CN104761638B - 一种蛋白亲和纯化IgY的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其包括以下步骤：1蛋白M的基因克隆；2构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M；3将纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF进行偶联，制作亲和纯化介质；4将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；5将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4℃过夜透析，PBS溶液的pH为7.0～7.4；6收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体。本发明具有以下有益效果：1、工序简单；2、IgY纯化效率高达95％；3、更加环保、绿色、健康。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蛋白亲和纯化IgY的方法。
背景技术
卵黄抗体(egg yolk antibody，IgY)是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50～100mg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。
与哺乳动物免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fc片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点(PI)在5.7-7.6之间，在pH4.0～11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4℃储存6～7年活性下降仅5％(Jaradat Z W,Marquardt R R.2000.Studies on the stability of chickenIgY in different sugars,complex carbohydrates and food materials.Food andAgricultural Immunology,12(4):263-272)；IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强(Shimizu M,Nagashima H,Sano K,etal.1992.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G.BiosciBiotechnol Biochem,56(2):270-274)。
由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，卵黄抗体应用于检测也具有多方面的优势如：卵黄抗体与内风湿因子、人类抗鼠抗体(HAMA)没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。
精制卵黄抗体必须解决卵黄抗体的提取和纯化两大技术问题。卵黄抗体为存在于卵黄抗体中的水溶性蛋白质，其总量仅为卵黄抗体固形物的10％，其余大部分是颗粒状的卵黄抗体高磷蛋白、脂蛋白、可溶性的低密度脂蛋白和少量色素，这些物质存在于卵黄抗体液中，使之甚为粘稠，容易变质，并可干扰HI等试验的进行，未经处理的卵黄抗体液注射到动物体内吸收较慢，且在注射部位易形成干酪样物质、肿大或坏死等，影响抗体的作用和肉的品质。如果不能彻底解决这一矛盾，那么蛋黄抗体的安全性得不到保障，不能应用于大规模生产。二是解决如何从蛋黄中获取高纯度的IgY的纯化技术问题。粗制高免卵黄液主要用于动物饲喂，针对肠道微生物进行预防治疗。由于粗制高免卵黄液中含有大量脂类及杂蛋白，存在注射困难、吸收不良、过敏反应、保存期短和运输不便等缺点。因此选择适当的方法纯化获得大量高纯度的IgY显得很重要。
由于IgY提取工艺的不成熟，没有特别的办法大量提取出高纯度的IgY。多数停留在用生理盐水稀释蛋黄这种十分原始的方法。传统用作IgY纯化方法有硫酸铵沉淀法，聚乙二醇沉淀法，水稀释法，超过滤法，凝胶过滤法，亲硫凝胶色谱法，和离子交换层析法，这些方法步骤复杂，耗时较长。在蛋黄中，丰富的脂蛋白通常通过氯仿变性和离心除去，IgY抗体回收率非常低。按照美国专利(5367054)操作方法使用水提、超滤、离子交换和硫酸铵沉淀的方法进行纯化IgY抗体，IgY的得率仅为31.6％。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种蛋白亲和纯化IgY的方法。
技术方案：一种蛋白亲和纯化IgY的方法，包括以下步骤：
(1)、蛋白M的基因克隆；
(2)、构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M；
(3)、将步骤(2)纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF按照质量比1：(1～3)进行偶联，制作亲和纯化介质；
(4)、将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；
(5)、将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4℃过夜透析，PBS溶液的pH为7.0～7.4；
(6)、收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体。
作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案：步骤(1)中蛋白M的基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95℃ 5分钟,95℃ 30秒,58℃ 15秒,72℃ 1分钟,72℃ 10分钟，30个循环。
作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案：步骤(2)中蛋白M的可溶性表达的条件为：诱导剂是0.1～0.8mM IPTG，28～37℃，220rpm，诱导时间4～7h。
作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案：步骤(2)中可溶性蛋白M的纯化方法包括以下步骤：
(21)、用3～5个柱床体积的蒸馏水洗去蛋白纯化预装柱柱内的乙醇；
(22)、用至少5个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，结合缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、20mM咪唑和0.02wt％NaN3，结合缓冲液的pH为7.4；
(23)、用注射器或蠕动泵将用滤膜过滤后的蛋白液上到柱上，蛋白液为表达蛋白M的大肠杆菌超声破碎后的上清液；
(24)、用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱柱中上清液中的杂蛋白，洗涤缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、50mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗涤缓冲液的pH为7.4；
(25)、用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱中蛋白M中目的蛋白，洗脱缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、300mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗脱缓冲液的pH为7.4；
(26)、将洗脱下来的目的蛋白在蒸馏水中4℃透析过夜，再进行真空冷冻干燥，最后溶解于0.2M NaHCO3和0.5M NaCl混合溶液中,混合溶液的pH为7.5～8.5。
进一步地，步骤(23)中滤膜的孔径为0.22mm。
作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案：步骤(3)包括以下步骤：
(31)、将4ml NHS活化胶用4℃预冷的1mM HCl洗3～5次后抽干，再用0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的混合溶液清洗2次,混合溶液的pH为7.5～8.5，抽干后将4ml NHS活化胶加入到10ml的离心管中；
(32)、将40mg蛋白M溶液加入到步骤(31)装有4ml NHS活化胶的离心管中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合,离心管水平放置，转速120rpm，反应5h过滤，收集沉淀；
(33)、封闭离心管中未反应的NHS：将步骤(32)收集的沉淀加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml封闭液，封闭液为0.5mol/L乙醇胺和0.5M NaCl的混合液，混合液的pH为7.5～8.5，反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h，将磨口三角瓶中物质转移到砂芯漏斗中，抽滤2min，用去离子水清洗砂芯漏斗中的固体产物；
(34)、清洗，将步骤(33)制得的固体产物依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为8.0硼酸-四硼酸钠缓冲液和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基得到蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF；
(35)、保存，制得的蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF保存于4℃、20％乙醇溶液中。
作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案：步骤(4)包括以下步骤：
(41)、将鸡蛋的卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用pH为7.4的PBS按照体积比卵黄：PBS＝1：2进行稀释，4℃搅拌过夜，再通过0.22微米滤膜过滤得到过滤后的卵黄液；
(42)、蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用PBS冲洗5～10个柱体积平衡柱；
(43)、将步骤(41)过滤后的卵黄液上柱；
(44)、用PBS再洗5～10个柱体积，直至基线趋于平缓；
(45)、用洗脱缓冲液将IgY从填料上洗脱下来,立即用中和缓冲液中和洗脱液至pH为7,洗脱缓冲液为PH为2.5～4的0.1M甘氨酸缓冲液，所述填料为琼脂糖，所述中和缓冲液为0.1M三羟甲基氨基甲烷,三羟甲基氨基甲烷的PH为9。
有益效果：本发明公开了一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其具有以下有益效果：
1、工序简单；
2、IgY纯化效率高达95％；
3、更加环保、绿色、健康。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
具体实施例1
一种蛋白亲和纯化IgY的方法，包括以下步骤：
(1)、蛋白M的基因克隆；
(2)、构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M；
(3)、将步骤(2)纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF按照质量比1：1进行偶联，制作亲和纯化介质；
(4)、将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；
(5)、将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4℃过夜透析，PBS溶液的pH为7.0；
(6)、收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体。
本实施例中，步骤(1)中蛋白M的基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95℃ 5分钟,95℃ 30秒,58℃ 15秒,72℃ 1分钟,72℃ 10分钟，30个循环。
本实施例中，步骤(2)中蛋白M的可溶性表达的条件为：诱导剂是0.1mM IPTG，28℃，220rpm，诱导时间4h。
本实施例中，步骤(2)中可溶性蛋白M的纯化方法包括以下步骤：
(21)、用3个柱床体积的蒸馏水洗去蛋白纯化预装柱柱内的乙醇；
(22)、用5个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，结合缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、20mM咪唑和0.02wt％ NaN3，结合缓冲液的pH为7.4；
(23)、用注射器将用滤膜过滤后的蛋白液上到柱上，蛋白液为表达蛋白M的大肠杆菌超声破碎后的上清液；
(24)、用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱柱中上清液中的杂蛋白，洗涤缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、50mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗涤缓冲液的pH为7.4；
(25)、用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱中蛋白M中目的蛋白，洗脱缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、300mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗脱缓冲液的pH为7.4；
(26)、将洗脱下来的目的蛋白在蒸馏水中4℃透析过夜，再进行真空冷冻干燥，最后溶解于0.2M NaHCO3和0.5M NaCl混合溶液中,混合溶液的pH为7.5。
进一步地，步骤(23)中滤膜的孔径为0.22mm。
本实施例中，步骤(3)包括以下步骤：
(31)、将4ml NHS活化胶用4℃预冷的1mM HCl洗3次后抽干，再用0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的混合溶液清洗2次,混合溶液的pH为7.5，抽干后将4ml NHS活化胶加入到10ml的离心管中；
(32)、将40mg蛋白M溶液加入到步骤(31)装有4ml NHS活化胶的离心管中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合,离心管水平放置，转速120rpm，反应5h过滤，收集沉淀；
(33)、封闭离心管中未反应的NHS：将步骤(32)收集的沉淀加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml封闭液，封闭液为0.5mol/L乙醇胺和0.5M NaCl的混合液，混合液的pH为7.5，反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h，将磨口三角瓶中物质转移到砂芯漏斗中，抽滤2min，用去离子水清洗砂芯漏斗中的固体产物；
(34)、清洗，将步骤(33)制得的固体产物依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为8.0硼酸-四硼酸钠缓冲液和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基得到蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF；
(35)、保存，制得的蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF保存于4℃、20％乙醇溶液中。
本实施例中，步骤(4)包括以下步骤：
(41)、将鸡蛋的卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用pH为7.4的PBS按照体积比卵黄：PBS＝1：2进行稀释，4℃搅拌过夜，再通过0.22微米滤膜过滤得到过滤后的卵黄液；
(42)、蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用PBS冲洗5个柱体积平衡柱；
(43)、将步骤(41)过滤后的卵黄液上柱；
(44)、用PBS再洗5个柱体积，直至基线趋于平缓；
(45)、用洗脱缓冲液将IgY从填料上洗脱下来,立即用中和缓冲液中和洗脱液至pH为7,洗脱缓冲液为PH为2.5的0.1M甘氨酸缓冲液，填料为琼脂糖，中和缓冲液为0.1M三羟甲基氨基甲烷,三羟甲基氨基甲烷的PH为9。
具体实施例2
一种蛋白亲和纯化IgY的方法，包括以下步骤：
(1)、蛋白M的基因克隆；
(2)、构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M；
(3)、将步骤(2)纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF按照质量比1：3进行偶联，制作亲和纯化介质；
(4)、将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；
(5)、将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4℃过夜透析，PBS溶液的pH为7.4；
(6)、收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体。
本实施例中，步骤(1)中蛋白M的基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95℃ 5分钟,95℃ 30秒,58℃ 15秒,72℃ 1分钟,72℃ 10分钟，30个循环。
本实施例中，步骤(2)中蛋白M的可溶性表达的条件为：诱导剂是0.8mM IPTG，37℃，220rpm，诱导时间7h。
本实施例中，步骤(2)中可溶性蛋白M的纯化方法包括以下步骤：
(21)、用5个柱床体积的蒸馏水洗去蛋白纯化预装柱柱内的乙醇；
(22)、用6个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，结合缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、20mM咪唑和0.02wt％ NaN3，结合缓冲液的pH为7.4；
(23)、用蠕动泵将用滤膜过滤后的蛋白液上到柱上，蛋白液为表达蛋白M的大肠杆菌超声破碎后的上清液；
(24)、用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱柱中上清液中的杂蛋白，洗涤缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、50mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗涤缓冲液的pH为7.4；
(25)、用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱中蛋白M中目的蛋白，洗脱缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、300mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗脱缓冲液的pH为7.4；
(26)、将洗脱下来的目的蛋白在蒸馏水中4℃透析过夜，再进行真空冷冻干燥，最后溶解于0.2M NaHCO3和0.5M NaCl混合溶液中,混合溶液的pH为8.5。
进一步地，步骤(23)中滤膜的孔径为0.22mm。
本实施例中，步骤(3)包括以下步骤：
(31)、将4ml NHS活化胶用4℃预冷的1mM HCl洗5次后抽干，再用0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的混合溶液清洗2次,混合溶液的pH为8.5，抽干后将4ml NHS活化胶加入到10ml的离心管中；
(32)、将40mg蛋白M溶液加入到步骤(31)装有4ml NHS活化胶的离心管中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合,离心管水平放置，转速120rpm，反应5h过滤，收集沉淀；
(33)、封闭离心管中未反应的NHS：将步骤(32)收集的沉淀加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml封闭液，封闭液为0.5mol/L乙醇胺和0.5M NaCl的混合液，混合液的pH为7.5～8.5，反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h，将磨口三角瓶中物质转移到砂芯漏斗中，抽滤2min，用去离子水清洗砂芯漏斗中的固体产物；
(34)、清洗，将步骤(33)制得的固体产物依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为8.0硼酸-四硼酸钠缓冲液和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基得到蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF；
(35)、保存，制得的蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF保存于4℃、20％乙醇溶液中。
本实施例中，步骤(4)包括以下步骤：
(41)、将鸡蛋的卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用pH为7.4的PBS按照体积比卵黄：PBS＝1：2进行稀释，4℃搅拌过夜，再通过0.22微米滤膜过滤得到过滤后的卵黄液；
(42)、蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用PBS冲洗10个柱体积平衡柱；
(43)、将步骤(41)过滤后的卵黄液上柱；
(44)、用PBS再洗10个柱体积，直至基线趋于平缓；
(45)、用洗脱缓冲液将IgY从填料上洗脱下来,立即用中和缓冲液中和洗脱液至pH为7,洗脱缓冲液为PH为4的0.1M甘氨酸缓冲液，填料为琼脂糖，中和缓冲液为0.1M三羟甲基氨基甲烷,三羟甲基氨基甲烷的PH为9。
具体实施例3
一种蛋白亲和纯化IgY的方法，包括以下步骤：
(1)、蛋白M的基因克隆；
(2)、构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M；
(3)、将步骤(2)纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF按照质量比1：2进行偶联，制作亲和纯化介质；
(4)、将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；
(5)、将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4℃过夜透析，PBS溶液的pH为7.2；
(6)、收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体。
本实施例中，步骤(1)中蛋白M的基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95℃ 5分钟,95℃ 30秒,58℃ 15秒,72℃ 1分钟,72℃ 10分钟，30个循环。
本实施例中，步骤(2)中蛋白M的可溶性表达的条件为：诱导剂是0.5mM IPTG，35℃，220rpm，诱导时间5h。
本实施例中，步骤(2)中可溶性蛋白M的纯化方法包括以下步骤：
(21)、用4个柱床体积的蒸馏水洗去蛋白纯化预装柱柱内的乙醇；
(22)、用7个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，结合缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、20mM咪唑和0.02wt％ NaN3，结合缓冲液的pH为7.4；
(23)、用注射器将用滤膜过滤后的蛋白液上到柱上，蛋白液为表达蛋白M的大肠杆菌超声破碎后的上清液；
(24)、用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱柱中上清液中的杂蛋白，洗涤缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、50mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗涤缓冲液的pH为7.4；
(25)、用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱中蛋白M中目的蛋白，洗脱缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、300mM咪唑和0.02wt％ NaN3，其中洗脱缓冲液的pH为7.4；
(26)、将洗脱下来的目的蛋白在蒸馏水中4℃透析过夜，再进行真空冷冻干燥，最后溶解于0.2M NaHCO3和0.5M NaCl混合溶液中,混合溶液的pH为8。
进一步地，步骤(23)中滤膜的孔径为0.22mm。
本实施例中，步骤(3)包括以下步骤：
(31)、将4ml NHS活化胶用4℃预冷的1mM HCl洗4次后抽干，再用0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的混合溶液清洗2次,混合溶液的pH为8，抽干后将4ml NHS活化胶加入到10ml的离心管中；
(32)、将40mg蛋白M溶液加入到步骤(31)装有4ml NHS活化胶的离心管中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合,离心管水平放置，转速120rpm，反应5h过滤，收集沉淀；
(33)、封闭离心管中未反应的NHS：将步骤(32)收集的沉淀加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml封闭液，封闭液为0.5mol/L乙醇胺和0.5M NaCl的混合液，混合液的pH为8，反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h，将磨口三角瓶中物质转移到砂芯漏斗中，抽滤2min，用去离子水清洗砂芯漏斗中的固体产物；
(34)、清洗，将步骤(33)制得的固体产物依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为8.0硼酸-四硼酸钠缓冲液和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基得到蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF；
(35)、保存，制得的蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF保存于4℃、20％乙醇溶液中。
本实施例中，步骤(4)包括以下步骤：
(41)、将鸡蛋的卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用pH为7.4的PBS按照体积比卵黄：PBS＝1：2进行稀释，4℃搅拌过夜，再通过0.22微米滤膜过滤得到过滤后的卵黄液；
(42)、蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用PBS冲洗8个柱体积平衡柱；
(43)、将步骤(41)过滤后的卵黄液上柱；
(44)、用PBS再洗8个柱体积，直至基线趋于平缓；
(45)、用洗脱缓冲液将IgY从填料上洗脱下来,立即用中和缓冲液中和洗脱液至pH为7,洗脱缓冲液为PH为2.5～4的0.1M甘氨酸缓冲液，填料为琼脂糖，中和缓冲液为0.1M三羟甲基氨基甲烷,三羟甲基氨基甲烷的PH为9。
具体实施例4
一种蛋白亲和纯化IgY的方法，包括以下步骤：
(1)蛋白M的基因克隆；
(2)构建表达载体，大量表达、纯化可溶性蛋白M；
(3)将蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF进行偶联，制作亲和纯化介质；
(4)将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY；
(5)将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS(pH7.0～7.4)溶液中4℃过夜透析。
(6)收集透析袋内液体，即为高纯度的IgY抗体。
需要说明的是，蛋白M基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95℃ 5min,95℃ 30’,58℃ 15’,72℃1min,72℃ 10min，30个循环。
需要说明的是，蛋白M的可溶性表达的可溶性条件如下：诱导剂是0.1～0.8mMIPTG，28～37℃，220rpm诱导时间4～7h；
需要进一步说明的是，蛋白M的纯化方法如下：
(1)用3～5个柱床体积的蒸馏水洗去His Trap FF crude Columns(GE公司)柱内的乙醇。
(2)用至少5个柱床体积的结合缓冲液平衡柱。
(3)用注射器将用0.2mm滤膜过滤后的蛋白液注入到层析柱。
(4)用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱杂蛋白。
(5)用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。
(6)4℃，蒸馏水透析过夜，冻干，溶解于0.2M NaHCO3加0.5M NaCl,pH 7.5～8.5。
需要进一步说明的是，蛋白M与琼脂糖凝胶4FF的偶联方法如下：
(1)将约4ml NHS活化胶用4度预冷的1mM HCl洗3-5次后抽干，再用0.2M NaHCO3加0.5M NaCl,pH 7.5～8.5清洗2次，抽干后将4ml NHS活化胶加入到10ml的离心管中。
(2)将40mg蛋白M溶液加入到4ml NHS活化胶中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合,离心管水平放置，转速120rpm，反应5h。
(3)封闭未反应的NHS：将4ml抽干的蛋白M亲和胶加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml 0.5mol/L乙醇胺加0.5M NaCl，pH 7.5～8.5溶液。反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h。反应停止后将料液转移到砂芯漏斗中抽干，用去离子水清洗。
(4)清洗。将制得的蛋白M琼脂糖凝胶依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液(pH8.0)和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基。
(5)保存。制得的蛋白M亲和介质保存于4℃、20％乙醇溶液中。
需要进一步说明的是，蛋白M琼脂糖凝胶纯化IgY的方法如下：
(1)将鸡蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS(pH 7.4)按照体积比1：2进行稀释，4℃搅拌过夜，0.22微米滤膜过滤；
(3)蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用洗脱缓冲液冲洗3～5个柱体积洗掉乙醇和杂质，用PBS冲洗5～10个柱体积平衡柱；
(4)将过滤后的卵黄液上柱；
(5)用PBS再洗5～10个柱体积，直至基线趋于平缓；
(6)用洗脱缓冲液将IgY从填料上洗脱下来,立即用中和缓冲液中和洗脱液至pH为中性，防止洗脱缓冲液的酸性环境引起抗体失活。
需要说明的是，Western Blot验证蛋白M和IgY的相互结合作用的方法如下：
(1)SDS-PAGE。
(2)转膜
浸泡膜：PVDF膜在甲醇中浸泡20min以上后转入转移液中。滤纸、海绵浸入转膜液中。
取胶：将胶卸下，左上切角，在转移液中浸泡，量好胶的大小，剪好PVDF膜。按照海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序放置好，用玻棒逐出气泡。
(3)转膜：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将转膜装置放入电泳槽内。将电泳槽置于冰水混合物中，恒流200mA，40min。
(4)封闭
将膜从电转槽中取出，TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡2小时。
(5)孵育一抗
使用WB专用孵育盒，使用一块平整的塑料膜，剪成书页状，将PVDF膜在TBST中稍稍漂洗，正面向上放置在封口膜上，均匀滴加HRP标记的IgY，盖上塑料膜，驱赶气泡，防止气泡的产生，4°过夜。
(6)洗涤：一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
(7)HRP-ECL发光。
需要说明的是，Pull Down验证蛋白M和IgY的相互结合作用的方法如下：
(1)将透析后的3ml蛋白M注入5ml镍柱，然后用平衡液洗脱没有结合的蛋白，用5－10个柱床体积的平衡缓冲液洗柱。
(2)将透析后的2ml IgY注入镍柱，用保鲜膜封住两段的开口，孵育3～6h。
(3)用平衡液洗柱，根据吸光度变化收集样品，直至吸光度没有变化。
(4)用300mM咪唑的洗脱液洗脱，直至吸光度没有变化。
(5)进行SDS-PAGE。
需要更进一步说明的是，纯化蛋白M结合缓冲液配方为25mM Tris pH 7.4,150mMNaCl,10mM imidazole,0.02％ NaN3；洗涤缓冲液配方是25mM Tris pH 7.4,150mM NaCl,50mM咪唑,0.02％ NaN3；洗脱缓冲液配方是25mM Tris pH7.4,150mM NaCl,150～500mMimidazole,0.02％ NaN3。
需要进一步说明的是，纯化IgY洗脱缓冲液的配方是pH 2.5～4.0，0.1M甘氨酸缓冲液；中和缓冲液配方是0.1m Tris pH 9.0。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (6)
1.一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、蛋白M的基因克隆；
(2)、构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M；
(3)、将步骤(2)纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF按照质量比1：(1～3)进行偶联，制作亲和纯化介质；
(4)、将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；
(5)、将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4℃过夜透析，PBS溶液的pH为7.0～7.4；
(6)、收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体，其中：
步骤(2)中可溶性蛋白M的纯化方法包括以下步骤：
(21)、用3～5个柱床体积的蒸馏水洗去蛋白纯化预装柱柱内的乙醇；
(22)、用至少5个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，结合缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、20mM咪唑和0.02wt％NaN3，结合缓冲液的pH为7.4；
(23)、用注射器或蠕动泵将用滤膜过滤后的蛋白液上到柱上，蛋白液为表达蛋白M的大肠杆菌超声破碎后的上清液；
(24)、用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱柱中上清液中的杂蛋白，洗涤缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、50mM咪唑和0.02wt％NaN3，其中洗涤缓冲液的pH为7.4；
(25)、用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱中蛋白M中目的蛋白，洗脱缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、300mM咪唑和0.02wt％NaN3，其中洗脱缓冲液的pH为7.4；
(26)、将洗脱下来的目的蛋白在蒸馏水中4℃透析过夜，再进行真空冷冻干燥，最后溶解于0.2M NaHCO3和0.5M NaCl混合溶液中,混合溶液的pH为7.5～8.5。
2.如权利要求1所述的一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其特征在于，步骤(1)中蛋白M的基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95℃5分钟,95℃30秒,58℃15秒,72℃1分钟,72℃10分钟，30个循环。
3.如权利要求1所述的一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其特征在于，步骤(2)中蛋白M的可溶性表达的条件为：诱导剂是0.1～0.8mM IPTG，28～37℃，220rpm，诱导时间4～7h。
4.如权利要求1所述的一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其特征在于，步骤(23)中滤膜的孔径为0.22mm。
5.如权利要求1所述的一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其特征在于，步骤(3)包括以下步骤：
(31)、将4ml NHS活化胶用4℃预冷的1mM HCl洗3～5次后抽干，再用0.2M NaHCO3和0.5MNaCl的混合溶液清洗2次,混合溶液的pH为7.5～8.5，抽干后将4ml NHS活化胶加入到10ml的离心管中；
(32)、将40mg蛋白M溶液加入到步骤(31)装有4ml NHS活化胶的离心管中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合,离心管水平放置，转速120rpm，反应5h过滤，收集沉淀；
(33)、封闭离心管中未反应的NHS：将步骤(32)收集的沉淀加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml封闭液，封闭液为0.5mol/L乙醇胺和0.5M NaCl的混合液，混合液的pH为7.5～8.5，反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h，将磨口三角瓶中物质转移到砂芯漏斗中，抽滤2min，用去离子水清洗砂芯漏斗中的固体产物；
(34)、清洗，将步骤(33)制得的固体产物依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为8.0硼酸-四硼酸钠缓冲液和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基得到蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF；
(35)、保存，制得的蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF保存于4℃、20％乙醇溶液中。
6.如权利要求1所述的一种蛋白亲和纯化IgY的方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：
(41)、将鸡蛋的卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用pH为7.4的PBS按照体积比卵黄：PBS＝1：2进行稀释，4℃搅拌过夜，再通过0.22微米滤膜过滤得到过滤后的卵黄液；
(42)、蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用PBS冲洗5～10个柱体积平衡柱；
(43)、将步骤(41)过滤后的卵黄液上柱；
(44)、用PBS再洗5～10个柱体积，直至基线趋于平缓；
(45)、用洗脱缓冲液将IgY从填料上洗脱下来,立即用中和缓冲液中和洗脱液至pH为7,洗脱缓冲液为PH为2.5～4的0.1M甘氨酸缓冲液，所述填料为琼脂糖，所述中和缓冲液为0.1M三羟甲基氨基甲烷,三羟甲基氨基甲烷的PH为9。
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