素抗原含量的测定主要包括絮状单位试验、蛋白氮含量测定、SDS-PAGE纯度测定以及效价测定。其中，由于絮状单位试验的结果判定采用观察法，且试验结果受反应时间和环境温度影响很大，试验结果的准确性和精确性较差；蛋白氮含量检测通过蛋白氮含量间接推断破伤风类毒素含量，检测结果准确性与破伤风类毒素纯度密切相关，受杂质影响较大，精确度和准确度较差；SDS-PAGE法主要用来做对破伤风类毒素的鉴别和定性，无法准确的定量，而效价实验步骤复杂、过程较长且需要大量实验动物，不利于疫苗生产过程中对于各个步骤破伤风类毒素含量的监测，也违背WHO关于减少动物使用量的精神，且以上检测方法都无法大批量的对样品进行检测。因此使用破伤风类毒素单克隆抗体采用ELISA法对于破伤风类毒素纯化各个步骤样品以及破伤风类疫苗成品中破伤风类毒素抗原含量进行检测，将大大提高检测的准确性、特异性和工作效率，降低试验的时间成本和资金成本。

发明内容

本发明的目的是突破目前破伤风疫苗生产过程各个步骤以及成品中对于类毒素抗原含量检测方法特异性差、检测效率低的缺点；提供一种一致性好、效价高、均一度高、具有良好特异性的低成本的抗破伤风类毒素单克隆抗体，实现降低成本、提高质控的特异性和效率的目标。

为了达到上述目的，本发明提供一种破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.10590。

该杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.10590，保藏日期2015年5月4日，分类命名为：破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明提供了上述杂交瘤细胞株在制备检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

具体而言，本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备抗破伤风类毒素单克隆抗体，步骤如下：

(1)动物免疫：将纯化的破伤风类毒素与弗式完全佐剂1:2～2:1混合并乳化；乳化后免疫小鼠，腹腔注射，50～70μg破伤风类毒素/只。

(2)加强免疫；首次免疫后两周以及四周后，对小鼠进行2次加强免疫，免疫剂量为30～50μg破伤风类毒素/只，加强免疫使用不完全佐剂。末次免疫一周后采血，采用间接酶联免疫法检测抗体效价，如果抗体效价大于10³，则进行的腹腔冲击，腹腔冲击剂量为50～70μg破伤风类毒素/只，否则继续加强免疫。

(3)取免疫后的小鼠脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:2～10:1的比例混合，于37～39℃水浴滴加45％～55％PEG4000进行细胞融合；然后缓慢加入无血清培养基洗涤2～3次融合后的细胞，再加入完全培养基重悬，将细胞悬液100～150ul/孔加入到细胞培养板培养，培养后添加100～150μmlHAT培养液。

(4)杂交瘤长到瓶底的50％～60％以上时，ELISA法检测细胞上清中的抗体效价。筛选出高效价的单抗细胞株，扩大培养建库，冻存。

(5)将冻存的工作种子库细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的60％～100％时摇下细胞，计数，腹腔免疫小鼠，制备腹水。

本发明还提供包含上述单克隆抗体的试剂盒。

所述试剂盒中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。

进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素抗原试剂盒中的应用。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素抗体试剂盒中的应用。

本发明提供了上述保藏编号为CGMCCNo.10590的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在制备预防或治疗破伤风梭菌感染药物中的应用。

一种治疗或预防破伤风梭菌感染引起疾病的药物，其含有保藏编号为CGMCCNo.10590的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

本发明还提供所述单克隆抗体在检测疫苗中破伤风类毒素含量的应用。

本发明提供了所述单克隆抗体在制备破伤风类毒素疫苗中的应用。

本发明提供了所述单克隆抗体在破伤风类毒素疫苗质量检测中的应用。

进一步地，所述的应用为单克隆抗体经生物标记或化学标记后用于检测疫苗制备过程中或疫苗成品中的破伤风类毒素抗原的含量。

进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。

进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。

本发明的关键点在于：

1、将破伤风梭菌类毒素与佐剂处理后免疫小鼠，优于破伤风类毒素直接免疫，前者可以产生较高水平的免疫原性，满足融合需求。

2、制备的抗破伤风类毒素单克隆抗体腹水，具有较高的效价，腹水效价为10⁶，较好的特异性，亲和常数为1.24×10⁹M^-1，可以用于破伤风类毒素抗原的ELISA鉴别实验，优于目前使用的多克隆抗体；该单抗可以用于灵敏度更高的双抗体夹心ELISA检测方法，检测各种含有破伤风类毒素抗原的样品中破伤风类毒素抗原的含量，大大提高疫苗生产过程中质控的特异性和效率，降低实验成本。

3、本发明杂交瘤细胞株分泌的破伤风类毒素单抗可以用于破伤风疫苗生产过程中各个工序段含有破伤风类毒素组份样品中破伤风类毒素抗原含量的检测，也可用于破伤风疫苗成品中破伤风类毒素抗原含量的测定，具有广泛的应用前景和市场价值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。除非另外指明，所用试剂、培养基、菌株、细胞等均为市售产品。

实施例1免疫原动物免疫

(1)将破伤风类毒素与弗氏完全佐剂等体积混合，形成的乳化物于0天免疫BALB/c小鼠，背部皮下多点注射，0.05ml每点，总量0.2ml，约含60μg破伤风类毒素。

(2)将破伤风类毒素与弗氏不完全佐剂等体积混合，形成的乳化物于14天和28天加强免疫BALB/c小鼠，背部皮下多点注射，0.05ml每点，总量0.2ml，约含50μg破伤风类毒素。

(3)第三次免疫后一周小鼠尾部静脉采血，检测血清的抗体滴度。若抗体效价高于10³，在1周后采用破伤风类毒素与不完全佐剂等体积混合乳化物0.2ml进行腹腔冲击，约含60μg破伤风类毒素，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。

实施例2细胞融合

(1)骨髓瘤细胞的准备：细胞融合前两周复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天将RPMI1640细胞培养液(Gibco)去除，重新添加等量的培养液。融合当天，培养液收集于50ml离心管内，2000r/min离心5min，弃上清。加不完全IMDM培养液至50ml，2000r/min离心5min，弃上清。

(2)脾细胞制备：处死进行动物免疫的小鼠，按照常规方法制备小鼠脾细胞悬液。

(3)根据计数结果将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0分别加入适量不完全IMDM培养液(Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。

(4)将脾细胞与SP2/0细胞按1:1混合于一支50ml离心管中，混匀。

(5)加不完全IMDM培养液至50ml，离心5分钟，将上清尽量倒净，可用移液枪将管口液体吸净。

(6)轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合。

(7)将37℃保温的50％的PEG40001ml，用滴管缓慢滴入离心管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。

(8)静置90s，立即在2分钟内缓慢加入15ml无血清的IMDM培养基(Gibco)(37℃)，尽可能不搅动细胞。

(9)离心5分钟，弃去上清。

(10)加入IMDM完全培养液(Gibco)，轻轻混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，每孔100μl。

(11)将培养板置37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(12)融合第2天，添加HAT培养液(IMDM中添加1×的HAT)，每孔100μl。

(13)每2天换一次HAT培养液，连续两周观察杂交瘤是否出现，两周后换用HT培养基(IMDM中添加1×的HT)，观察融合细胞的生长状况。

(14)杂交瘤细胞的筛选：脾细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。

通过3次的亚克隆得到可以稳定分泌抗体的细胞系，命名为SinoTT，将该杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号CGMCCNO.10590；保藏时间：2015年5月4日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为：破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例3杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)与单抗细胞株腹水制备

(1)杂交瘤细胞计数，用含20％血清的HT培养基稀释杂交瘤细胞。

(2)稀释的杂交瘤细胞加入96孔板培养，每孔100μl。

(3)37℃、5％CO₂湿润培养8天，待出现肉眼可见的克隆，及时检测抗体活性。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

(4)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养，然后转移至25或者175细胞瓶扩增。

(5)扩增后尽快冻存细胞株，编号，保存于液氮中。

按照常规方法将冻存的单克隆细胞进行复苏，培养，镜下观察细胞生长状况，待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底60％以上时即可进行接种；按照常规方法腹腔接种BALB/c雌性小鼠，定期收集腹水。

实施例4破伤风类毒素抗原单抗腹水抗体亚类测定

将破伤风类毒素疫苗原液采用0.01MPBS1:20倍稀释后100μl/孔包被酶标板4℃过夜，然后采用Sigma公司ISO2-1KT鼠单抗分型试剂按照单抗亚类试剂说明书进行试验，最后加入HRP标记的兔抗羊二抗进行单克隆抗体亚类鉴定。结果显示本发明单抗为IgG(IgG1)型。

实施例5破伤风类毒素抗原单抗腹水抗体效价检测

采用间接ELISA法检测抗体的效价，将破伤风类毒素抗原(3μg/ml)包被酶标板过夜，。第二天洗板封闭，然后加入10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸稀释的TT单克隆抗体腹水TT-B5，检测腹水的抗体效价，结果见表1，抗体效价为10⁷。

表1抗体效价检测结果

实施例6免疫印迹(Westernblotting)实验

将破伤风类毒素疫苗原液采用BIO-RAD的电泳电转设备使用12％的SDS-PAGE电泳胶进行电泳后再电转到硝酸纤维素膜，以本发明杂交瘤细胞腹水为一抗(1：2000)，AP-羊抗鼠IgG为二抗进行Westernblotting鉴定，结果显示，杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与破伤风类毒素不反应，表明该单抗与变性后的抗原不能产生反应，说明本发明杂交瘤细胞分泌的单抗不能识别线性表位，是构象性单抗，识别空间结构。

实施例7亲和常数测定

将本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗纯化后检测蛋白质含量，采用1:5,1:10,1:20稀释的不同浓度的破伤风类毒素横向包被酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜。第二天洗板后封闭2小时，拍干待用。将纯化抗体2倍梯度稀释，纵向加入包被后的酶标板，采用间接ELISA法检测抗原抗体反应的OD值。以各抗原浓度时的曲线平坦段的OD值计为100％，计算50％OD值，考察50％OD值所对应点的单抗浓度[Ab]t，再根据亲和常数计算公式可以得到本发明单抗的亲和常数为1.24×10⁹M^-1。

实施例8杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

分别在3个月和9个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养后，制备腹水，进行间接ELISA检测抗体效价，以前期制备的腹水为对照同时进行检测。结果本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到10⁷以上，与前期腹水效价无差异，表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。

实施例9双抗体夹心ELISA法准确性研究

使用破伤风类毒素单抗作为包被抗体、兔抗破伤风类毒素多抗作为检测抗体，进行双抗体夹心ELISA实验，检测已知各个浓度破伤风类毒素抗原标准品中破伤风类毒素抗原的含量，结果如下表2所示：

表2双抗体夹心ELISA初步结果

由表2可见双抗夹心ELISA检测破伤风类毒素抗原标准品的回收率均介于80％-120％，满足质量标准的要求，可以用于样品中的破伤风类毒素抗原含量的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.10590。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测试剂盒中的应用。

4.含有权利要求2所述的单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素抗原试剂盒中的应用。

7.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素抗体试剂盒中的应用。

8.权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防或治疗破伤风梭菌感染引起疾病的药物中的应用。

9.一种治疗或预防破伤风类梭菌感染引起疾病的药物，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备破伤风类毒素疫苗中的应用。