CN108623676A

CN108623676A - 一种提高单克隆抗体产量的方法及其应用

Info

Publication number: CN108623676A
Application number: CN201810229899.2A
Authority: CN
Inventors: 郭绮; 代玉兰; 任燕斌
Original assignee: Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2038-03-20
Also published as: CN108623676B

Abstract

本发明提供了一种提高单克隆抗体产量的方法，包括如下步骤：(1)将杂交瘤细胞克隆化培养，将培养后的杂交瘤细胞注射入动物；(2)对动物开始喂服葡萄糖溶液；(3)采集腹水抗体；(4)纯化采集到的腹水抗体。本发明中在动物注射入杂交瘤细胞后对小鼠开始饲喂用纯水兑的葡萄糖溶液，得到了意想不到的技术效果，最后得到的单克隆抗体量大大增加，并且其效价与采用传统方法得到的单克隆抗体相当，大大的降低了抗体生产的成本，大大的增加了其经济效益，为IVD行业的原料的供给提供了一种新的思路。

Description

一种提高单克隆抗体产量的方法及其应用

技术领域

本发明涉及抗体的制备方法及其应用，具体涉及提高单克隆抗体产量的方法及其应用。

背景技术

单克隆抗体作为医药行业热门研究对象，广泛应用于各生物相关领域。近年来，在我国医疗行业“分级诊断”政策的实施，及国产替代进口试剂的大趋势下，国内IVD企业迎来了爆发式增长。在此环境下，以抗体为核心原料的免疫比浊、免疫层析、化学发光等技术平台也得到了长足发展。但是，其中应用的抗体原料存在产量不足、质量参差不齐的问题，成为了制约国产试剂质量的关键环节。所以，对于抗体产量的提高以及质量的控制就显得尤为重要。单克隆抗体的制备方法包括体外细胞培养法和动物体内诱生法，杂交瘤细胞的体外培养采用血清培养基和无血清培养基，其中基础培养基主要提供各种氨基酸、维生素和葡萄糖等各种前提物质，在血清培养基中的血清中含有上百种的蛋白质，这给单抗的纯化带来很大的麻烦，加之，血清来源有限，每批血清之间质量差异较大，直接影响结果的稳定性，同时血清的价格昂贵；而在无血清培养基中需要添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠这四种成分，这才能起到类似血清的作用(血清中的激素可刺激细胞生长)，但是此种方法培养的杂交瘤细胞密度小，产量低，严重影响了单克隆抗体的生产。

目前，采用较多的单克隆抗体生产方法仍然为动物体内诱生法，即采用在小鼠体内注射分泌抗体的杂交瘤细胞，以腹水瘤的形式在其腹腔内增殖而得到单抗的腹水，在这其中如果通过某种方式提高腹水型单抗的产量，不仅可以减少抗体批间差异带来的试剂批间质量差异，减少后期的诊断结果的误差，还可以减少人力、物力资源的浪费。

众所周知，影响腹水型单抗产量的主要因素包括：1.致敏剂种类及使用方法；2.杂交瘤细胞数量、细胞株特性；3.小鼠种类、年龄、营养、个体差异；4.腹水采集方法等。目前，对于如何有效提高腹水型单克隆抗体产量的研究相对较少，迄今为止，只有极少量中文专利或文献报道过。其中，万晓春等人通过两次注射致敏剂，加强致敏效果，从而提高了小鼠腹水产量[CN201210572740.3，提高腹水型单抗产量的方法，万晓春,吕卫东,于广],胡玉敏等人通过在pristane(降植烷)致敏剂的基础上，加入弗氏不完全佐剂致敏，提高了小鼠腹水产量[胡玉敏,马泓冰,孙中文等，福氏不完全佐剂与pristane在腹水型单抗制备中的联合应用[J]，SUZHOU UNIVERSITY JOURNAL OF MEDICAL SCIENCE 2003；23(6)]。然而，上述方法都存在成本较高，工艺繁杂等问题，所以急需一种工艺简单，成本低的提高单克隆抗体产量的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种工艺简单，成本低的制作单克隆抗体的工艺，其技术方案如下：

一种提高单克隆抗体产量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将杂交瘤细胞进行筛选以及扩大培养，将筛选和扩大培养后的杂交瘤细胞注射入动物体内；

(2)先以纯水作为水源进行饲喂，饲喂3-7天后，对动物开始饲喂浓度为2-20％的葡萄糖溶液；

(3)采集动物腹水；

(4)纯化采集到的腹水，得到抗体。

进一步的，所述步骤(2)的具体操作为：先以纯水作为水源进行饲喂，饲喂3-7天后，每天1-3次，优选为2次，对动物开始饲喂浓度为2-20％的葡萄糖溶液。

进一步的，所述的以纯水作为水源进行饲喂的天数为5天。

进一步的，所述的葡萄糖浓度为5-10％。

进一步的，所述的葡萄糖浓度为5％。

进一步的，所述步骤(1)的具体操作为：将杂交瘤细胞进行筛选以及扩大培养，在注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射杂交瘤细胞至小鼠体内。

进一步的，所述步骤(3)的具体步骤为：在将培养后的杂交瘤细胞注射入小鼠后的5-25天，优选为7-17天，更优选为7-14天，开始采集小鼠腹水抗体。

进一步的，所述的步骤(4)中的纯化是采用proteinG柱进行。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：在动物注射入杂交瘤细胞后对小鼠开始饲喂葡萄糖，得到了意想不到的技术效果，得到的单克隆抗体量大大增加，并且其效价与采用传统方法得到的单克隆抗体相当，大大的降低了抗体生产的成本，增加了其经济效益，为单克隆抗体的供给提供了一种新的方法。

本领域技术人员知道，通用的杂交瘤细胞制备过程：(以NT-proBNP单克隆抗体6C7为例)

A、动物免疫

1.间接ELISA测定免疫前小鼠血清是否含有NT-proBNP抗体，经验证均无NT-proBNP抗体，对5只小鼠进行编号；

2.首次免疫，第1天，将用生理盐水稀释至2mg/ml的NT-proBNP抗原与等体积完全弗氏佐剂混合，充分乳化(采用玻璃注射器互推法)，然后四肢皮下注射，共免疫5只小鼠，每只免疫100μL；

3.第二次免疫：首次免疫两周后，用等量的抗原与等量不完全弗氏佐剂混合(抗原浓度与1中相同)，充分乳化，四肢皮下注射，共免疫5只小鼠，每只免疫100μL；

4.之后间隔两周免疫，抗原制备同步骤3，直至效价达到1×10⁵，于细胞融合前三天加强免疫，每只Balb/c小鼠腹腔注射50μL抗原。

B、杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选

1.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有一定无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清；重复上一步骤，再洗一次。

2.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，重复以上步骤，再洗一次。

3.按照1/10或1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次。

4.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状。

5.将含融合细胞的离心管置于于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s；

6.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT(终浓度)，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；

7.5天后每孔补充50μL含1×HT的完全培养液；

8.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；

9.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；

10.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；

11.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；

12.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选：保留能与NT-proBNP反应的杂交瘤细胞；

13.制备饲养细胞层100μL/孔(2×10⁴个/孔)，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存与液氮罐中，记录冻存位置。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

从以下的实施例来说明本发明的有益效果：

(1)抗人NT-proBNP单克隆抗体6C7

实施例1本发明过程中参数的筛选过程

一、饲喂葡萄糖浓度的筛选，具体如下：

(1)将抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞克隆化培养，在细胞培养瓶中扩大培养，注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射70只小鼠，分为7组；

(2)对小鼠先以纯水作为水分来源进行饲喂，将培养后的抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，5天后，对7组小鼠分别喂服浓度为0％、2％、5％、10％、20％、50％、100％的葡萄糖溶液，每天喂服2次，用葡萄糖饲喂到抗体采集完毕；

(3)在将培养后的抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞注射入小鼠的7-14天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕。

二、饲喂葡萄糖时间的筛选，具体如下：

(1)将抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞克隆化培养，在细胞培养瓶中扩大培养，注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射60只小鼠，分为6组；

(2)对小鼠先以纯水作为水分来源进行饲喂，将培养后的抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，分别在0天、3天、5天、7天、10天、15天后，对6组小鼠分别喂服浓度为5％的葡萄糖溶液，每天喂服2次，用葡萄糖饲喂到抗体采集完毕；

三、腹水抗体的纯化

对上述步骤采集的腹水抗体进行纯化，包括如下步骤：

(1)抗体前处理：按照每10ml抗体150mg的量加入SiO₂，室温震摇孵育1个小时，对抗体进行脱脂处理，然后用等体积20mM PBS稀释腹水抗体；

(2)平衡proteinG柱:选用16mm×20cm层析空柱，装入约15ml层析填料(GEHealthy ProteinG 4Fast Flow)，用PBS平衡层析柱，其中PBS与步骤A所述相同；

(3)上样：将腹水单抗，按照柱体积的10倍上样；

(4)平衡：上样结束后，用PBS平衡柱子5体积，所述PBS与步骤A相同；

(5)洗脱：平衡结束后，用5体积pH2.7的甘氨酸-HCl洗脱抗体；

(6)抗体后续纯化：将(5)步骤得到的抗体中加入其1/10体积的pH8.0Tris-HCl中和缓冲液中，用PBS透析，PBS的量为10倍抗体体积，期间换3次液。

四、抗人NT-proBNP单克隆抗体6C7浓度的测定，主要依据生工的改良型蛋白浓度测定试剂盒(C504041-1000)进行，具体如下：

(1)试剂准备

①将5mg/mLBSA标准蛋白用蒸馏水稀释为0.1mg/mL。

②样品用蒸馏水做适当稀释，预做2个稀释度。

③根据标准品和样品计算所需的工作液，按溶液A：溶液B＝1：50配制，充分混匀。

④将样品溶液按照每0.5mL加入50μL溶液C，充分混匀，在冰箱的冷藏室中放30min，然后4℃，15000rpm离心15min，在通风橱中去掉上清液和管壁以及管底的液体，保留沉淀。自然干燥后用适量双蒸水溶解，稀释到适当倍数。其中溶液A、溶液B与溶液C是该试剂盒中的试剂。

(2)分光光度计法

①准备22个微量离心管，设置重复管号0～10，按下表配制BSA浓度梯度的标准溶液。

②另外准备4个微量离心管，设置2个重复组，编号不同的2管分别加入200μL不同稀释度的蛋白样品。

③各离心管加入1mL反应工作液，混匀，室温下静置10min。

④各离心管加入100μLFolin酚试剂，迅速混匀，室温下静置30min。

⑤分光光度计上测各离心管中的A750值。以标准品不同梯度的BSA测定的A750值为纵坐标，对应的蛋白浓度为横坐标，

在坐标纸上或使用Microsoft Excel软件绘制标准曲线。

⑥选择合适的的稀释度，根据标准曲线和稀释度计算原样品的蛋白质浓度。

五、抗人NT-proBNP单克隆抗体6C7效价的测定，具体如下：

(1)抗原包被：用50mM碳酸盐缓冲液将NT-proBNP抗原稀释至2μg/ml，向96孔酶标板中，每孔加入100μl，放置4℃孵育12-18小时；

(2)抗体孵育：称取2g牛血清白蛋白(组分五)溶于100ml PBS，并加入100μlTween-20，充分溶解，作为抗体稀释液；用抗体稀释液将6C7抗体稀释至0.1μg/ml，以此进行2倍比稀释至第十一列，第十二列为空白对照，将稀释好的抗体样品加入至酶标板对应的位置，每孔100μl，37℃孵育40分钟；

(3)二抗孵育：用PBST充分洗涤酶标板5-8次，拍干，加入用抗体稀释液稀释了5000倍的羊抗鼠HRP酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育30分钟；

(4)显色：用PBST充分洗涤酶标板5-8次，拍干，加入TMB显色液，每孔100μl，显色10分钟；

(5)终止：每孔加入100μl终止液，15分钟以内读取数据；

(6)读值及结果分析：在酶标仪上读取各孔450nm处值，并记录结果，以空白对照空的2.1倍作为临界值，大于2.1倍的空白值即为阳性，此时稀释倍数最大处，即为抗体效价。

六、结果及分析

表1抗人NT-proBNP 6C7组葡萄糖饲喂浓度筛选结果表

表2抗人NT-proBNP 6C7组葡萄糖饲喂时间筛选结果表

从实验结果的表1中得出，从腹水的采集量、抗体的量以及抗体的效价看出在注射完杂交瘤细胞后饲喂葡萄糖的浓度过高过低都不行，其饲喂的葡萄糖的最佳的浓度为5％的葡萄糖，饲喂的葡萄糖的浓度范围在2％-20％之间时，其抗体的产量都是高于不饲喂葡萄糖的抗体的产量，从此看出本发明在抗体的制备过程中对小鼠饲喂一定浓度的葡萄糖达到了预想不到的技术效果，取得了良好的经济效益。

从实验结果的表2中看出，从腹水的采集量、抗体的量以及抗体的效价看出在注射杂交瘤细胞的3-7天开始饲喂葡萄糖的效果较好，其中最优的天数为5天，由此看出本发明在对小鼠注射入杂交瘤细胞后的饲喂葡萄糖的时间以及浓度对抗体的量的产生具有重大的影响，在最佳的葡萄糖浓度以及最佳的饲喂时间的结合下，本发明产生了预料不到的技术效果，取得了良好的经济效益。

实施例2一种抗人NT-proBNP单克隆抗体6C7的制备方法，包括如下步骤：

(1)将抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞克隆化培养，经ELISA鉴定为全阳性后，在细胞培养瓶中扩大培养，腹腔注射杂交瘤细胞前一周，注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射10只小鼠；

(2)一直对小鼠饲喂纯水，将培养后的抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔5天后，对小鼠饲喂5％葡萄糖，每天喂服2次，饲喂到抗体采集完毕；

(3)在将培养后的抗人NT-proBNP 6C7杂交瘤细胞注射入小鼠后的7-14天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕；

(4)对(3)采集的腹水抗体进行纯化，具体步骤同实施例1。

(5)抗人NT-proBNP单克隆抗体6C7浓度的测定：其测定过程与实施例1中的测定过程相同。

(6)抗人NT-proBNP单克隆抗体6C7效价的测定：其测定过程与实施例1中的测定过程相同。

实验结果分析：从上表1中看出，与不进行葡萄糖饲喂相比，单位小鼠腹水产量升高了44.15％((95ml/10只)/(66ml/10只)-100％＝43.9％)，单位腹水抗体产量产量基本相当，两组所得抗体效价相当(均为1:64万)，说明本方法对抗体反应性不受影响。按照市售单抗价格在500元/mg左右，通过该改进方法，直接增加经济效益43.9％。

(2)抗人D二聚体单克隆抗体1D10

实施例3本发明过程中参数的筛选过程

一、饲喂葡萄糖浓度的筛选，具体如下：

(1)将抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞克隆化培养，在细胞培养瓶中扩大培养，注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射70只小鼠，分为7组；

(2)对小鼠先以纯水作为水分来源进行饲喂，将培养后的抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，5天后，对7组小鼠分别喂服浓度为0％、2％、5％、10％、20％、50％、100％的葡萄糖溶液，每天喂服1次，用葡萄糖饲喂到抗体采集完毕；

(3)在将培养后的抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞注射入小鼠的7-17天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕。

二、饲喂葡萄糖时间的筛选，具体如下：

(1)将抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞克隆化培养，在细胞培养瓶中扩大培养，注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射60只小鼠，分为6组；

(2)对小鼠先以纯水作为水分来源进行饲喂，将培养后的抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，分别在0天、3天、5天、7天、10天、15天后，对6组小鼠分别喂服浓度为5％的葡萄糖溶液，每天喂服1次，用葡萄糖饲喂到抗体采集完毕；

三、腹水抗体的纯化，同实施例1。

四、抗人D二聚体单克隆抗体1D10浓度的测定，同实施例1。

五、抗人D二聚体单克隆抗体1D10效价的测定，同实施例1。

六、结果及分析

表3抗人D二聚体1D10组葡萄糖饲喂浓度筛选结果表

表4抗人D二聚体1D10组葡萄糖饲喂时间筛选结果表

从实验结果的表3中得出，从腹水的采集量、抗体的量以及抗体的效价看出在注射完杂交瘤细胞后饲喂葡萄糖的浓度过高过低都不行，其饲喂的葡萄糖的最佳的浓度为5％的葡萄糖，饲喂的葡萄糖的浓度范围在2％-20％之间时，其抗体的产量都是高于不饲喂葡萄糖的抗体的产量，从此看出本发明在抗体的制备过程中对小鼠饲喂一定浓度的葡萄糖达到了预想不到的技术效果，取得了良好的经济效益。

从实验结果的表4中得出，从腹水的采集量、抗体的量以及抗体的效价看出在注射杂交瘤细胞的3-7天开始饲喂葡萄糖的效果较好，其中最优的天数为5天，由此看出本发明在对小鼠注射入杂交瘤细胞后的饲喂葡萄糖的时间以及浓度对抗体的量的产生具有重大的影响，在最佳的葡萄糖浓度以及最佳的饲喂时间的结合下，本发明产生了预料不到的技术效果，取得了良好的经济效益。

实施例4一种抗人D二聚体单克隆抗体1D10的制备方法，包括如下步骤：

(1)将抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞克隆化培养，经ELISA鉴定为全阳性后，在细胞培养瓶中扩大培养，腹腔注射杂交瘤细胞前一周，注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射10只小鼠；

(2)一直对小鼠饲喂纯水，将培养后的抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔5天后，对小鼠饲喂5％葡萄糖，每天喂服1次，饲喂到抗体采集完毕；

(3)在将培养后的抗人D二聚体1D10杂交瘤细胞注射入小鼠后的7-17天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕；

(4)对(3)采集的腹水抗体进行纯化，具体步骤同实施例1。

(5)抗人D二聚体单克隆抗体1D10浓度的测定：其测定过程与实施例1中的测定过程相同。

(6)抗人D二聚体单克隆抗体1D10效价的测定：其测定过程与实施例1中的测定过程相同。

实验结果分析：从上表3可以看出，与不进行葡萄糖饲喂相比，单位小鼠腹水产量升高了12％((101ml/10只)/(90.2ml/10只)-100％＝12％)，单位腹水抗体产量产量基本相当，两组所得抗体效价相当(均为1:128万)，说明本方法对抗体反应性不受影响。按照市售单抗价格在500元/mg左右，通过该改进方法，直接增加经济效益12％。

(3)抗人NT-proBNP单克隆抗体1A7

实施例5本发明过程中参数的筛选过程

一、饲喂葡萄糖浓度的筛选，具体如下：

(1)将抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞克隆化培养，在细胞培养瓶中扩大培养，注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射70只小鼠，分为7组；

(4)对小鼠先以纯水作为水分来源进行饲喂，将培养后的抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，5天后，对7组小鼠分别喂服浓度为0％、2％、5％、10％、20％、50％、100％的葡萄糖溶液，每天喂服3次，用葡萄糖饲喂到抗体采集完毕；

(5)在将培养后的抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞注射入小鼠的5-25天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕。

二、饲喂葡萄糖时间的筛选，具体如下：

(1)将抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞克隆化培养，在细胞培养瓶中扩大培养，注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射60只小鼠，分为6组；

(2)对小鼠先以纯水作为水分来源进行饲喂，将培养后的抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，分别在0天、3天、5天、7天、10天、15天后，对6组小鼠分别喂服浓度为5％的葡萄糖溶液，每天喂服3次，用葡萄糖饲喂到抗体采集完毕；

(3)在将培养后的抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞注射入小鼠的5-25天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕。

三、腹水抗体的纯化，同实施例1。

四、抗人NT-proBNP单克隆抗体1A7浓度的测定，同实施例1。

五、抗人NT-proBNP单克隆抗体1A7效价的测定，同实施例1。

六、结果及分析

表5抗人NT-proBNP 1A7组葡萄糖饲喂浓度筛选结果表

表6抗人NT-proBNP 1A7组葡萄糖饲喂时间筛选结果表

从实验结果的表5中得出，从腹水的采集量、抗体的量以及抗体的效价看出在注射完杂交瘤细胞后饲喂葡萄糖的浓度过高过低都不行，其饲喂的葡萄糖的最佳的浓度为5％的葡萄糖，饲喂的葡萄糖的浓度范围在2％-20％之间时，其抗体的产量都是高于不饲喂葡萄糖的抗体的产量，从此看出本发明在抗体的制备过程中对小鼠饲喂一定浓度的葡萄糖达到了预想不到的技术效果，取得了良好的经济效益。

从实验结果的表6中得出，从腹水的采集量、抗体的量以及抗体的效价看出在注射杂交瘤细胞的3-7天开始饲喂葡萄糖的效果较好，其中最优的天数为5天，由此看出本发明在对小鼠注射入杂交瘤细胞后的饲喂葡萄糖的时间以及浓度对抗体的量的产生具有重大的影响，在最佳的葡萄糖浓度以及最佳的饲喂时间的结合下，本发明产生了预料不到的技术效果，取得了良好的经济效益。

实施例6一种抗人NT-proBNP单克隆抗体1A7的制备方法，包括如下步骤：

(1)将抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞克隆化培养，经ELISA鉴定为全阳性后，在细胞培养瓶中扩大培养，腹腔注射杂交瘤细胞前一周，注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射用PBS稀释至0.9×10⁶个/ml的杂交瘤细胞至小鼠腹腔，0.5ml/只，共注射10只小鼠；

(2)一直对小鼠饲喂纯水，将培养后的抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔5天后，对小鼠饲喂5％葡萄糖，每天喂服2次，饲喂到抗体采集完毕；

(3)在将培养后的抗人NT-proBNP 1A7杂交瘤细胞注射入小鼠后的5-25天后，开始采集腹水抗体，具体为：用5ml注射器斜刺入小鼠左下部腹腔内，抽取腹水。抽取完毕后，继续饲养，每隔3天采集腹水，直至最后一次采集完毕；

(4)对(3)采集的腹水抗体进行纯化，具体步骤同实施例1。

(5)抗人NT-proBNP单克隆抗体1A7浓度的测定：其测定过程与实施例1中的测定过程相同。

(6)抗人NT-proBNP单克隆抗体1A7效价的测定：其测定过程与实施例1中的测定过程相同。

实验结果分析：从上表5中得出，与不进行葡萄糖饲喂相比，单位小鼠腹水产量升高了30.2％((69ml/10只)/(53ml/10只)-100％＝30.2％)，单位腹水抗体产量产量基本相当，两组所得抗体效价相当(均为1:64万)，说明本方法对抗体反应性不受影响。按照市售单抗价格在500元/mg左右，通过该改进方法，直接增加经济效益30.2％。

Claims

1.一种提高单克隆抗体产量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(3)采集动物腹水；

(4)纯化采集到的腹水，得到抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体步骤为：先以纯水作为水源进行饲喂，饲喂3-7天后，每天1-3次，优选为2次，对动物开始饲喂浓度为2-20％的葡萄糖溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的以纯水作为水源进行饲喂的天数为5天。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的葡萄糖浓度为5-10％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的葡萄糖浓度为5％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体步骤为：将杂交瘤细胞进行筛选以及扩大培养，在注射杂交瘤细胞前10-14天，给小鼠腹腔注射0.5ml/只液体石蜡，一周后，注射杂交瘤细胞至小鼠体内。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体步骤为：在将培养后的杂交瘤细胞注射入小鼠后的5-25天，优选为7-17天，更优选为7-14天，开始采集小鼠腹水抗体。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的纯化是采用proteinG柱进行。