CN102757493A

CN102757493A - 一种制备鸡痘病毒抗体的方法

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Publication number: CN102757493A
Application number: CN2012102403953A
Authority: CN
Inventors: 张澍; 吕宏亮; 徐明伟; 高斌战
Original assignee: BEIJING JIANXIANG HEMU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING JIANXIANG HEMU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2012-10-31

Abstract

本发明公开了一种鸡痘病毒抗体的制备方法，属于生物技术领域。本发明的一种鸡痘病毒抗体的制备方法包括：（1）鸡痘病毒的培养和粗制抗原的制备；（2）浓缩和纯化抗原的制备；（3）动物免疫及抗血清的制备；（4）抗体的纯化。采用本发明方法制备得到的抗体，其抗体纯度高，特异性好。能够广泛用于检测鸡痘病毒感染的试剂的制备。

Description

一种制备鸡痘病毒抗体的方法

技术领域

本发明涉及一种病毒抗体的制备方法，特别涉及一种鸡痘病毒抗体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

鸡痘在家禽业中是一种重要的疾病，严重危害家禽业的发展，引起鸡增生性皮肤损伤（喉管、气管）、咳嗽和死亡。尽管预防用的疫苗已经上市，有效地减少了该病的发生和流行，但病毒的控制以及检测仍需要特异性强、灵敏度高、快速的检测手段，因为鸡痘病毒抗原的多样性和复杂性，以抗血清为主的检测、诊断技术方法不能满足鸡痘诊断、疫苗检验的需要。

鸡痘抗原检测、疾病诊断有许多方法，传统的血清学方法一直沿用至今，也就是采用免疫血清进行免疫学试验，但是该方法存在检测效果差，灵敏度低等缺点。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提出了一种鸡痘病毒抗体的制备方法，使用本发明方法制备得到抗体可以实现对感染动物的快速检测，其灵敏度高。本发明方法不仅适用于鸡痘病毒，也适用于其他病毒。

本发明的一种鸡痘病毒抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）鸡痘病毒的培养和粗制抗原的制备；

（2）粗制抗原的浓缩和纯化；

（3）动物免疫及抗血清的制备：使用步骤（1）得到的粗制抗原制成初次免疫原进行初步免疫后，使用步骤（2）得到的纯化抗原制成再次免疫原对动物进行再次免疫，分离得到抗血清；

（4）抗体的纯化：抗体的纯化包括抗体的初步纯化和抗体的亲和层析纯化；

所述的初步纯化是指抗血清中加入饱和硫酸铵，用膜封口冰上放置3-5h后，4℃离心，将上清移入到干净的离心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃过夜透析；

所述的亲和层析纯化是将初步纯化后的抗体与结合缓冲液充分混合，置4℃摇床平衡过夜后，加入到Sepharose4B层析柱上进行层析分离，用3倍体积的结合缓冲液充分洗涤后，再用10ml洗脱液洗脱收集；

所述的结合缓冲液为75mM Tris，pH7.5；

所述的洗脱液为0.1M甘氨酸溶液，pH2.7;

（5）纯化后的收集液立即加入pH8.8且含有5MNaCl的3M Tris缓冲液中，调节pH至6.8~7.0。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的粗制抗原的制备包括以下步骤：鸡胚成纤维细胞长成单层后感染接种鸡痘病毒4~5天后消化细胞，4℃以1500g离心10min，收取沉淀，用等渗缓冲液洗涤后，用含0.025%巯基乙醇、0.1%Triton-X100的低渗缓冲液溶解稀释病毒，4℃以200g离心5min，去除细胞残片和DNA，即得；

其中，所述的等渗缓冲液为含有10mM NaCl，5mM EDTA的10mM Tris缓冲液，pH8.0；

其中，所述的低渗缓冲液为含有10mM KCl，5mM EDTA的10mM Tris缓冲液，pH8.0。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的抗原的浓缩是采用0.5~0.75μm膜盒式滤器或0.5~0.75μm中空纤维柱进行浓缩。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的抗原的纯化是采用密度梯度离心、Sepharose4Fast Flow或Sepharose6Fast Flow层析进行纯化。

在本发明中，优选的，步骤（3）中初次免疫原的制备采用粗制抗原10mg/ml+弗氏完全佐剂，按体积比为1:1制成，再次免疫抗原采用纯化抗原1mg/ml+弗氏不完全佐剂，按体积比为1:1乳化而成。

在本发明中，优选的，步骤（4）中所述的初步纯化是指抗血清中加入饱和硫酸铵至终浓度50%，用膜封口冰上放置4h后，4℃以10000rpm离心30min，将上清移入到干净的离心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃过夜透析，透析液体积应为抗体溶液体积的1000~1500倍。

在本发明中，优选的，步骤（4）中偶联了病毒抗原的CNBr活化的介质Sepharose4B是按照以下方法制备得到的：称取1~2g CNBr活化的介质Sepharose4B，用250~500ml的1mM HCl洗涤、膨胀介质30min后，用10倍体积蒸馏水洗涤3次，用5~10ml的结合缓冲液洗涤后转入病毒抗原进行偶联，偶联条件为1ml介质结合2mg纯化病毒，加入0.1%的SDS进行变性后4℃过夜，用结合缓冲液洗去未结合抗原，pH8.0，0.2M甘氨酸液4℃封闭18h，用pH 8.5结合缓冲液洗涤1次，用醋酸缓冲液洗涤4次，用于纯化抗体或加入1M NaCl在2~8℃备用。

本发明还提供了按照以上任一项所述的方法制备得到鸡痘病毒抗体。及所述的鸡痘病毒抗体在制备检测鸡痘病毒感染试剂中的应用。

由本发明方法制备得到的纯化抗体具有以下特点：

1）制备抗体的抗原高倍浓缩、分子筛层析纯化，纯度达98%。

2）根据免疫学原理，进行多次免疫，初免以及加强免疫的抗原纯度不一样，初免采用粗制抗原，加强免疫采用纯化抗原。

3）高免血清经饱和硫酸铵沉淀后，用鸡痘病毒偶联极化的亲和层析柱纯化，因此抗体纯度高，特异性好。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

本发明具体实施例所涉及的材料来源：

1、病毒：鸡痘病毒弱毒鹌鹑化株和强毒102株，基础种子传3代以内，来源于中国兽医药品监察所。

2、SPF鸡胚成纤维细胞、11~12日龄SPF鸡胚来源于梅里亚维通试验动物技术有限公司。

3、新西兰白兔：6月龄以上健康家兔，体重2~3千克，雄性，来源于温泉兔厂。

4、0.45μm的中空纤维柱（小量）；750Kd分子量的中空纤维柱；Sepharose 4FF；纯化IgG试剂盒；Protein G Sepharose 4FF；CNBr-Sepharose 4B；垂直电泳转印系统；层析柱；层析系统以上均购自于GE公司。

3、试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自sigma公司。

实施例1鸡痘病毒抗体的制备

1、病毒培养和粗制抗原制备

鸡胚成纤维细胞长成单层后感染接种鸡痘病毒强毒102株，4~5天后消化细胞，4℃以1500g离心10min，收取沉淀，用等渗缓冲液（10mM Tris，pH8.0，10mM NaCl，5mM EDTA）洗涤后，用含0.025%巯基乙醇、0.1%Triton-X100的低渗缓冲液（10mMTris，pH8.0，10mM KCl，5mM EDTA）溶解稀释病毒，4℃以200g离心5min，去除细胞残片和DNA。

2、病毒的浓缩

利用0.5~0.75μm膜盒式滤器或0.5~0.7μm中空纤维柱过滤除去细胞碎片。用2LPBS缓冲液冲洗滤器（300kD截留值），再以2L0.1M NaOH溶液灭菌，用生理盐水排空。配制5L渗透缓冲液（20mM Tris，pH7.8，0.2M NaCl，1mM MgCl₂）进行浓缩，使病毒滤液浓缩30~50倍，测定蛋白含量。

采用中空纤维柱与膜盒式滤器浓缩过程参数见表1。

表1 中空纤维柱与膜盒式滤器浓缩过程参数

TMP=进样压力+残留压力/2-渗透压力

3、病毒的纯化

鸡痘病毒的纯化可采用密度梯度离心或者Sepharose4Fast Flow、Sepharose6Fast Flow层析进行纯化。用TB缓冲液（10mM Tris，pH8.5，10mM NaCl，1.5mMMgCl₂，1mM EDTA）制成30%的蔗糖溶液注入到SW28转头（BecKman生产），浓缩液放到液体顶部，4℃以1500g离心60min，沉淀物溶于2ml TB溶液中，置于已形成的分步梯度液（20%、30%、35%、40%、50%）顶端，4℃以1500g离心90min，收取35%~40%、40%~50%部分，用3倍体积的TB溶液稀释，4℃以20000g离心20min，重悬于1ml的TB中，用Lorry法测定蛋白含量。

购置或预装分子筛层析柱，按操作说明配制PBS缓冲液或TB缓冲液，柱子用纯水洗涤3次，每次3倍柱子体积的柱床体积，上样量5%~7%柱床体积，保持一定流速，用TB或PBS缓冲液洗脱，收集第一峰，测定蛋白含量。

纯化的样品根据实际的动物免疫需要可进一步浓缩，与佐剂配成免疫原。

4、抗血清的制备

初次免疫原的制备采用粗制抗原10mg/ml+弗氏完全佐剂，按体积比为1∶1制成，再次免疫抗原采用纯化抗原1mg/ml+弗氏不完全佐剂按体积比为1:1乳化而成。

4~5kg新西兰白兔5~6只，静脉注射1ml的初次免疫原，在7、14、22、36、50、64、78、92天注射再次免疫原，最后一次免疫12天后，对兔子进行心脏采血，分离血清，-20℃备用。

5、抗体或抗血清测定

血清效价测定采用ELISA法，具体如下：

用100μl含1μg碳酸钠的鸡痘病毒纯化抗原包被96孔板，置4℃过夜，加入150μl/孔洗液（0.29M NaCl，0.05%Tween-20）洗涤3次，用含3%牛血清白蛋白的PBS（pH7.4）37℃封闭1h，加入不同稀释度（1∶100、1:1000、1∶10⁴、1∶10⁵）的抗血清在37℃、5%CO2温箱中孵化2h，用洗液洗涤3次，加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体，该抗体按1:5000或1∶1000溶于含1%牛血清白蛋白的PBS，在37℃作用1h，洗涤3次，加入Tetramethy benzidene（TMB）底物进行显色反应1h。1M磷酸终止反应，在450nm读取结果。

血清效价的测定也可用蛋白印记的方法，具体如下：

用微型电泳（MiniproteinⅡ；Bio-Rad）对纯化抗原进行电泳（200V电压，室温45min），在100V电压4℃条件下转移1h，转移的膜用含3%BSA的PBS（pH7.4）在37℃封闭1h，用含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次，分别加入1:5000、1:10000、1:20000、1:50000稀释的抗血清在室温结合1h，洗涤3次，加入按1:5000或1:3000稀释的碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG抗体，室温作用1h，洗涤3次，加入底物显色。

6、抗血清的初步纯化

取5ml血清，4℃以10000rpm离心30min，上清转入50ml的离心管中，一边轻轻搅拌一边加入饱和硫酸铵至终浓度50%，用膜封口冰上放置4h后，4℃以10000rpm离心30min，将上清移入到干净的50ml的管中，获得纯化的抗体，然后用12~14kD的透析袋或管4℃过夜透析，透析液（75mM Tris，pH8.3）体积应为抗体的1000~1500倍。

7、鸡痘病毒亲和层析柱的制备与纯化

称取1~2g CNBr活化的介质Sepharose4B，用250~500ml的1mM HCl洗涤、膨胀介质30min后，用10倍体积蒸馏水洗涤3次，用5~10ml的结合缓冲液洗涤后转入病毒抗原中进行偶联（0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3），偶联条件1ml介质结合2mg纯化病毒。加入0.1%的SDS进行变性后4℃过夜，用结合缓冲液（75mMTris，pH7.5）洗去未结合抗原，0.2M甘氨酸液（pH8.0）4℃封闭18h，用pH8.5的结合缓冲液洗涤1次，用醋酸缓冲液（0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH4.0）洗涤4次。这将用于纯化抗体或加入1M NaCl在2~8℃备用。

3ml或5ml透析好的抗体与3ml结合缓冲液（75mM Tris，pH7.5）充分混合，置4℃摇床平衡过夜，加入到处理后的Sepharose4B层析柱（CNBr活化）上进行层析分离，用3倍体积的结合缓冲液（75mM Tris，pH7.5）充分洗涤后，再用10ml洗脱液（0.1M甘氨酸，pH2.7）洗脱收集，收集液立即加入30μl的碱性缓冲液中（3MTris，pH8.8，5M NaCl），使pH至6.8~7.0，得到抗鸡痘病毒的纯化抗体。

实施例2中和试验、荧光抗体染色

实施例1制备得到的纯化抗体倍比稀释，和相同体积的抗原稀释液混合（200TCID₅₀/0.1ml），室温过夜，取0.1ml加入已长成的鸡胚成纤维细胞培养14天观察结果。结果发现101-10⁴倍稀释的抗体中和了病毒，细胞无任何病变，10⁵倍稀释的抗体的细胞组细胞病变明显，因此该纯化抗体的中和滴度为10⁴。

毒株感染QT-353~4天后，消化细胞，重悬于培养液中，使细胞密度达到10⁵个/ml，低速离心，加入100μl细胞液于玻片上，用3%福尔马林（PBS配成）固定30min，用含0.1M甘氨酸的PBS洗涤，加入含0.1%Trito-X100的PBS放置15min，PBS洗涤3次，室温潮湿下和未稀释的纯化抗体作用1h，PBS洗涤后，加入含1%BSA的PBS按1:50稀释的荧光标记抗兔IgG的抗体室温作用1h，洗涤，晾干，在荧光显微镜下可见在细胞质中的荧光。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种鸡痘病毒抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）鸡痘病毒的培养和粗制抗原的制备；

（2）粗制抗原的浓缩和纯化；

所述的结合缓冲液为75mM Tris，pH7.5；

所述的洗脱液为0.1M甘氨酸溶液，pH2.7;

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的粗制抗原的制备包括以下步骤：鸡胚成纤维细胞长成单层后感染接种鸡痘病毒4~5天后消化细胞，4℃以1500g离心10min，收取沉淀，用等渗缓冲液洗涤后，用含0.025%巯基乙醇、0.1%Triton-X100的低渗缓冲液溶解稀释病毒，4℃以200g离心5min，去除细胞残片和DNA，即得；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述的抗原的浓缩是采用0.5~0.75μm膜盒式滤器或0.5~0.75μm中空纤维柱进行浓缩。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述的抗原的纯化是采用密度梯度离心、Sepharose4Fast Flow或Sepharose6Fast Flow层析进行纯化。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中初次免疫原的制备采用粗制抗原10mg/ml+弗氏完全佐剂，按体积比为1:1制成，再次免疫抗原采用纯化抗原1mg/ml+弗氏不完全佐剂，按体积比为1:1乳化而成。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述的初步纯化是指抗血清中加入饱和硫酸铵至终浓度50%，用膜封口冰上放置4h后，4℃以10000rpm离心30min，将上清移入到干净的离心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃过夜透析，透析液体积应为抗体溶液体积的1000~1500倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述的Sepharose4B为偶联了病毒抗原的CNBr活化的介质，其是按照以下方法制备得到的：称取1~2gCNBr活化的介质Sepharose4B，用250~500ml的1mM HCl洗涤、膨胀介质30min后，用10倍体积蒸馏水洗涤3次，用5~10ml的结合缓冲液洗涤后转入病毒抗原进行偶联，偶联条件为1ml介质结合2mg纯化病毒，加入0.1%的SDS进行变性后4℃过夜，用结合缓冲液洗去未结合抗原，pH8.0，0.2M甘氨酸液4℃封闭18h，用pH8.5结合缓冲液洗涤1次，用醋酸缓冲液洗涤4次，用于纯化抗体或加入1M NaCl在2~8℃备用。

8.按照权利要求1-7任一项所述的方法制备得到鸡痘病毒抗体。

9.权利要求8所述的鸡痘病毒抗体在制备检测鸡痘病毒感染试剂中的应用。