CN109541219A - 一种古代丝织品的免疫印迹检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及文物检测技术领域,公开了一种古代丝织品的免疫印迹检测方法,本发明先利用现代桑蚕丝丝素样品制备特异性单克隆抗体,然后利用固定化木瓜蛋白酶对桑蚕丝抗体进行酶解,得到具有较高活性的Fab抗体片段,将该片段与金纳米粒子复合,得到具有高特异性和灵敏性的Fab‑BM‑Au NP复合物,并将该复合物应用在古代丝织品检测领域,免疫印迹实验结果表明,该复合物能有效地鉴定出丝织品残片。本发明反应温和、环保无害;在对古代丝织品进行检测时,具有样品用量少、直观、快速和高灵敏性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及文物检测技术领域,尤其涉及一种古代丝织品的免疫印迹检测方法。
背景技术
衣、食、住、行是人们的基本生活需求,而不同时代下的衣着反应了当时鲜明的时代特色和地域特色,是研究每个时代社会发展水平的重要依据。丝绸之路是古代中外经济、文化交流之路,是贯穿东西方文明的一座桥梁,带来不同区域艺术的相互交融。
中国是世界上最早产生纺织品的国家之一。早在原始社会,人们就掌握了简单的纺织技术,通过搓、编、织将野生的麻等做成衣服以取代防寒保暖、遮羞蔽体的动物毛皮。随着农业、桑蚕业和畜牧业的发展,形成了以麻、丝、毛的为主要纺织原材料的中国古代纺织品体系。在漫长的历史长河中,纺织品文物见证了我国社会更替、经济发展和文化交融,是研究我国古代社会经济技术文化水平的珍贵史料。目前出土的纺织品中,蛋白类纺织品占多数。该类纺织品易受到墓葬环境中水分、温度、酸碱度及微生物等影响而发生老化分解,从而引起大分子链的断裂,肽段的降解,出土时已成为碎片、微痕迹。因此,针对蛋白类纺织品文物的特点,建立科学有效的方法确定纺织品文物的种属,对追溯纺织品起源和研究人类文明有着十分重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种古代丝织品的免疫印迹检测方法。利用本发明方法对古代丝织品残片进行鉴别时,具有直观、准确、高灵敏性的特点。
本发明的具体技术方案为:一种古代丝织品的免疫印迹检测方法,包括以下步骤:
1)蚕丝特异性抗体的制备:称取桑蚕丝,经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后,得到桑蚕丝丝素蛋白粉末;将桑蚕丝丝素蛋白粉末溶解在PBS中注射进SPF级Balb/C纯种雌性小鼠体内,经多次脾脏免疫后,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经克隆、筛选、培养和纯化后,得到桑蚕丝丝素蛋白单克隆抗体。
2)Fab片段抗体的制备:先在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化,同时将步骤1)中所得抗体在buffer交换柱中进行前处理,得到抗体溶液;将抗体溶液加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中,拧紧柱子盖子,置于35-39℃恒温震荡孵化箱中酶解反应,采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后,得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体。
在步骤2)中,本发明选用固定化木瓜蛋白酶制备Fab片段抗体。木瓜蛋白酶在催化过程中首先与底物快速结合,接着酶活性中心的巯基被底物的羰基酰化,形成酰化酶,最后是酰化酶的分解,生成产物,酶恢复到初始状态。与游离酶切相比,固定化木瓜蛋白酶可更好地控制消化过程,酶解程度可通过控制时间来调节,可快速有效地将酶解产物和酶分开,无酶-抗体结合物的产生。同时,固定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸碱和有机介质中失活,热稳定性提高,实现酶的反复利用,达到节约生产成本的目的。通过活化,可以提高酶活性,增加酶解速率。
3)Fab-BM-Au NP复合物的制备:将步骤2)所得桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体进行硫醇化处理后,分别取50-80 μL加入到Au NP溶液中,于35-39℃恒温震荡孵化箱中反应40-50min,11000-14000rpm 离心10-20min后,重新分散在PBST中,得到Fab-BM-Au NP复合物。
在步骤3)中,本发明对Fab片段抗体与金纳米粒子进行连接,制备Fab-Au NP复合物,可以放大检出信号,可以提高检测的灵敏性。
4)称取古代丝织品残片作为样品,以1:90-110的浴比在0.4-0.6wt%的Na2CO3溶液中煮沸20-40min,重复两次完成脱胶,样品用去离子水小心清洗3-5次,放入35-39℃烘箱低温烘干。
5)称取步骤4)中处理过的古代丝织品残片,浸入钙醇溶液中加热溶解,经透析、过滤和冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末,待用。
6)取步骤5)所得丝素蛋白粉末,溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液中,得到8-12mg/mL的蛋白溶液,将蛋白溶液与还原性上样缓冲液5X loading以3.5-4.5:1的体积比混合,在96-100℃加热8-12min,进行蛋白变性处理,冷却至室温后,于6000-10000rpm 离心3-7min,取上清液作为电泳样品。
7)电泳:将电泳样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中,免染胶上层为浓缩胶,下层为分离胶;在恒压条件下进行电泳:80 V跑浓缩胶,8-12min后120 V跑分离胶,直至样品跑至凝胶底部,停止电泳,将凝胶取出后,放入化学发光仪中观察凝胶图像。
8)转印:裁剪一张尺寸大于凝胶的PVDF膜,一角做标记,用甲醇浸泡0.5-1.5 min进行活化处理后,将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡20-40 min,而后按照“海绵片—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵片”的顺序,搭建转印“三明治”,并将其放入转移装置中,倒入转印缓冲液后,在冰浴条件下200 -300 mA恒流转印1.5-2 h,转印完成后,将膜取出,放入化学发光仪中观察转印情况。
步骤8)中完成转印之后,选择在在化学发光系统中观察转印图像,可以确保实验操作的准确行和实验结果的正确性,以便进行之后的免疫实验。
9)免疫:将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中,加入4-6%的脱脂奶粉TBST溶液封闭0.5-1.5 h,加入Fab-BM-Au NP复合物稀释溶液,在室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h;而后用TBST洗涤3次,每次5-10 min,加入HRP标记的二抗稀释溶液,于室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h,重复洗涤步骤。
10)显色:将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中,避光4-6 min,将PVDF膜放入化学发光仪中成像,观察免疫条带,若可观察到免疫条带,则表明古代丝织品残片为桑蚕丝。
作为优选,步骤5)中,丝素蛋白粉末的制备方法具体如下:将古代丝织品残片以1:45-55的浴比浸入摩尔比为CaCl2: H2O: C2H5OH的钙醇溶液中,在96-98℃ 下加热1-2 h,然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于1-5℃条件下透析40-60 h,除去溶剂小分子;将透析后的蛋白溶液进行过滤处理,除去未溶解的杂质分子,得到纯净的丝素蛋白溶液,经冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末,待用。
步骤5)中使用钙醇溶液对古代丝织品残片进行溶解,可以减少对蛋白结构的破坏,最大程度保证其结构完整性;选择在低温条件下进行透析,可以减少透析过程中的蛋白损失,保证结果的准确性;
作为优选,步骤6)中,还原性上样缓冲液5X loading的配方为:2.5 mL 0.5mol/L Tris▪HCl, 0.39g二硫苏糖醇,0.5g SDS,0.025g溴酚蓝,2.5 mL甘油。
作为优选,步骤6)中将蛋白溶液与还原性上样缓冲液混合沸煮。上样缓冲液中含有二硫苏糖醇,抗体特异性识别目标蛋白的部位(即抗原表位)可能存在于蛋白三维构型内部,为了能使抗体接近抗原表位,必须将蛋白的三维构型打开,而上样缓冲液中含有二硫苏糖醇,可以还原蛋白中的二硫键,从而使蛋白变性。
作为优选,步骤7)中,所述免染胶的制备方法具体方法如下:采用TGX快速免染制胶试剂盒,根据蛋白分子量选取8-12%的凝胶浓度,先将分离胶的A、B液等体积混合,加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺,混合均匀后倒入制胶架内,用异丙醇将液面压平,于35-39℃干燥15-20 min;而后将浓缩胶的A、B液等体积混合,加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺,混合均匀后倒入制胶架内,插入梳子,于35-39℃下干燥10-15 min。
步骤7)中选择TGX快速免染胶进行凝胶电泳,可以实现电泳和免疫同一张胶,确保实验结果的准确性;无需染色,操作方便,快捷有效。
作为优选,步骤2)中,固定化木瓜蛋白酶活化的方法具体为:将0.2-0.3mL木瓜蛋白酶溶液加入0.7-0.9 mL分离柱中,将分离柱放入离心管内,8000-12000 rmp离心0.5-1.5min,弃去离心出来的蛋白储存液,加入0.4-0.6 mL 18-22mM半胱氨酸消化液,重复离心,弃去离心出来的液体,用橡胶管密封分离柱底部,待用。
作为优选,步骤2)中,抗体的前处理的方法具体如下:将Buffer交换柱放入离心管内,2000-4000rpm 离心1-3 min,弃去离心出来的存储液,加入 0.8-1.2mL 18-22 mM半胱氨酸消化液,2000-4000rpm离心1-3min,弃去离心出来的液体,重复离心2-4次;吸取 0.4-0.6m L抗体加入到柱子中,并将柱子放入新的离心管中,2000-4000rpm离心1-3min,收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液,待用。
本发明先对用半胱氨酸溶液对抗体进行前处理。IgG和Fab片段由二硫键维持其结构稳定和保持活性,其二硫键分为链内二硫键和链间二硫键。链内二硫键在免疫球蛋白折叠内是高度保守的,对于维持抗体及片段的结构稳定和保持活性具有十分重要的作用,半胱氨酸溶液可以将其破坏,部分还原,有利于酶解进行。
作为优选,步骤2)中,酶解制备Fab片段抗体的具体条件如下:酶和抗体的质量比为 0.0080-0.0090 mg酶/mg IgG,采用20 mM Cys浓度的消化液,酶解时间7.5-8.5h;孵育完成后,将分离柱放入离心管中,8000-12000 rpm 离心1-3 min,收集离心出来的酶解液,再加入0.25 mL PBS 到柱子中,放入离心管中,8000-12000rpm离心1-3min,重复清洗两次,将离心出来的液体计入到酶解液中,共得到1 mL的酶解液。
木瓜蛋白酶因不是特异性酶,其酶切位点不止一个,因此酶解时可能也会对抗体暴露出来的具有延伸性的部位(如重链和轻链的 N 端)进行酶切,从而得到更小的片段,因此需要控制好酶解反应时间、酶和抗体的质量比、酶解环境的pH。
作为优选,步骤2)中,Fab片段抗体的分离纯化方法具体如下:用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段,收集含有Fab片段的流出物;然后将流出物在20mM Tris、25mM NaCl中透析后,在HiTrap Q FF柱上通过阴离子交换色谱进一步纯化,用20mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱,通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段抗体。
作为优选,步骤3)中,Fab片段抗体硫醇化的方法具体如下:按体积比1:8-12将10μM HS−(CH2)10−N-羟基琥珀酰亚胺基-11-巯基十一酸酯的四氢呋喃溶液与抗体 Fab片段溶液混合,在室温下搅拌40-50min。
步骤3)中使用HS−(CH2)10−羟基琥珀酰亚胺基-11-巯基十一酸酯对Fab片段抗体进行硫醇化处理。HS−(CH2)10−NHS是一种用于官能化硫醇配体化合物,可用于基片类材料、各种生物化学以及材料表面改性,本发明将其与抗体结合,可以与金纳米粒子形成Au-S键,保证Fab-Au NP复合物的形成和稳定。
与现有技术对比,本发明的有益效果是:
(1)本发明选择Fab片段抗体作为免疫结合的复合物的核心部分。Fab片段抗体是第三代基因工程抗体,较好地保持了天然抗体分子的抗原结合部位结构;同时,其分子量只有完整抗体的 1/6-1/2大小,具有分子量小、免疫原性低、穿透性强、不与 Fc 受体结合等特点,在食品安全检测、结构生物学研究等方面显示出前两代抗体无法比拟的优点。
(2)本发明选择酶解法制备Fab片段抗体。酶解制备法生产成本低、转化率高、工艺简便,只需简便的纯化操作便可得到高纯度 Fab片段抗体,尤其适合非重组 Fab 抗体片段的制备,是制备 Fab片段抗体的一种便捷且经济的途径。
(3)本发明制备Fab-Au NP复合物进行丝织品残片的免疫检测,该复合物因连接有大量Fab片段,因此具有放大检测信号的作用,大大提高了检测灵敏度。
(4)本发明采用免染胶进行电泳实验,既方便操作,又节约实验时间,同时实现一张膜进行显色和免疫,保证实验结果的准确性。
(5)本发明在电泳、转印和 免疫后,都可以对胶(膜)进行观察,可以确保实验操作的正确性和实验结果的准确性。
(6)本发明样品用量少,可以直观、准确、高灵敏性地鉴别出不同种类的丝素蛋白,特别是针对腐坏严重、检验困难的古代丝织品残片。
附图说明
图1为本发明实施例1的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)蚕丝特异性抗体的制备:称取桑蚕丝,经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末。将丝素蛋白粉末溶解在PBS(1mg/mL)中注射进SPF 级 Balb/C 纯种雌性小鼠体内,经多次脾脏免疫后,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经克隆、筛选、培养和纯化后,得到桑蚕丝素蛋白单克隆抗体(McAb)。
2)Fab片段抗体的制备:选取固定化木瓜蛋白酶酶解制备Fab片段。在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化,将0.25 mL木瓜蛋白酶溶液加入0.8 mL分离柱中,将分离柱放入2 mL的离心管内,10000 rmp 离心1 min,弃去离心出来的蛋白储存液,加入0.5 mL 20mM 半胱氨酸消化液,重复离心,弃去离心出来的液体,用橡胶管密封分离柱底部,待用。同时,将1)中制备的抗体在Buffer交换柱中进行前处理,将 Buffer 交换柱放入离心管内,3000 rpm 离心2 min,弃去离心出来的存储液。加入 1mL 20 mM 半胱氨酸消化液到柱子中,3000 rpm离心2 min,弃去离心出来的液体,重复离心 3 次。吸取 0.5 m L 抗体加入到柱子中,并将柱子放入新的离心管中,3000 rpm离心 2 min,收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液,将抗体溶液加入到活化好的固定化木瓜蛋白酶中,拧紧柱子的盖子,保证酶和抗体的质量比为 0.0080 mg 酶/mg IgG,20 mM Cys 浓度的消化液(pH 为 7)、酶解时间控制在7.5 小时,放入37 ºC恒温震荡孵化箱中反应。孵育完成后,将分离柱放入2mL离心管中,10000 rpm 离心 1 min,收集离心出来的酶解液。再加入0.25 mL PBS 到柱子中,放入2 mL离心管中,10000 rpm 离心 1 min,重复清洗两次,将离心出来的液体计入到酶解液中,共得到1 mL的酶解液。采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后,用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段,收集含有Fab片段的流出物;然后将流出物在20 mMTris (pH 8.5)、25 mM NaCl中透析后,在HiTrap Q FF柱(GE Healthcare)上通过阴离子交换色谱进一步纯化,用20 mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱。通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段。最终得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体(Fab-BM)。
3)Fab/Au NP复合物的制备:将2)中得到的Fab片段抗体进行硫醇化,即将10μL 10μM HS−(CH2)15−NHS(N-羟基琥珀酰亚胺基-16-巯基十六酸酯)溶液(溶于四氢呋喃)与100 μL Fab片段溶液混合,在室温下搅拌45min后,取80 μL加入到Au NP 溶液中,于37℃恒温震荡孵化箱中反应45 min。13000 rpm 离心15 min后,重新分散在TBST中,得到Fab-BM-Au NP复合物。
4)称取一定质量的古代丝织品残片,以1:100的浴比在 0.5% Na2CO3溶液中煮沸30min,重复两次完成脱胶。样品用去离子水小心清洗3次,放入37℃烘箱,低温烘干。
5)称取0.3g 4)中处理过的丝织品残片,以1:50的浴比浸入CaCl2: H2O: C2H5OH(=1:8:2,摩尔比)溶液中,在96℃ 下加热2 h。然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于4℃条件下透析48 h,除去溶剂小分子;将透析后的蛋白溶液进行过滤处理,除去未溶解的杂质分子,可得到纯净的丝素蛋白溶液。经冷冻干燥后,可得到丝素蛋白粉末,待用。
6)取10mg丝素蛋白粉末,溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液(CB 9.6)中,得到10mg/mL的蛋白溶液。将该蛋白溶液与还原性5X loading(上样缓冲液)以4:1的体积混合,在96℃加热10min,进行蛋白变性处理,冷却至室温后,于8000rpm 离心5 min,取上清液作为电泳样品。
7)电泳:采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶,根据蛋白分子量选取10%的凝胶浓度,先将分离胶的A、B液等体积混合,加入10%过硫酸铵(引发剂)和TEMED(四甲基乙二胺),混合均匀后倒入制胶架内,用异丙醇将液面压平,于37℃干燥15 min;而后将浓缩胶的A、B液等体积混合,加入10%过硫酸铵(引发剂)和TEMED(四甲基乙二胺),混合均匀后倒入制胶架内,插入梳子,于37℃下干燥10 min。将蛋白样品和蛋白质Marker加入制加样孔中,在恒压条件下进行电泳:80 V跑浓缩胶,10 min后120 V跑分离胶,直至样品跑至凝胶底部,停止电泳。将凝胶取出后,放入化学发光仪中观察凝胶图像。
8)转印:裁剪一张略大于凝胶的PVDF膜,一角做标记,用甲醇浸泡1 min进行活化处理后,将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡30 min,而后按照“海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵”的顺序,搭建转印“三明治”,并将其放入转移装置中,倒入转印缓冲液后,在冰浴条件下300 mA恒流转印1.5 h。转印完成后,将膜取出,放入化学发光仪中观察转印情况。
9)免疫:将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中,加入5%脱脂奶粉(溶于TBST)封闭1 h。加入Fab/Au NP复合物(1:1000)稀释溶液10 mL,在室温条件下摇床孵育1 h;而后用TBST洗涤3次,每次10 min,加入HRP标记的二抗稀释溶液10 mL,于室温条件下摇床孵育1h,重复洗涤步骤。
10)显色:将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中,避光5 min,将膜放入化学发光仪中成像,观察免疫条带。若可以观察到免疫条带,则表明该古代丝织品为桑蚕丝。
按照实施例1的方法进行实际检测后,检测结果如图1所示,实验检测证明,该Fab-Au NP复合物具有特异性和高灵敏度,并且证明该丝织品残片为桑蚕丝。
实施例2
1)蚕丝特异性抗体的制备:称取桑蚕丝,经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末。将丝素蛋白粉末溶解在PBS(1mg/mL)中注射进SPF 级 Balb/C 纯种雌性小鼠体内,经多次脾脏免疫后,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经克隆、筛选、培养和纯化后,得到桑蚕丝素蛋白单克隆抗体(McAb)。
2)Fab片段抗体的制备:选取固定化木瓜蛋白酶酶解制备Fab片段。在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化,将0.25 mL木瓜蛋白酶溶液加入0.8 mL分离柱中,将分离柱放入2 mL的离心管内,10000 rmp 离心1 min,弃去离心出来的蛋白储存液,加入0.5 mL 20mM 半胱氨酸消化液,重复离心,弃去离心出来的液体,用橡胶管密封分离柱底部,待用。同时,将1)中制备的抗体在Buffer交换柱中进行前处理,将 Buffer 交换柱放入离心管内,3000 rpm 离心2 min,弃去离心出来的存储液。加入 1mL 20 mM 半胱氨酸消化液到柱子中,3000 rpm离心2 min,弃去离心出来的液体,重复离心 3 次。吸取 0.5 m L 抗体加入到柱子中,并将柱子放入新的离心管中,3000 rpm离心 2 min,收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液,将抗体溶液加入到活化好的固定化木瓜蛋白酶中,拧紧柱子的盖子,保证酶和抗体的质量比为 0.0080 mg 酶/mg IgG,20 mM Cys 浓度的消化液(pH 为 7)、酶解时间控制在8 小时,放入37 ºC恒温震荡孵化箱中反应。孵育完成后,将分离柱放入2mL离心管中,10000rpm 离心 1 min,收集离心出来的酶解液。再加入0.25 mL PBS 到柱子中,放入2 mL离心管中,10000 rpm 离心 1 min,重复清洗两次,将离心出来的液体计入到酶解液中,共得到1mL的酶解液。采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后,用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段,收集含有Fab片段的流出物;然后将流出物在20 mMTris (pH 8.5)、25 mM NaCl中透析后,在HiTrap Q FF柱(GE Healthcare)上通过阴离子交换色谱进一步纯化,用20 mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱。通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段。最终得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体(Fab-BM)。
3)Fab/Au NP复合物的制备:将2)中得到的Fab片段抗体进行硫醇化,即将10μL 10μM HS−(CH2)15−NHS(N-羟基琥珀酰亚胺基-16-巯基十六酸酯)溶液(溶于四氢呋喃)与100 μL Fab片段溶液混合,在室温下搅拌45min后,取80 μL加入到Au NP 溶液中,于37℃恒温震荡孵化箱中反应45 min。13000 rpm 离心15 min后,重新分散在TBST中,得到Fab-BM-Au NP复合物。
4)称取一定质量的古代丝织品残片,以1:100的浴比在 0.5% Na2CO3溶液中煮沸30min,重复两次完成脱胶。样品用去离子水小心清洗4次,放入37℃烘箱,低温烘干。
5)称取0.3g 4)中处理过的丝织品残片,以1:50的浴比浸入CaCl2: H2O: C2H5OH(=1:8:2,摩尔比)溶液中,在97℃ 下加热2 h。然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于4℃条件下透析48 h,除去溶剂小分子;将透析后的蛋白溶液进行过滤处理,除去未溶解的杂质分子,可得到纯净的丝素蛋白溶液。经冷冻干燥后,可得到丝素蛋白粉末,待用。
6)取10mg丝素蛋白粉末,溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液(CB 9.6)中,得到10mg/mL的蛋白溶液。将该蛋白溶液与还原性5X loading(上样缓冲液)以4:1的体积混合,在98℃加热8min,进行蛋白变性处理,冷却至室温后,于8000rpm 离心5 min,取上清液作为电泳样品。
7)电泳:采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶,根据蛋白分子量选取10%的凝胶浓度,先将分离胶的A、B液等体积混合,加入10%过硫酸铵(引发剂)和TEMED(四甲基乙二胺),混合均匀后倒入制胶架内,用异丙醇将液面压平,于37℃干燥15 min;而后将浓缩胶的A、B液等体积混合,加入10%过硫酸铵(引发剂)和TEMED(四甲基乙二胺),混合均匀后倒入制胶架内,插入梳子,于37℃下干燥10 min。将蛋白样品和蛋白质Marker加入制加样孔中,在恒压条件下进行电泳:80 V跑浓缩胶,10 min后120 V跑分离胶,直至样品跑至凝胶底部,停止电泳。将凝胶取出后,放入化学发光仪中观察凝胶图像。
8)转印:裁剪一张略大于凝胶的PVDF膜,一角做标记,用甲醇浸泡1 min进行活化处理后,将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡30 min,而后按照“海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵”的顺序,搭建转印“三明治”,并将其放入转移装置中,倒入转印缓冲液后,在冰浴条件下250 mA恒流转印2 h。转印完成后,将膜取出,放入化学发光仪中观察转印情况。
9)免疫:将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中,加入5%脱脂奶粉(溶于TBST)封闭1 h。加入Fab/Au NP复合物(1:1000)稀释溶液10 mL,在室温条件下摇床孵育1 h;而后用TBST洗涤3次,每次8 min,加入HRP标记的二抗稀释溶液10 mL,于室温条件下摇床孵育1 h,重复洗涤步骤。
10)显色:将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中,避光5 min,将膜放入化学发光仪中成像,观察免疫条带。若可以观察到免疫条带,则表明该古代丝织品为桑蚕丝。
实施例3
1)蚕丝特异性抗体的制备:称取桑蚕丝,经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末。将丝素蛋白粉末溶解在PBS(1mg/mL)中注射进SPF 级 Balb/C 纯种雌性小鼠体内,经多次脾脏免疫后,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经克隆、筛选、培养和纯化后,得到桑蚕丝素蛋白单克隆抗体(McAb)。
2)Fab片段抗体的制备:选取固定化木瓜蛋白酶酶解制备Fab片段。在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化,将0.25 mL木瓜蛋白酶溶液加入0.8 mL分离柱中,将分离柱放入2 mL的离心管内,10000 rmp 离心1 min,弃去离心出来的蛋白储存液,加入0.5 mL 20mM 半胱氨酸消化液,重复离心,弃去离心出来的液体,用橡胶管密封分离柱底部,待用。同时,将1)中制备的抗体在Buffer交换柱中进行前处理,将 Buffer 交换柱放入离心管内,3000 rpm 离心2 min,弃去离心出来的存储液。加入 1mL 20 mM 半胱氨酸消化液到柱子中,3000 rpm离心2 min,弃去离心出来的液体,重复离心 3 次。吸取 0.5 m L 抗体加入到柱子中,并将柱子放入新的离心管中,3000 rpm离心 2 min,收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液,将抗体溶液加入到活化好的固定化木瓜蛋白酶中,拧紧柱子的盖子,保证酶和抗体的质量比为 0.0080 mg 酶/mg IgG,20 mM Cys 浓度的消化液(pH 为 7)、酶解时间控制在7.5 小时,放入37 ºC恒温震荡孵化箱中反应。孵育完成后,将分离柱放入2mL离心管中,10000 rpm 离心 1 min,收集离心出来的酶解液。再加入0.25 mL PBS 到柱子中,放入2 mL离心管中,10000 rpm 离心 1 min,重复清洗两次,将离心出来的液体计入到酶解液中,共得到1 mL的酶解液。采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后,用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段,收集含有Fab片段的流出物;然后将流出物在20 mMTris (pH 8.5)、25 mM NaCl中透析后,在HiTrap Q FF柱(GE Healthcare)上通过阴离子交换色谱进一步纯化,用20 mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱。通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段。最终得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体(Fab-BM)。
3)Fab/Au NP复合物的制备:将2)中得到的Fab片段抗体进行硫醇化,即将10μL 10μM HS−(CH2)15−NHS(N-羟基琥珀酰亚胺基-16-巯基十六酸酯)溶液(溶于四氢呋喃)与100 μL Fab片段溶液混合,在室温下搅拌45min后,取80 μL加入到Au NP 溶液中,于37℃恒温震荡孵化箱中反应45 min。13000 rpm 离心15 min后,重新分散在TBST中,得到Fab-BM-Au NP复合物。
4)称取一定质量的古代丝织品残片,以1:100的浴比在 0.5% Na2CO3溶液中煮沸30min,重复两次完成脱胶。样品用去离子水小心清洗5次,放入37℃烘箱,低温烘干。
5)称取0.3g 4)中处理过的丝织品残片,以1:50的浴比浸入CaCl2: H2O: C2H5OH(=1:8:2,摩尔比)溶液中,在98℃ 下加热1.5 h。然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于4℃条件下透析48 h,除去溶剂小分子;将透析后的蛋白溶液进行过滤处理,除去未溶解的杂质分子,可得到纯净的丝素蛋白溶液。经冷冻干燥后,可得到丝素蛋白粉末,待用。
6)取10mg丝素蛋白粉末,溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液(CB 9.6)中,得到10mg/mL的蛋白溶液。将该蛋白溶液与还原性5X loading(上样缓冲液)以4:1的体积混合,在100℃加热5min,进行蛋白变性处理,冷却至室温后,于8000rpm 离心5 min,取上清液作为电泳样品。
7)电泳:采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶,根据蛋白分子量选取10%的凝胶浓度,先将分离胶的A、B液等体积混合,加入10%过硫酸铵(引发剂)和TEMED(四甲基乙二胺),混合均匀后倒入制胶架内,用异丙醇将液面压平,于37℃干燥20 min;而后将浓缩胶的A、B液等体积混合,加入10%过硫酸铵(引发剂)和TEMED(四甲基乙二胺),混合均匀后倒入制胶架内,插入梳子,于37℃下干燥15 min。将蛋白样品和蛋白质Marker加入制加样孔中,在恒压条件下进行电泳:80 V跑浓缩胶,10 min后120 V跑分离胶,直至样品跑至凝胶底部,停止电泳。将凝胶取出后,放入化学发光仪中观察凝胶图像。
8)转印:裁剪一张略大于凝胶的PVDF膜,一角做标记,用甲醇浸泡1 min进行活化处理后,将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡30 min,而后按照“海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵”的顺序,搭建转印“三明治”,并将其放入转移装置中,倒入转印缓冲液后,在冰浴条件下300 mA恒流转印1.5 h。转印完成后,将膜取出,放入化学发光仪中观察转印情况。
9)免疫:将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中,加入5%脱脂奶粉(溶于TBST)封闭1 h。加入Fab/Au NP复合物(1:1000)稀释溶液10 mL,在室温条件下摇床孵育1 h;而后用TBST洗涤3次,每次5 min,加入HRP标记的二抗稀释溶液10 mL,于室温条件下摇床孵育1 h,重复洗涤步骤。
10)显色:将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中,避光5 min,将膜放入化学发光仪中成像,观察免疫条带。若可以观察到免疫条带,则表明该古代丝织品为桑蚕丝。
本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1.一种古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于包括以下步骤:
1)蚕丝特异性抗体的制备:称取桑蚕丝,经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后,得到桑蚕丝丝素蛋白粉末;将桑蚕丝丝素蛋白粉末溶解在PBS中注射进SPF级Balb/C纯种雌性小鼠体内,经多次脾脏免疫后,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经克隆、筛选、培养和纯化后,得到桑蚕丝丝素蛋白单克隆抗体;
2)Fab片段抗体的制备:先在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化,同时将步骤1)中所得抗体在buffer交换柱中进行前处理,得到抗体溶液;将抗体溶液加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中,拧紧柱子盖子,置于35-39℃恒温震荡孵化箱中酶解反应,采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后,得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体;
3)Fab-BM-Au NP复合物的制备:将步骤2)所得桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体进行硫醇化处理后,分别取50-80 μL加入到Au NP溶液中,于35-39℃恒温震荡孵化箱中反应40-50min,11000-14000rpm 离心10-20min后,重新分散在PBST中,得到Fab-BM-Au NP复合物;
4)称取古代丝织品残片作为样品,以1:90-110的浴比在0.4-0.6wt%的Na2CO3溶液中煮沸20-40min,重复两次完成脱胶,样品用去离子水小心清洗3-5次,放入35-39℃烘箱低温烘干;
5)称取步骤4)中处理过的古代丝织品残片,浸入钙醇溶液中加热溶解,经透析、过滤和冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末,待用;
6)取步骤5)所得丝素蛋白粉末,溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液中,得到8-12mg/mL的蛋白溶液,将蛋白溶液与还原性上样缓冲液5X loading以3.5-4.5:1的体积比混合,在96-100℃加热8-12min,进行蛋白变性处理,冷却至室温后,于6000-10000rpm 离心3-7min,取上清液作为电泳样品;
7)电泳:将电泳样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中,免染胶上层为浓缩胶,下层为分离胶;在恒压条件下进行电泳:80 V跑浓缩胶,8-12min后120 V跑分离胶,直至样品跑至凝胶底部,停止电泳,将凝胶取出后,放入化学发光仪中观察凝胶图像;
8)转印:裁剪一张尺寸大于凝胶的PVDF膜,一角做标记,用甲醇浸泡0.5-1.5 min进行活化处理后,将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡20-40 min,而后按照“海绵片—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵片”的顺序,搭建转印“三明治”,并将其放入转移装置中,倒入转印缓冲液后,在冰浴条件下200 -300 mA恒流转印1.5-2 h,转印完成后,将膜取出,放入化学发光仪中观察转印情况;
9)免疫:将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中,加入4-6%的脱脂奶粉TBST溶液封闭0.5-1.5 h,加入Fab-BM-Au NP复合物稀释溶液,在室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h;而后用TBST洗涤3次,每次5-10 min,加入HRP标记的二抗稀释溶液,于室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h,重复洗涤步骤;
10)显色:将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中,避光4-6 min,将PVDF膜放入化学发光仪中成像,观察免疫条带,若可观察到免疫条带,则表明古代丝织品残片为桑蚕丝。
2.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤5)中,丝素蛋白粉末的制备方法具体如下:将古代丝织品残片以1:45-55的浴比浸入摩尔比为CaCl2:H2O: C2H5OH的钙醇溶液中,在96-98℃ 下加热1-2 h,然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于1-5℃条件下透析40-60 h,除去溶剂小分子;将透析后的蛋白溶液进行过滤处理,除去未溶解的杂质分子,得到纯净的丝素蛋白溶液,经冷冻干燥后,得到丝素蛋白粉末,待用。
3.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤6)中,还原性上样缓冲液5X loading的配方为:2.5 mL 0.5mol/L Tris ▪HCl, 0.39g二硫苏糖醇,0.5g SDS,0.025g溴酚蓝,2.5 mL甘油。
4.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤7)中,所述免染胶的制备方法具体方法如下:采用TGX快速免染制胶试剂盒,根据蛋白分子量选取8-12%的凝胶浓度,先将分离胶的A、B液等体积混合,加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺,混合均匀后倒入制胶架内,用异丙醇将液面压平,于35-39℃干燥15-20 min;而后将浓缩胶的A、B液等体积混合,加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺,混合均匀后倒入制胶架内,插入梳子,于35-39℃下干燥10-15 min。
5.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤2)中,固定化木瓜蛋白酶活化的方法具体为:将0.2-0.3mL木瓜蛋白酶溶液加入0.7-0.9 mL分离柱中,将分离柱放入离心管内,8000-12000 rmp离心0.5-1.5 min,弃去离心出来的蛋白储存液,加入0.4-0.6 mL 18-22mM半胱氨酸消化液,重复离心,弃去离心出来的液体,用橡胶管密封分离柱底部,待用。
6.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤2)中,抗体的前处理的方法具体如下:将Buffer交换柱放入离心管内,2000-4000rpm 离心1-3 min,弃去离心出来的存储液,加入 0.8-1.2mL 18-22 mM半胱氨酸消化液,2000-4000rpm离心1-3min,弃去离心出来的液体,重复离心2-4次;吸取 0.4-0.6m L抗体加入到柱子中,并将柱子放入新的离心管中,2000-4000rpm离心1-3min,收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液,待用。
7.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤2)中,酶解制备Fab片段抗体的具体条件如下:酶和抗体的质量比为 0.0080-0.0090 mg酶/mg IgG,采用20 mM Cys浓度的消化液,酶解时间7.5-8.5h;孵育完成后,将分离柱放入离心管中,8000-12000 rpm 离心1-3 min,收集离心出来的酶解液,再加入0.25 mL PBS 到柱子中,放入离心管中,8000-12000rpm离心1-3min,重复清洗两次,将离心出来的液体计入到酶解液中,共得到1 mL的酶解液。
8.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤2)中,Fab片段抗体的分离纯化方法具体如下:用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段,收集含有Fab片段的流出物;然后将流出物在20mM Tris、25mM NaCl中透析后,在HiTrap Q FF柱上通过阴离子交换色谱进一步纯化,用20mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱,通过在PBS中的Superdex200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段抗体。
9.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤3)中,Fab片段抗体硫醇化的方法具体如下:按体积比1:8-12将10μM HS−(CH2)10−N-羟基琥珀酰亚胺基-11-巯基十一酸酯的四氢呋喃溶液与抗体 Fab片段溶液混合,在室温下搅拌40-50min。
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