CN107266569A - 一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及考古检测领域，公开了一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，采用FeCl₂和亚氨基二琥珀酸四钠混合溶液体系提取柞蚕丝素蛋白，然后将柞蚕丝素蛋白作为完全抗原注射到兔体内，选出免疫效价高的兔，将其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的杂交瘤细胞经培养后用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的菌株，用有限稀释法克隆至有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%为止，用筛选出的细胞进行大转生产，然后利用层析柱对所得单抗进行纯化。本发明方法制备的抗体具有很强的特异性，且其在应用过程中操作简单快捷，检测准确性高。

Description

一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及考古检测领域，尤其涉及一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。

背景技术

蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为家蚕丝和柞蚕丝两大类。我国是最早利用柞蚕和放养柞蚕的国家，但其起源问题一直笼罩在迷雾中，迫切需要一种更科学的方法来鉴定出土的丝织品。蚕丝的常规检测方法主要有傅里叶红外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射等，但蚕丝长期处于墓葬或遗址环境中会受到多种因素影响，从而出现蛋白质降解及大分子链断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对研究丝绸的起源至关重要。当前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的Western Blotting或ELISA法，柞蚕丝素蛋白抗体的制备是该研究的一个关键环节。目前已出现了柞蚕丝素蛋白的多克隆抗体，抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，抗原分子具有很多抗原决定簇，因此免疫动物产生的抗体为多种抗体的混合物，要把这些不同的抗体分开十分困难，同时多克隆抗体存在纯度低、理化性状不均一、与抗原结合特异性不强等问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。本发明方法制备的抗体具有很强的特异性，且其在应用过程中操作简单快捷，检测准确性高。

本发明的具体技术方案为：一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

A）称取柞蚕丝并将其以1:23-27的浴比添加至去离子水中，用盐酸调节pH至2.5-3.0，于98-102℃水浴中恒温加热55-65min进行脱胶，然后加入NaHCO₃调节pH至中性，按上述方法至少重复脱胶一次；将脱胶后的柞蚕丝加入至去离子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干，制得柞蚕丝素蛋白样品。

B）称取9-11 g FeCl₂，加入48-52mL去离子水溶解后再滴加14-16 mL的亚氨基二琥珀酸四钠，充分混合后定容至100 mL，得到混合溶液。

本发明采取FeCl₂与亚氨基二琥珀酸四钠混合配比溶液较现有方法具有以下优点：易生物降解，对生态系统无毒无害；亚氨基二琥珀酸四钠对金属离子螯合能力强使试剂对蛋白质的提取效果更优。

C）将步骤A）所得柞蚕丝素蛋白样品按固液比0.9-1.1g/15mL加入到步骤B）所得混合溶液中，在55-65℃水浴中搅拌保温55-65min，取出待冷却后，将溶液置于45-55kHz的超声波下处理25-35min，同时用乙酸缓慢调节pH为8.5-9.0；然后将溶液装入透析袋中进行透析，每2.5-3.5h换一次水值至袋内溶液pH小于7，将袋内溶液冷冻干燥后得到纯化的柞蚕丝素蛋白，磨粉后制得柞蚕丝素蛋白完全抗原，备用。

本发明在提取过程中使用超声处理，与传统方法相比就具有提取得率更高和生产周期更短的优点。

D）用生理盐水溶解步骤C）所得柞蚕丝素蛋白完全抗原，控制浓度为1-2 mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐剂混合溶液；选取2只的大白兔进行初次免疫，用抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射；在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。

E）用0.4-0.6 mg步骤C）所得柞蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗，将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10 mL，将脾脏碾碎过筛网，然后用1640培养液悬浮，在10000-14000 rpm下离心4-6 min，移除上清液，再洗涤一次，得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×10⁸个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养。

F）取步骤E）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1.8-2.2:1的数量比混匀，加培养液后在10000-14000 rpm下离心4-6 min，弃上清液，在35-39℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在10000-14000 rpm下离心，弃上清液后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮。

G）步骤F）所得细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%，利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。

H）pH 7.4的PBS溶液的制备。

I）对步骤G）所得兔单克隆抗体进行纯化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为58-62 mL/h；用30mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液清洗柱子，清洗的流速为115-125 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液进行洗脱；洗脱完成后用0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液洗涤多肽柱，获得纯化后的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体，在1-5℃下储存备用。

本发明采用的上述纯化方法与现有方法相比，具有操作简单快捷，所得抗体纯度高，生物活性好的优点。

作为优选，步骤C）中，所述透析袋的规格为截留分子量8000。

作为优选，步骤D）中，所述大白兔为14-16周龄。

作为优选，步骤D）中，初次免疫和加强免疫时抗原佐剂混合溶液的注射量为100 μL。

作为优选，步骤H）中，所述pH 7.4的PBS溶液的之制备方法为：称取0.27 g磷酸二氢钾，1.42 g磷酸氢二钠，8 g氯化钠和 0.2 g氯化钾，加入到800 mL去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000 mL的容量瓶进行定容，调节溶液的pH为7.4。

上述方法制得的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体在文物样品质地鉴定中的应用，方法如下：

取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1 μg/mL的浓度在酶标板中包被11-13h，每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35-39℃下封闭110-130min；每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将柞蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100 μL柞蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，35-39℃下孵育50-70min，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100 μL 的辣根过氧化酶标二抗，35-39℃下孵育55-65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100 μL的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，9-11min后，加入100 μL，2mol/L的H₂SO₄ 终止反应；用酶标仪测定OD450nm，当OD值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有柞蚕丝；根据此标准，可以判断柞蚕丝素蛋白的存在。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

1）采用柞蚕丝直接提取的丝素蛋白制备出来的单克隆抗体具有很强的特异性，能够与柞蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度很高。

2）采用柞蚕丝素蛋白制备出来的单克隆抗体能够对古代丝制品中的柞蚕丝素蛋白分子做出检测，为中国早期墓葬中丝织物的检测提供了一种敏感、特异、快捷的辨识方法，为探究柞蚕丝的起源问题提供了一种科学的方法。

3）采取FeCl₂与亚氨基二琥珀酸四钠混合配比溶液的易生物降解，对生态系统无毒无害；亚氨基二琥珀酸四钠对金属离子螯合能力强使试剂对蛋白质的提取效果更优。

4）使用超声处理与传统方法相比提取得率更高和生产周期更短。

5）采用的抗体纯化方法操作简单快捷，所得抗体纯度高，生物活性好的优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例一

A）称取10 g柞蚕丝以1:25的浴比加入去离子水中，用盐酸调节pH至2.5，于100℃水浴下恒温60min进行脱胶，水浴结束后加入NaHCO₃调节PH至中性，反复操作3次。脱胶后的柞蚕丝加入至200 mL去离子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。

B）称取10 g FeCl₂，加入50mL去离子水溶解后滴加15 mL的亚氨基二琥珀酸四钠，充分混合后定容至100 mL。

C）称取1 g步骤A）中所得丝素蛋白样品，加入15 mL步骤B）中配得的混合溶液,在60℃水浴上搅拌保温60 min。取出待冷却后，将溶液置于30kHz的超声波下处理30min，同时用乙酸缓慢调节pH为8.5。中和后的溶液装入透析袋（截留分子量8000）进行透析，每3小时换一次水至袋内溶液pH小于7，对剩余溶液进行冷冻干燥得到纯化的柞蚕丝素蛋白，磨成粉末作为完全抗原备用。

D）用适量的生理盐水溶解步骤C）中所得柞蚕丝素蛋白粉，稀释为1 mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比 1:1 混合。选取2只大白兔（14-16 周龄）进行初次免疫。用上述制得的抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，注射量为100μL。在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100 μL，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。

E）用0.5 mg步骤C）中所得柞蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗。将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10 mL，将脾脏碾碎过不锈钢筛网，然后用1640培养液悬浮，在12000 rpm下离心5 min。移除上清，再洗涤一次。得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×10⁸个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；

F）取步骤E）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1的数量比混匀，加培养液后在12000 rpm下离心5 min,弃上清。在37℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在12000 rpm下离心，弃上清后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮。

G）步骤F）中细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为 100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。

H）称取 0.27 g磷酸二氢钾，1.42 g磷酸氢二钠，8 g氯化钠和 0.2 g氯化钾，加入到800 mL 去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用 1000 mL 的容量瓶进行定容，调节溶液的pH为7.4，得到pH 7.4的PBS 溶液。

I）对步骤G）中所得单抗进行纯化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10 mL，0.05mol/L，pH 7.4的PBS对蛋白柱进行清洗，清洗流速为 60 mL/h；用30mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS清洗柱子，清洗的流速为120 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS进行洗脱；洗脱完成后用0.05 mol/L，pH7.4的PBS洗涤多肽柱，获得纯化后的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体，在4 ℃下储存备用。

J）特异性检测：取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1 μg/mL的浓度在酶标板中包被12h，每孔用200μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭120min；每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将柞蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100 μL柞蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，35-39℃下孵育50-70min，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100 μL 的辣根过氧化酶标二抗，37℃下孵育60min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100 μL的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，10min后，加入100 μL，2mol/L的H₂SO₄ 终止反应；用酶标仪测定 OD450nm，当OD值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有柞蚕丝；根据此标准，可以判断柞蚕丝素蛋白的存在。

实施例二

A)称取10 g柞蚕丝以1:25的浴比加入去离子水中，用盐酸调节pH至3，于100℃水浴下恒温60min进行脱胶，水浴结束后加入NaHCO₃调节pH至中性，反复操作3次。脱胶后的柞蚕丝加入至200 mL去离子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。

B)称取10 g FeCl₂，加入50mL去离子水溶解后滴加15 mL的亚氨基二琥珀酸四钠，充分混合后定容至100 mL。

C)称取1 g步骤A）中所得丝素蛋白样品，加入15 mL步骤B）中配得的混合溶液,在60℃水浴上搅拌保温60 min。取出待冷却后，将溶液置于50kHz的超声波下处理30min，同时用乙酸缓慢调节pH为9。中和后的溶液装入透析袋（截留分子量8000）进行透析，每3小时换一次水至袋内溶液pH小于7，对剩余溶液进行冷冻干燥得到纯化的柞蚕丝素蛋白，磨成粉末作为完全抗原备用。

D)用适量的生理盐水溶解步骤C）中所得柞蚕丝素蛋白粉，稀释为1.5 mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比 1:1 混合。选取2只大白兔（14-16 周龄）进行初次免疫。用上述制得的抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，注射量为100μL。在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100 μL，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。

E)用0.5 mg步骤C）中所得柞蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗。将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10 mL，将脾脏碾碎过不锈钢筛网，然后用1640培养液悬浮，在12000 rpm下离心5 min。移除上清，再洗涤一次。得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×10⁸个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；

F)取步骤E）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1的数量比混匀，加培养液后在12000 rpm下离心5 min,弃上清。在37℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在12000 rpm下离心，弃上清后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮。

G)步骤F）中细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为 100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。

H)称取 0.27 g磷酸二氢钾，1.42 g磷酸氢二钠，8g氯化钠和 0.2 g氯化钾，加入到800 mL 去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用 1000 mL 的容量瓶进行定容，调节溶液的pH为7.4，得到pH 7.4的PBS 溶液。

I)对步骤G）中所得单抗进行纯化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10 mL，0.05mol/L，pH 7.4的PBS对蛋白柱进行清洗，清洗流速为 60 mL/h；用30mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS清洗柱子，清洗的流速为120 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS进行洗脱；洗脱完成后用0.05 mol/L，pH7.4的PBS洗涤多肽柱，获得纯化后的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体，在4 ℃下储存备用。

J) 特异性检测：取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1 μg/mL的浓度在酶标板中包被11h，每孔用200μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35℃下封闭130min；每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将柞蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100 μL柞蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，35℃下孵育70min，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100 μL 的辣根过氧化酶标二抗，35℃下孵育65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100 μL的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，9min后，加入100 μL，2mol/L的H₂SO₄ 终止反应；用酶标仪测定 OD450nm，当OD值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有柞蚕丝；根据此标准，可以判断柞蚕丝素蛋白的存在。

实施例三

A)称取10 g柞蚕丝以1:25的浴比加入去离子水中，用盐酸调节pH至3，于100℃水浴下恒温60min进行脱胶，水浴结束后加入NaHCO₃调节pH至中性，反复操作3次。脱胶后的柞蚕丝加入至200 mL去离子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。

B)称取10 g FeCl₂，加入50mL去离子水溶解后滴加15 mL的亚氨基二琥珀酸四钠，充分混合后定容至100 mL。

C)称取1 g步骤A）中所得丝素蛋白样品，加入15 mL步骤B）中配得的混合溶液,在60℃水浴上搅拌保温60 min。取出待冷却后，将溶液置于40kHz的超声波下处理30min,同时用乙酸缓慢调节PH为8.5。中和后的溶液装入透析袋（截留分子量8000）进行透析，每3小时换一次水至袋内溶液PH小于7，对剩余溶液进行冷冻干燥得到纯化的柞蚕丝素蛋白，磨成粉末作为完全抗原备用。

D)用适量的生理盐水溶解步骤C）中所得柞蚕丝素蛋白粉，稀释为2 mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比 1:1 混合。选取2只大白兔（14-16 周龄）进行初次免疫。用上述制得的抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，注射量为100μL。在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100 μL，进行加强免疫 ；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。

E)用0.5 mg步骤C）中所得柞蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗。将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10 mL，将脾脏碾碎过不锈钢筛网，然后用1640培养液悬浮，在12000 rpm下离心5 min。移除上清，再洗涤一次。得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×10⁸个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；

F)取步骤E）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1的数量比混匀，加培养液后在12000 rpm下离心5 min,弃上清。在37℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在12000 rpm下离心，弃上清后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮。

G)步骤F）中细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为 100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。

H)称取 0.27 g磷酸二氢钾，1.42 g磷酸氢二钠，8 g氯化钠和 0.2 g氯化钾，加入到800 mL 去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用 1000 mL 的容量瓶进行定容，调节溶液的pH为7.4，得到pH 7.4的PBS 溶液。

I)对步骤G）中所得单抗进行纯化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10 mL，0.05mol/L，pH 7.4的PBS对蛋白柱进行清洗，清洗流速为 60 mL/h；用30mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS清洗柱子，清洗的流速为120 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS进行洗脱；洗脱完成后用0.05 mol/L，pH7.4的PBS洗涤多肽柱，获得纯化后的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体，在4 ℃下储存备用。

J) 特异性检测：取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1 μg/mL的浓度在酶标板中包被13h，每孔用200μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在39℃下封闭110min；每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将柞蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100 μL柞蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液， 39℃下孵育50min，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100 μL 的辣根过氧化酶标二抗， 39℃下孵育55min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100 μL的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，11min后，加入100 μL，2mol/L的H₂SO₄ 终止反应；用酶标仪测定OD450nm，当OD值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有柞蚕丝；根据此标准，可以判断柞蚕丝素蛋白的存在。

本发明方法中柞蚕丝素蛋白的提取率，可达75%以上。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A）称取柞蚕丝并将其以1:23-27的浴比添加至去离子水中，用盐酸调节pH至2.5-3.0，于98-102℃水浴中恒温加热55-65min进行脱胶，然后加入NaHCO₃调节pH至中性，按上述方法至少重复脱胶一次；将脱胶后的柞蚕丝加入至去离子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干，制得柞蚕丝素蛋白样品；

B）称取9-11 g FeCl₂，加入48-52mL去离子水溶解后再滴加14-16 mL的亚氨基二琥珀酸四钠，充分混合后定容至100 mL，得到混合溶液；

C）将步骤A）所得柞蚕丝素蛋白样品按固液比0.9-1.1g/15mL加入到步骤B）所得混合溶液中，在55-65℃水浴中搅拌保温55-65min，取出待冷却后，将溶液置于45-55kHz的超声波下处理25-35min，同时用乙酸缓慢调节pH为8.5-9.0；然后将溶液装入透析袋中进行透析，每2.5-3.5h换一次水值至袋内溶液pH小于7，将袋内溶液冷冻干燥后得到纯化的柞蚕丝素蛋白，磨粉后制得柞蚕丝素蛋白完全抗原，备用；

D）用生理盐水溶解步骤C）所得柞蚕丝素蛋白完全抗原，控制浓度为1-2 mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐剂混合溶液；选取2只的大白兔进行初次免疫，用抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射；在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备；

E）用0.4-0.6 mg步骤C）所得柞蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗，将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10 mL，将脾脏碾碎过筛网，然后用1640培养液悬浮，在10000-14000 rpm下离心4-6 min，移除上清液，再洗涤一次，得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×10⁸个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；

F）取步骤E）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1.8-2.2:1的数量比混匀，加培养液后在10000-14000 rpm下离心4-6 min，弃上清液，在35-39℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在10000-14000 rpm下离心，弃上清液后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮；

G）步骤F）所得细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%，利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段；

H）pH 7.4的PBS溶液的制备；

I）对步骤G）所得兔单克隆抗体进行纯化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为58-62 mL/h；用30mL，0.05mol/L，pH 7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液清洗柱子，清洗的流速为115-125 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液进行洗脱；洗脱完成后用0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液洗涤多肽柱，获得纯化后的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体，在1-5℃下储存备用。

2.如权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤C）中，所述透析袋的规格为截留分子量8000。

3.如权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤D）中，所述大白兔为14-16周龄。

4.如权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤D）中，初次免疫和加强免疫时抗原佐剂混合溶液的注射量为100μL。

5.如权利要求1所述的一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤H）中，所述pH 7.4的PBS溶液的制备方法为：称取0.27 g磷酸二氢钾，1.42 g磷酸氢二钠，8 g氯化钠和 0.2 g氯化钾，加入到800 mL去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000mL的容量瓶进行定容，调节溶液的pH为7.4。

6.如权利要求1-5之一所述方法制得的柞蚕丝素蛋白单克隆抗体在文物样品质地鉴定中的应用，其特征在于方法如下：

取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1 μg/mL的浓度在酶标板中包被11-13h，每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35-39℃下封闭110-130min；每孔用200 μL的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将柞蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100 μL柞蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，35-39℃下孵育50-70min，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100 μL 的辣根过氧化酶标二抗，35-39℃下孵育55-65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100 μL的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，9-11min后，加入100 μL，2mol/L的H₂SO₄ 终止反应；用酶标仪测定OD450nm，当OD值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有柞蚕丝；根据此标准，可以判断柞蚕丝素蛋白的存在。