CN109541219B - 一种古代丝织品的免疫印迹检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种古代丝织品的免疫印迹检测方法，本发明先利用现代桑蚕丝丝素样品制备特异性单克隆抗体，然后利用固定化木瓜蛋白酶对桑蚕丝抗体进行酶解，得到具有较高活性的Fab抗体片段，将该片段与金纳米粒子复合，得到具有高特异性和灵敏性的Fab‑BM‑Au NP复合物，并将该复合物应用在古代丝织品检测领域，免疫印迹实验结果表明，该复合物能有效地鉴定出丝织品残片。本发明反应温和、环保无害；在对古代丝织品进行检测时，具有样品用量少、直观、快速和高灵敏性的特点。

Description

一种古代丝织品的免疫印迹检测方法

技术领域

本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种古代丝织品的免疫印迹检测方法。

背景技术

衣、食、住、行是人们的基本生活需求，而不同时代下的衣着反应了当时鲜明的时代特色和地域特色，是研究每个时代社会发展水平的重要依据。丝绸之路是古代中外经济、文化交流之路，是贯穿东西方文明的一座桥梁，带来不同区域艺术的相互交融。

中国是世界上最早产生纺织品的国家之一。早在原始社会，人们就掌握了简单的纺织技术，通过搓、编、织将野生的麻等做成衣服以取代防寒保暖、遮羞蔽体的动物毛皮。随着农业、桑蚕业和畜牧业的发展，形成了以麻、丝、毛的为主要纺织原材料的中国古代纺织品体系。在漫长的历史长河中，纺织品文物见证了我国社会更替、经济发展和文化交融，是研究我国古代社会经济技术文化水平的珍贵史料。目前出土的纺织品中，蛋白类纺织品占多数。该类纺织品易受到墓葬环境中水分、温度、酸碱度及微生物等影响而发生老化分解，从而引起大分子链的断裂，肽段的降解，出土时已成为碎片、微痕迹。因此，针对蛋白类纺织品文物的特点，建立科学有效的方法确定纺织品文物的种属，对追溯纺织品起源和研究人类文明有着十分重要的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种古代丝织品的免疫印迹检测方法。利用本发明方法对古代丝织品残片进行鉴别时，具有直观、准确、高灵敏性的特点。

本发明的具体技术方案为：一种古代丝织品的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：

1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，得到桑蚕丝丝素蛋白粉末；将桑蚕丝丝素蛋白粉末溶解在PBS中注射进SPF级Balb/C纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白单克隆抗体。

2）Fab片段抗体的制备：先在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，同时将步骤1）中所得抗体在buffer交换柱中进行前处理，得到抗体溶液；将抗体溶液加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子盖子，置于35-39℃恒温震荡孵化箱中酶解反应，采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体。

在步骤2）中，本发明选用固定化木瓜蛋白酶制备Fab片段抗体。木瓜蛋白酶在催化过程中首先与底物快速结合，接着酶活性中心的巯基被底物的羰基酰化，形成酰化酶，最后是酰化酶的分解，生成产物，酶恢复到初始状态。与游离酶切相比，固定化木瓜蛋白酶可更好地控制消化过程，酶解程度可通过控制时间来调节，可快速有效地将酶解产物和酶分开，无酶-抗体结合物的产生。同时，固定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸碱和有机介质中失活，热稳定性提高，实现酶的反复利用，达到节约生产成本的目的。通过活化，可以提高酶活性，增加酶解速率。

3）Fab-BM-Au NP复合物的制备：将步骤2）所得桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体进行硫醇化处理后，分别取50-80 μL加入到Au NP溶液中，于35-39℃恒温震荡孵化箱中反应40-50min，11000-14000rpm 离心10-20min后，重新分散在PBST中，得到Fab-BM-Au NP复合物。

在步骤3）中，本发明对Fab片段抗体与金纳米粒子进行连接，制备Fab-Au NP复合物，可以放大检出信号，可以提高检测的灵敏性。

4）称取古代丝织品残片作为样品，以1:90-110的浴比在0.4-0.6wt%的Na₂CO₃溶液中煮沸20-40min，重复两次完成脱胶，样品用去离子水小心清洗3-5次，放入35-39℃烘箱低温烘干。

5）称取步骤4）中处理过的古代丝织品残片，浸入钙醇溶液中加热溶解，经透析、过滤和冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末，待用。

6）取步骤5）所得丝素蛋白粉末，溶于Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中，得到8-12mg/mL的蛋白溶液，将蛋白溶液与还原性上样缓冲液5X loading以3.5-4.5:1的体积比混合，在96-100℃加热8-12min，进行蛋白变性处理，冷却至室温后，于6000-10000rpm 离心3-7min，取上清液作为电泳样品。

7）电泳：将电泳样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中，免染胶上层为浓缩胶，下层为分离胶；在恒压条件下进行电泳：80 V跑浓缩胶，8-12min后120 V跑分离胶，直至样品跑至凝胶底部，停止电泳，将凝胶取出后，放入化学发光仪中观察凝胶图像。

8）转印：裁剪一张尺寸大于凝胶的PVDF膜，一角做标记，用甲醇浸泡0.5-1.5 min进行活化处理后，将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡20-40 min，而后按照“海绵片—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵片”的顺序，搭建转印“三明治”，并将其放入转移装置中，倒入转印缓冲液后，在冰浴条件下200 -300 mA恒流转印1.5-2 h，转印完成后，将膜取出，放入化学发光仪中观察转印情况。

步骤8）中完成转印之后，选择在在化学发光系统中观察转印图像，可以确保实验操作的准确行和实验结果的正确性，以便进行之后的免疫实验。

9）免疫：将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中，加入4-6%的脱脂奶粉TBST溶液封闭0.5-1.5 h，加入Fab-BM-Au NP复合物稀释溶液，在室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h；而后用TBST洗涤3次，每次5-10 min，加入HRP标记的二抗稀释溶液，于室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h，重复洗涤步骤。

10）显色：将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中，避光4-6 min，将PVDF膜放入化学发光仪中成像，观察免疫条带，若可观察到免疫条带，则表明古代丝织品残片为桑蚕丝。

作为优选，步骤5）中，丝素蛋白粉末的制备方法具体如下：将古代丝织品残片以1:45-55的浴比浸入摩尔比为CaCl₂: H₂O: C₂H₅OH的钙醇溶液中，在96-98℃ 下加热1-2 h，然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于1-5℃条件下透析40-60 h，除去溶剂小分子；将透析后的蛋白溶液进行过滤处理，除去未溶解的杂质分子，得到纯净的丝素蛋白溶液，经冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末，待用。

步骤5）中使用钙醇溶液对古代丝织品残片进行溶解，可以减少对蛋白结构的破坏，最大程度保证其结构完整性；选择在低温条件下进行透析，可以减少透析过程中的蛋白损失，保证结果的准确性；

作为优选，步骤6）中，还原性上样缓冲液5X loading的配方为：2.5 mL 0.5mol/LTris ▪HCl, 0.39g二硫苏糖醇，0.5g SDS，0.025g溴酚蓝，2.5 mL甘油。

作为优选，步骤6）中将蛋白溶液与还原性上样缓冲液混合沸煮。上样缓冲液中含有二硫苏糖醇，抗体特异性识别目标蛋白的部位（即抗原表位）可能存在于蛋白三维构型内部，为了能使抗体接近抗原表位，必须将蛋白的三维构型打开，而上样缓冲液中含有二硫苏糖醇，可以还原蛋白中的二硫键，从而使蛋白变性。

作为优选，步骤7）中，所述免染胶的制备方法具体方法如下：采用TGX快速免染制胶试剂盒，根据蛋白分子量选取8-12%的凝胶浓度，先将分离胶的A、B液等体积混合，加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺，混合均匀后倒入制胶架内，用异丙醇将液面压平，于35-39℃干燥15-20 min；而后将浓缩胶的A、B液等体积混合，加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺，混合均匀后倒入制胶架内，插入梳子，于35-39℃下干燥10-15 min。

步骤7）中选择TGX快速免染胶进行凝胶电泳，可以实现电泳和免疫同一张胶，确保实验结果的准确性；无需染色，操作方便，快捷有效。

作为优选，步骤2）中，固定化木瓜蛋白酶活化的方法具体为：将0.2-0.3mL木瓜蛋白酶溶液加入0.7-0.9 mL分离柱中，将分离柱放入离心管内，8000-12000 rmp离心0.5-1.5min，弃去离心出来的蛋白储存液，加入0.4-0.6 mL 18-22mM半胱氨酸消化液，重复离心，弃去离心出来的液体，用橡胶管密封分离柱底部，待用。

作为优选，步骤2）中，抗体的前处理的方法具体如下：将Buffer交换柱放入离心管内，2000-4000rpm 离心1-3 min，弃去离心出来的存储液，加入 0.8-1.2mL 18-22 mM半胱氨酸消化液，2000-4000rpm离心1-3min，弃去离心出来的液体，重复离心2-4次；吸取 0.4-0.6m L抗体加入到柱子中，并将柱子放入新的离心管中，2000-4000rpm离心1-3min，收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液，待用。

本发明先对用半胱氨酸溶液对抗体进行前处理。IgG和Fab片段由二硫键维持其结构稳定和保持活性，其二硫键分为链内二硫键和链间二硫键。链内二硫键在免疫球蛋白折叠内是高度保守的，对于维持抗体及片段的结构稳定和保持活性具有十分重要的作用，半胱氨酸溶液可以将其破坏，部分还原，有利于酶解进行。

作为优选，步骤2）中，酶解制备Fab片段抗体的具体条件如下：酶和抗体的质量比为 0.0080-0.0090 mg酶/mg IgG，采用20 mM Cys浓度的消化液，酶解时间7.5-8.5h；孵育完成后，将分离柱放入离心管中，8000-12000 rpm 离心1-3 min，收集离心出来的酶解液，再加入0.25 mL PBS 到柱子中，放入离心管中，8000-12000rpm离心1-3min，重复清洗两次，将离心出来的液体计入到酶解液中，共得到1 mL的酶解液。

木瓜蛋白酶因不是特异性酶，其酶切位点不止一个，因此酶解时可能也会对抗体暴露出来的具有延伸性的部位（如重链和轻链的 N 端）进行酶切，从而得到更小的片段，因此需要控制好酶解反应时间、酶和抗体的质量比、酶解环境的pH。

作为优选，步骤2）中，Fab片段抗体的分离纯化方法具体如下：用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段，收集含有Fab片段的流出物；然后将流出物在20mM Tris、25mM NaCl中透析后，在HiTrap Q FF柱上通过阴离子交换色谱进一步纯化，用20mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱，通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段抗体。

作为优选，步骤3）中，Fab片段抗体硫醇化的方法具体如下：按体积比1:8-12将10μM HS−(CH₂)₁₀−N-羟基琥珀酰亚胺基-11-巯基十一酸酯的四氢呋喃溶液与抗体 Fab片段溶液混合，在室温下搅拌40-50min。

步骤3）中使用HS−(CH₂)₁₀−羟基琥珀酰亚胺基-11-巯基十一酸酯对Fab片段抗体进行硫醇化处理。HS−(CH₂)₁₀−NHS是一种用于官能化硫醇配体化合物，可用于基片类材料、各种生物化学以及材料表面改性，本发明将其与抗体结合，可以与金纳米粒子形成Au-S键，保证Fab-Au NP复合物的形成和稳定。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

（1）本发明选择Fab片段抗体作为免疫结合的复合物的核心部分。Fab片段抗体是第三代基因工程抗体，较好地保持了天然抗体分子的抗原结合部位结构；同时，其分子量只有完整抗体的 1/6-1/2大小，具有分子量小、免疫原性低、穿透性强、不与 Fc 受体结合等特点，在食品安全检测、结构生物学研究等方面显示出前两代抗体无法比拟的优点。

（2）本发明选择酶解法制备Fab片段抗体。酶解制备法生产成本低、转化率高、工艺简便，只需简便的纯化操作便可得到高纯度 Fab片段抗体，尤其适合非重组 Fab 抗体片段的制备，是制备 Fab片段抗体的一种便捷且经济的途径。

（3）本发明制备Fab-Au NP复合物进行丝织品残片的免疫检测，该复合物因连接有大量Fab片段，因此具有放大检测信号的作用，大大提高了检测灵敏度。

（4）本发明采用免染胶进行电泳实验，既方便操作，又节约实验时间，同时实现一张膜进行显色和免疫，保证实验结果的准确性。

（5）本发明在电泳、转印和 免疫后，都可以对胶（膜）进行观察，可以确保实验操作的正确性和实验结果的准确性。

（6）本发明样品用量少，可以直观、准确、高灵敏性地鉴别出不同种类的丝素蛋白，特别是针对腐坏严重、检验困难的古代丝织品残片。

附图说明

图1为本发明实施例1的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末。将丝素蛋白粉末溶解在PBS（1mg/mL）中注射进SPF 级 Balb/C 纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，得到桑蚕丝素蛋白单克隆抗体（McAb）。

2）Fab片段抗体的制备：选取固定化木瓜蛋白酶酶解制备Fab片段。在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，将0.25 mL木瓜蛋白酶溶液加入0.8 mL分离柱中，将分离柱放入2 mL的离心管内，10000 rmp 离心1 min，弃去离心出来的蛋白储存液，加入0.5 mL 20mM 半胱氨酸消化液，重复离心，弃去离心出来的液体，用橡胶管密封分离柱底部，待用。同时，将1）中制备的抗体在Buffer交换柱中进行前处理，将 Buffer 交换柱放入离心管内，3000 rpm 离心2 min，弃去离心出来的存储液。加入 1mL 20 mM 半胱氨酸消化液到柱子中，3000 rpm离心2 min，弃去离心出来的液体，重复离心 3 次。吸取 0.5 m L 抗体加入到柱子中，并将柱子放入新的离心管中，3000 rpm离心 2 min，收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液，将抗体溶液加入到活化好的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子的盖子，保证酶和抗体的质量比为 0.0080 mg 酶/mg IgG，20 mM Cys 浓度的消化液（pH 为 7）、酶解时间控制在7.5 小时，放入37 ºC恒温震荡孵化箱中反应。孵育完成后，将分离柱放入2mL离心管中，10000 rpm 离心 1 min，收集离心出来的酶解液。再加入0.25 mL PBS 到柱子中，放入2 mL离心管中，10000 rpm 离心 1 min，重复清洗两次，将离心出来的液体计入到酶解液中，共得到1 mL的酶解液。采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段，收集含有Fab片段的流出物；然后将流出物在20 mMTris （pH 8.5）、25 mM NaCl中透析后，在HiTrap Q FF柱（GE Healthcare）上通过阴离子交换色谱进一步纯化，用20 mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱。通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段。最终得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体（Fab-BM）。

3）Fab/Au NP复合物的制备：将2）中得到的Fab片段抗体进行硫醇化，即将10μL 10μM HS−(CH₂)₁₅−NHS（N-羟基琥珀酰亚胺基-16-巯基十六酸酯）溶液（溶于四氢呋喃）与100 μL Fab片段溶液混合，在室温下搅拌45min后，取80 μL加入到Au NP 溶液中，于37℃恒温震荡孵化箱中反应45 min。13000 rpm 离心15 min后，重新分散在TBST中，得到Fab-BM-Au NP复合物。

4）称取一定质量的古代丝织品残片，以1:100的浴比在 0.5% Na₂CO₃溶液中煮沸30min，重复两次完成脱胶。样品用去离子水小心清洗3次，放入37℃烘箱，低温烘干。

5）称取0.3g 4）中处理过的丝织品残片，以1:50的浴比浸入CaCl₂: H₂O: C₂H₅OH（=1:8:2，摩尔比）溶液中，在96℃ 下加热2 h。然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于4℃条件下透析48 h，除去溶剂小分子；将透析后的蛋白溶液进行过滤处理，除去未溶解的杂质分子，可得到纯净的丝素蛋白溶液。经冷冻干燥后，可得到丝素蛋白粉末，待用。

6）取10mg丝素蛋白粉末，溶于Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液（CB 9.6）中，得到10mg/mL的蛋白溶液。将该蛋白溶液与还原性5X loading（上样缓冲液）以4:1的体积混合，在96℃加热10min，进行蛋白变性处理，冷却至室温后，于8000rpm 离心5 min，取上清液作为电泳样品。

7）电泳：采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶，根据蛋白分子量选取10%的凝胶浓度，先将分离胶的A、B液等体积混合，加入10%过硫酸铵（引发剂）和TEMED（四甲基乙二胺），混合均匀后倒入制胶架内，用异丙醇将液面压平，于37℃干燥15 min；而后将浓缩胶的A、B液等体积混合，加入10%过硫酸铵（引发剂）和TEMED（四甲基乙二胺），混合均匀后倒入制胶架内，插入梳子，于37℃下干燥10 min。将蛋白样品和蛋白质Marker加入制加样孔中，在恒压条件下进行电泳：80 V跑浓缩胶，10 min后120 V跑分离胶，直至样品跑至凝胶底部，停止电泳。将凝胶取出后，放入化学发光仪中观察凝胶图像。

8）转印：裁剪一张略大于凝胶的PVDF膜，一角做标记，用甲醇浸泡1 min进行活化处理后，将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡30 min，而后按照“海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵”的顺序，搭建转印“三明治”，并将其放入转移装置中，倒入转印缓冲液后，在冰浴条件下300 mA恒流转印1.5 h。转印完成后，将膜取出，放入化学发光仪中观察转印情况。

9）免疫：将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中，加入5%脱脂奶粉（溶于TBST）封闭1 h。加入Fab/Au NP复合物（1:1000）稀释溶液10 mL，在室温条件下摇床孵育1 h；而后用TBST洗涤3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗稀释溶液10 mL，于室温条件下摇床孵育1h，重复洗涤步骤。

10）显色：将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中，避光5 min，将膜放入化学发光仪中成像，观察免疫条带。若可以观察到免疫条带，则表明该古代丝织品为桑蚕丝。

按照实施例1的方法进行实际检测后，检测结果如图1所示，实验检测证明，该Fab-Au NP复合物具有特异性和高灵敏度，并且证明该丝织品残片为桑蚕丝。

实施例2

1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末。将丝素蛋白粉末溶解在PBS（1mg/mL）中注射进SPF 级 Balb/C 纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，得到桑蚕丝素蛋白单克隆抗体（McAb）。

2）Fab片段抗体的制备：选取固定化木瓜蛋白酶酶解制备Fab片段。在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，将0.25 mL木瓜蛋白酶溶液加入0.8 mL分离柱中，将分离柱放入2 mL的离心管内，10000 rmp 离心1 min，弃去离心出来的蛋白储存液，加入0.5 mL 20mM 半胱氨酸消化液，重复离心，弃去离心出来的液体，用橡胶管密封分离柱底部，待用。同时，将1）中制备的抗体在Buffer交换柱中进行前处理，将 Buffer 交换柱放入离心管内，3000 rpm 离心2 min，弃去离心出来的存储液。加入 1mL 20 mM 半胱氨酸消化液到柱子中，3000 rpm离心2 min，弃去离心出来的液体，重复离心 3 次。吸取 0.5 m L 抗体加入到柱子中，并将柱子放入新的离心管中，3000 rpm离心 2 min，收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液，将抗体溶液加入到活化好的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子的盖子，保证酶和抗体的质量比为 0.0080 mg 酶/mg IgG，20 mM Cys 浓度的消化液（pH 为 7）、酶解时间控制在8 小时，放入37 ºC恒温震荡孵化箱中反应。孵育完成后，将分离柱放入2mL离心管中，10000rpm 离心 1 min，收集离心出来的酶解液。再加入0.25 mL PBS 到柱子中，放入2 mL离心管中，10000 rpm 离心 1 min，重复清洗两次，将离心出来的液体计入到酶解液中，共得到1mL的酶解液。采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段，收集含有Fab片段的流出物；然后将流出物在20 mMTris （pH 8.5）、25 mM NaCl中透析后，在HiTrap Q FF柱（GE Healthcare）上通过阴离子交换色谱进一步纯化，用20 mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱。通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段。最终得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体（Fab-BM）。

3）Fab/Au NP复合物的制备：将2）中得到的Fab片段抗体进行硫醇化，即将10μL 10μM HS−(CH₂)₁₅−NHS（N-羟基琥珀酰亚胺基-16-巯基十六酸酯）溶液（溶于四氢呋喃）与100 μL Fab片段溶液混合，在室温下搅拌45min后，取80 μL加入到Au NP 溶液中，于37℃恒温震荡孵化箱中反应45 min。13000 rpm 离心15 min后，重新分散在TBST中，得到Fab-BM-Au NP复合物。

4）称取一定质量的古代丝织品残片，以1:100的浴比在 0.5% Na₂CO₃溶液中煮沸30min，重复两次完成脱胶。样品用去离子水小心清洗4次，放入37℃烘箱，低温烘干。

5）称取0.3g 4）中处理过的丝织品残片，以1:50的浴比浸入CaCl₂: H₂O: C₂H₅OH（=1:8:2，摩尔比）溶液中，在97℃ 下加热2 h。然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于4℃条件下透析48 h，除去溶剂小分子；将透析后的蛋白溶液进行过滤处理，除去未溶解的杂质分子，可得到纯净的丝素蛋白溶液。经冷冻干燥后，可得到丝素蛋白粉末，待用。

6）取10mg丝素蛋白粉末，溶于Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液（CB 9.6）中，得到10mg/mL的蛋白溶液。将该蛋白溶液与还原性5X loading（上样缓冲液）以4:1的体积混合，在98℃加热8min，进行蛋白变性处理，冷却至室温后，于8000rpm 离心5 min，取上清液作为电泳样品。

7）电泳：采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶，根据蛋白分子量选取10%的凝胶浓度，先将分离胶的A、B液等体积混合，加入10%过硫酸铵（引发剂）和TEMED（四甲基乙二胺），混合均匀后倒入制胶架内，用异丙醇将液面压平，于37℃干燥15 min；而后将浓缩胶的A、B液等体积混合，加入10%过硫酸铵（引发剂）和TEMED（四甲基乙二胺），混合均匀后倒入制胶架内，插入梳子，于37℃下干燥10 min。将蛋白样品和蛋白质Marker加入制加样孔中，在恒压条件下进行电泳：80 V跑浓缩胶，10 min后120 V跑分离胶，直至样品跑至凝胶底部，停止电泳。将凝胶取出后，放入化学发光仪中观察凝胶图像。

8）转印：裁剪一张略大于凝胶的PVDF膜，一角做标记，用甲醇浸泡1 min进行活化处理后，将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡30 min，而后按照“海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵”的顺序，搭建转印“三明治”，并将其放入转移装置中，倒入转印缓冲液后，在冰浴条件下250 mA恒流转印2 h。转印完成后，将膜取出，放入化学发光仪中观察转印情况。

9）免疫：将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中，加入5%脱脂奶粉（溶于TBST）封闭1 h。加入Fab/Au NP复合物（1:1000）稀释溶液10 mL，在室温条件下摇床孵育1 h；而后用TBST洗涤3次，每次8 min，加入HRP标记的二抗稀释溶液10 mL，于室温条件下摇床孵育1 h，重复洗涤步骤。

10）显色：将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中，避光5 min，将膜放入化学发光仪中成像，观察免疫条带。若可以观察到免疫条带，则表明该古代丝织品为桑蚕丝。

实施例3

1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末。将丝素蛋白粉末溶解在PBS（1mg/mL）中注射进SPF 级 Balb/C 纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，得到桑蚕丝素蛋白单克隆抗体（McAb）。

2）Fab片段抗体的制备：选取固定化木瓜蛋白酶酶解制备Fab片段。在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，将0.25 mL木瓜蛋白酶溶液加入0.8 mL分离柱中，将分离柱放入2 mL的离心管内，10000 rmp 离心1 min，弃去离心出来的蛋白储存液，加入0.5 mL 20mM 半胱氨酸消化液，重复离心，弃去离心出来的液体，用橡胶管密封分离柱底部，待用。同时，将1）中制备的抗体在Buffer交换柱中进行前处理，将 Buffer 交换柱放入离心管内，3000 rpm 离心2 min，弃去离心出来的存储液。加入 1mL 20 mM 半胱氨酸消化液到柱子中，3000 rpm离心2 min，弃去离心出来的液体，重复离心 3 次。吸取 0.5 m L 抗体加入到柱子中，并将柱子放入新的离心管中，3000 rpm离心 2 min，收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液，将抗体溶液加入到活化好的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子的盖子，保证酶和抗体的质量比为 0.0080 mg 酶/mg IgG，20 mM Cys 浓度的消化液（pH 为 7）、酶解时间控制在7.5 小时，放入37 ºC恒温震荡孵化箱中反应。孵育完成后，将分离柱放入2mL离心管中，10000 rpm 离心 1 min，收集离心出来的酶解液。再加入0.25 mL PBS 到柱子中，放入2 mL离心管中，10000 rpm 离心 1 min，重复清洗两次，将离心出来的液体计入到酶解液中，共得到1 mL的酶解液。采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段，收集含有Fab片段的流出物；然后将流出物在20 mMTris （pH 8.5）、25 mM NaCl中透析后，在HiTrap Q FF柱（GE Healthcare）上通过阴离子交换色谱进一步纯化，用20 mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱。通过在PBS中的Superdex 200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段。最终得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体（Fab-BM）。

3）Fab/Au NP复合物的制备：将2）中得到的Fab片段抗体进行硫醇化，即将10μL 10μM HS−(CH₂)₁₅−NHS（N-羟基琥珀酰亚胺基-16-巯基十六酸酯）溶液（溶于四氢呋喃）与100 μL Fab片段溶液混合，在室温下搅拌45min后，取80 μL加入到Au NP 溶液中，于37℃恒温震荡孵化箱中反应45 min。13000 rpm 离心15 min后，重新分散在TBST中，得到Fab-BM-Au NP复合物。

4）称取一定质量的古代丝织品残片，以1:100的浴比在 0.5% Na₂CO₃溶液中煮沸30min，重复两次完成脱胶。样品用去离子水小心清洗5次，放入37℃烘箱，低温烘干。

5）称取0.3g 4）中处理过的丝织品残片，以1:50的浴比浸入CaCl₂: H₂O: C₂H₅OH（=1:8:2，摩尔比）溶液中，在98℃ 下加热1.5 h。然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于4℃条件下透析48 h，除去溶剂小分子；将透析后的蛋白溶液进行过滤处理，除去未溶解的杂质分子，可得到纯净的丝素蛋白溶液。经冷冻干燥后，可得到丝素蛋白粉末，待用。

6）取10mg丝素蛋白粉末，溶于Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液（CB 9.6）中，得到10mg/mL的蛋白溶液。将该蛋白溶液与还原性5X loading（上样缓冲液）以4:1的体积混合，在100℃加热5min，进行蛋白变性处理，冷却至室温后，于8000rpm 离心5 min，取上清液作为电泳样品。

7）电泳：采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶，根据蛋白分子量选取10%的凝胶浓度，先将分离胶的A、B液等体积混合，加入10%过硫酸铵（引发剂）和TEMED（四甲基乙二胺），混合均匀后倒入制胶架内，用异丙醇将液面压平，于37℃干燥20 min；而后将浓缩胶的A、B液等体积混合，加入10%过硫酸铵（引发剂）和TEMED（四甲基乙二胺），混合均匀后倒入制胶架内，插入梳子，于37℃下干燥15 min。将蛋白样品和蛋白质Marker加入制加样孔中，在恒压条件下进行电泳：80 V跑浓缩胶，10 min后120 V跑分离胶，直至样品跑至凝胶底部，停止电泳。将凝胶取出后，放入化学发光仪中观察凝胶图像。

8）转印：裁剪一张略大于凝胶的PVDF膜，一角做标记，用甲醇浸泡1 min进行活化处理后，将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡30 min，而后按照“海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵”的顺序，搭建转印“三明治”，并将其放入转移装置中，倒入转印缓冲液后，在冰浴条件下300 mA恒流转印1.5 h。转印完成后，将膜取出，放入化学发光仪中观察转印情况。

9）免疫：将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中，加入5%脱脂奶粉（溶于TBST）封闭1 h。加入Fab/Au NP复合物（1:1000）稀释溶液10 mL，在室温条件下摇床孵育1 h；而后用TBST洗涤3次，每次5 min，加入HRP标记的二抗稀释溶液10 mL，于室温条件下摇床孵育1 h，重复洗涤步骤。

10）显色：将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中，避光5 min，将膜放入化学发光仪中成像，观察免疫条带。若可以观察到免疫条带，则表明该古代丝织品为桑蚕丝。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，得到桑蚕丝丝素蛋白粉末；将桑蚕丝丝素蛋白粉末溶解在PBS中注射进SPF级Balb/C纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白单克隆抗体；

2）Fab片段抗体的制备：先在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，同时将步骤1）中所得抗体在buffer交换柱中进行前处理，得到抗体溶液；将抗体溶液加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子盖子，置于35-39℃恒温震荡孵化箱中酶解反应，采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体；

3）Fab-BM-Au NP复合物的制备：将步骤2）所得桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体进行硫醇化处理后，分别取50-80 μL加入到Au NP溶液中，于35-39℃恒温震荡孵化箱中反应40-50min，11000-14000rpm 离心10-20min后，重新分散在PBST中，得到Fab-BM-Au NP复合物；

4）称取古代丝织品残片作为样品，以1:90-110的浴比在0.4-0.6wt%的Na₂CO₃溶液中煮沸20-40min，重复两次完成脱胶，样品用去离子水小心清洗3-5次，放入35-39℃烘箱低温烘干；

5）称取步骤4）中处理过的古代丝织品残片，浸入钙醇溶液中加热溶解，经透析、过滤和冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末，待用；

6）取步骤5）所得丝素蛋白粉末，溶于Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中，得到8-12mg/mL的蛋白溶液，将蛋白溶液与还原性上样缓冲液5X loading以3.5-4.5:1的体积比混合，在96-100℃加热8-12min，进行蛋白变性处理，冷却至室温后，于6000-10000rpm 离心3-7min，取上清液作为电泳样品；

7）电泳：将电泳样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中，免染胶上层为浓缩胶，下层为分离胶；在恒压条件下进行电泳：80 V跑浓缩胶，8-12min后120 V跑分离胶，直至样品跑至凝胶底部，停止电泳，将凝胶取出后，放入化学发光仪中观察凝胶图像；

8）转印：裁剪一张尺寸大于凝胶的PVDF膜，一角做标记，用甲醇浸泡0.5-1.5 min进行活化处理后，将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡20-40 min，而后按照“海绵片—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵片”的顺序，搭建转印“三明治”，并将其放入转移装置中，倒入转印缓冲液后，在冰浴条件下200 -300 mA恒流转印1.5-2 h，转印完成后，将膜取出，放入化学发光仪中观察转印情况；

9）免疫：将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中，加入4-6%的脱脂奶粉TBST溶液封闭0.5-1.5 h，加入Fab-BM-Au NP复合物稀释溶液，在室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h；而后用TBST洗涤3次，每次5-10 min，加入HRP标记的二抗稀释溶液，于室温条件下摇床孵育0.5-1.5 h，重复洗涤步骤；

10）显色：将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中，避光4-6 min，将PVDF膜放入化学发光仪中成像，观察免疫条带，若可观察到免疫条带，则表明古代丝织品残片为桑蚕丝。

2.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤5）中，丝素蛋白粉末的制备方法具体如下：将古代丝织品残片以1:45-55的浴比浸入摩尔比为CaCl₂:H₂O: C₂H₅OH的钙醇溶液中，在96-98℃ 下加热1-2 h，然后用截留分子量2000的透析袋将得到的蛋白溶液于1-5℃条件下透析40-60 h，除去溶剂小分子；将透析后的蛋白溶液进行过滤处理，除去未溶解的杂质分子，得到纯净的丝素蛋白溶液，经冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末，待用。

3.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤6）中，还原性上样缓冲液5X loading的配方为：2.5 mL 0.5mol/L Tris ▪HCl, 0.39g二硫苏糖醇，0.5g SDS，0.025g溴酚蓝，2.5 mL甘油。

4.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤7）中，所述免染胶的制备方法具体方法如下：采用TGX快速免染制胶试剂盒，根据蛋白分子量选取8-12%的凝胶浓度，先将分离胶的A、B液等体积混合，加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺，混合均匀后倒入制胶架内，用异丙醇将液面压平，于35-39℃干燥15-20 min；而后将浓缩胶的A、B液等体积混合，加入8-12%过硫酸铵和四甲基乙二胺，混合均匀后倒入制胶架内，插入梳子，于35-39℃下干燥10-15 min。

5.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤2）中，固定化木瓜蛋白酶活化的方法具体为：将0.2-0.3mL木瓜蛋白酶溶液加入0.7-0.9 mL分离柱中，将分离柱放入离心管内，8000-12000 rmp离心0.5-1.5 min，弃去离心出来的蛋白储存液，加入0.4-0.6 mL 18-22mM半胱氨酸消化液，重复离心，弃去离心出来的液体，用橡胶管密封分离柱底部，待用。

6.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤2）中，抗体的前处理的方法具体如下：将Buffer交换柱放入离心管内，2000-4000rpm 离心1-3 min，弃去离心出来的存储液，加入 0.8-1.2mL 18-22 mM半胱氨酸消化液，2000-4000rpm离心1-3min，弃去离心出来的液体，重复离心2-4次；吸取 0.4-0.6m L抗体加入到柱子中，并将柱子放入新的离心管中，2000-4000rpm离心1-3min，收集离心出来含半胱氨酸的抗体溶液，待用。

7.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤2）中，酶解制备Fab片段抗体的具体条件如下：酶和抗体的质量比为 0.0080-0.0090 mg酶/mg IgG，采用20 mM Cys浓度的消化液，酶解时间7.5-8.5h；孵育完成后，将分离柱放入离心管中，8000-12000 rpm 离心1-3 min，收集离心出来的酶解液，再加入0.25 mL PBS 到柱子中，放入离心管中，8000-12000rpm离心1-3min，重复清洗两次，将离心出来的液体计入到酶解液中，共得到1 mL的酶解液。

8.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤2）中，Fab片段抗体的分离纯化方法具体如下：用Protein A Plus柱除去抗体Fc片段，收集含有Fab片段的流出物；然后将流出物在20mM Tris、25mM NaCl中透析后，在HiTrap Q FF柱上通过阴离子交换色谱进一步纯化，用20mM Tris、1000mM NaCl梯度洗脱，通过在PBS中的Superdex200柱上的尺寸排阻色谱法进一步纯化Fab片段抗体。

9.如权利要求1所述的古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤3）中，Fab片段抗体硫醇化的方法具体如下：按体积比1:8-12将10μM HS−(CH₂)₁₀−N-羟基琥珀酰亚胺基-11-巯基十一酸酯的四氢呋喃溶液与抗体 Fab片段溶液混合，在室温下搅拌40-50min。

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