CN102552898B - 离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法 - Google Patents

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离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，涉及病毒制备灭活疫苗的方法。本发明包括浓缩病毒收获液，经QsepharoseFastFlow离子交换柱层析纯化，纯化产物透析脱盐，过滤除菌灭活等得到人轮状病毒灭活疫苗；进一步进行纯度、总蛋白去除率和感染性滴度检测，并进行抗原性、免疫原性检测及基因组带型稳定性检测。本发明纯化后病毒收获液总蛋白去除率为99.69%，病毒纯化前后感染性滴度分别为4.25lgCCID50/ml和7.0lgCCID50/ml，纯化的病毒灭活后病毒基因组带型未发生变异，保持了良好的抗原性和免疫原性。

Description

离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法
技术领域
本发明属于制备病毒灭活疫苗的方法，特别是制备人轮状病毒灭活疫苗的方法。
背景技术
    轮状病毒(Rotavirus , RV )是引起婴幼儿病毒性腹泻最主要的病原体。由于没有特异性的治疗方法，疫苗预防接种就成为最经济有效的方法，但目前使用的减毒活疫苗在预防轮状病毒感染中仍存在一些问题。因此，实现医疗目的使用的注射用灭活轮状病毒疫苗有其特殊的意义。近期相关文献轮状病毒的纯化一般采用CsCl密度梯度离心或者蔗糖密度梯度离心的方法来获取高纯度的病毒颗粒，“氯化铯密度梯度离心纯化轮状病毒”（文喻玲，赵庆欢，于洋，陈元鼎.中华现代内科学杂志.2005年第3期.第195-197页）、“Immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine in mice”（Baoming Jiang, Yuhuan Wang, Jean-Francois Saluzzo, et al. Human Vaccines.2008  March/April；4（2）：143-147.）但是，前者CsCl密度梯度离心对设备要求较高、成本昂贵；后者在蔗糖介质中离心会对病毒颗粒造成损伤，易导致病毒丧失感染性，且由于蔗糖的高度黏稠和高渗透性会对细胞产生毒性，在样品进行感染性滴度分析前还需要将其除去。除上述问题外，两种方法操作繁琐、费时，其纯化不易于放大，均处于用于实验室研究规模。
发明内容
本发明采用超滤浓缩结合液相色谱的技术路线纯化人轮状病毒，旨在提供一种操作简便，易于工业化放大，且保证纯化产物的总蛋白去除率、抗原回收率、抗原性和免疫原性均具有较好的效果，适宜作为人轮状病毒灭活疫苗生产的一种纯化工艺。
本发明的目的是通过以下方式实现，包括以下步骤：
（1）病毒液的制备和浓缩：
在Vero 细胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒，细胞密度为：1.33×105个细胞/cm2×850cm2/转瓶 =1.1×108个细胞/转瓶；当病毒增殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，8000rpm离心20min 取上清液收获得到9.8L含有病毒颗粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL～700ug/mL,病毒感染性滴度为4.0lgCCID50 /mL以上；用截留分子量为100KDa的切向流超滤系统将9.8L病毒原液超滤浓缩36倍至0.27L,以备进入步骤（2）；
（2）病毒的纯化：
（a）Q Sepharose Fast Flow(简称QFF)离子交换层析纯化
取20 ml病毒浓缩液以2ml/min 的流速加入预先用10mM、pH 7.60之PBS平衡好的装有QFF填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7.60之PBS以2ml/min的流速过柱，直至在QFF离子交换层析图谱OD280nm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用1mol /L NaCl洗脱大于5倍柱体积时间，收集洗脱时OD280nm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰，收集后-80℃保存备用；
（b）纯化洗脱峰的透析脱盐
将步骤（a）的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、pH7.20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌，透析袋旋转速度为60～80次/min, 4℃透析24h，每8h更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7.0～7.40；
（3）除菌过滤和灭活：
用0.22 μm 滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56℃灭活半小时，之后置于37℃灭活72小时，双抗体夹心ELISA检测灭活后的纯化轮状病毒抗原含量和免疫原性，灭活后抗原量应不低于20480EU/ml。
所述方法进一步是检测纯化前后感染性滴度、抗原量及总蛋白去除率，包括： 
用荧光灶法测定病毒纯化前后感染性滴度和抗原量如表1：
表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果（续前）
Figure DEST_PATH_IMAGE004AA
用Lowry法检测病毒纯化前后样品蛋白含量及纯化后病毒收获液总蛋白去除率如表2：
表 2 经过Q FF 离子交换层析纯化后病毒收获液的总蛋白去除率
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
所述方法还可以包括：检测纯化过程中病毒液的SDS-PAGE和 Western-blot：SDS-PAGE结果显示，与超滤浓缩液相比，QFF纯化目的峰样品蛋白条带数明显减少，未见明显杂蛋白条带；相对应的Western-blot 结果显示，蛋白条带为轮状病毒特异性蛋白条带。
所述方法还可以包括：检测病毒在纯化过程中的基因组带型电泳，结果显示：病毒在纯化过程中，基因组带型未发生变异，带型稳定。
本发明离子交换层析方法提供了一种适宜作为轮状病毒灭活疫苗生产的病毒高纯度的纯化方法，经灭活后可制备出安全性和免疫原性较高的灭活疫苗。本发明方法经多批次验证，稳定性良好，成本低廉，可作为制备医疗目的使用的注射用轮状病毒灭活疫苗的工业化生产方法。
附图说明
图1为QFF离子交换层析纯化图谱。图中，1:QFF穿透峰；2：QFF洗脱峰1；3：QFF洗脱峰2。
图2为胶体金检测纯化各峰轮状病毒抗原性。1：阳性对照；2：阴性对照；3：QFF穿透峰；4：QFF洗脱峰1；5：QFF洗脱峰2
图3为QFF洗脱峰1电镜照片。
图4为Lowry法检测各步骤样品中蛋白含量标准曲线。
图5为SDS-PAGE结果和Western-blot结果。图中，1：人轮状病毒P[2]G3株超滤浓缩液；M1：unstained PageRuler（10KDa~200KDa）；M2: prestained PageRuler(10KDa~170KDa) ；2：QFF洗脱峰1 ；3：QFF洗脱峰2。
    图6为纯化过程中病毒基因组带型。图中，M：DNA Ladder 2000 ；1:病毒培养液 ；2：病毒超滤浓缩液 ；3：病毒Q FF洗脱峰1 ；4：病毒QFF洗脱峰1（已透析）；5：病毒QFF洗脱峰1（已灭活）。
具体实施方法
一、制备人轮状病毒灭活疫苗的方法
主要试剂及仪器
截留分子量为100KDa的超滤膜包、pellicon 切向流超滤系统及0.22um滤器均为Millipore Pellicon 公司产品；Q Sepharose Fast Flow凝胶填料、AKTA purifier 纯化仪和层析柱均为GE公司产品；豚鼠抗人轮状病毒抗血清由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室制备。
细胞及病毒株
人轮状病毒P[2]G3株（ZTR-5株）由云南省昭通市医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本中分离获得，猴肾细胞 MA104（第27 代）和Vero细胞（第 148 代）由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室保存。
实施例1：
1、病毒液的制备和浓缩
采用转瓶培养的方式，在Vero 细胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒,细胞密度如下：1.33×105个细胞/cm2×850cm2/转瓶=1.1×108个细胞/转瓶；当Vero 细胞培养液的病毒增殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，8000rpm离心20min 取上清液收获含有病毒颗粒的9.8 L病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL～700ug/mL,病毒感染性滴度为4.0lgCCID50 /mL以上；采用截留分子量为100KDa的Pellicon切向流超滤系统将9.8L病毒原液超滤浓缩36倍至0.27L, 以备进行 Q Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化。
以上Pellicon切向流超滤系统为2 盒式超滤膜包 PLCHK C 0.5 m2  NMWL，kDa: 100 滤液流速为0.2～0.25L/min。
2、病毒的Q Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化及图谱分析和抗原性检测
（a） Q Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化及图谱分析
纯化：取20 ml病毒浓缩液以2ml/min 的流速加入预先用10mM、pH 7.60之PBS平衡好的装有Q Sepharose Fast Flow填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7.60之PBS以2ml/min的流速过柱，直至在QFF离子交换层析图谱OD280nm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用1mol /L NaCl洗脱大于5倍柱体积时间，收集洗脱时OD280nm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰，收集后-80℃保存备用。
图谱分析：在QFF离子交换层析图谱中，OD280nm处共计出现3个吸收峰（见图1），使用A群轮状病毒诊断试剂盒（胶体金）检测纯化各峰轮状病毒抗原性：分别取80ul纯化各峰样品滴加至胶体金加样孔内，室温放置5~10min观察结果。C、T线均有为轮状病毒抗原阳性；C线有、T线无为轮状病毒抗原阴性。
    如图2。结果显示： QFF洗脱峰1（图1中箭头所示）为主要病毒抗原峰。
（b）纯化洗脱峰的透析脱盐
将步骤（a）的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、pH7.20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌,以溶液中透析袋旋转速度为60次/min～80次/min,透析过程中样品应无沉淀产生、无混浊现象，4℃透析24h,每8h更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7.0～7.40。
纯化的洗脱峰透析脱盐后经负染制片，在电子显微镜下观察病毒形态和数量。负染制片后，在电镜视野下，QFF洗脱峰1（见图3）样品可见完整的、大小约70nm的车轮状轮状病毒颗粒。
3、除菌过滤和灭活
用0.22μm 滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56℃灭活半小时，之后置于37℃灭活72小时，灭活后的纯化病毒采用双抗体夹心ELISA法进行轮状病毒抗原含量检测，计算抗原回收率，结果为灭活后抗原量应不低于20480EU/ml。
实施例2：
除以下检测病毒纯化前后抗原性及总蛋白去除率步骤之外，其余步骤与实施例1
一致。 
（a）检测病毒纯化前后感染性滴度、抗原量
用荧光灶法(Fluorescence focus assays, FFA)测定病毒纯化前后感染性滴度和抗原量：
取病毒10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行CCID50检测。将MA104细胞按1.5×104个/孔接种在96孔板上，于37℃，5%CO2孵箱中培养至长成致密单层，加入10倍系列稀释的病毒，稀释度从10-1～10-8，每个稀释度设10个孔，37℃吸附1h后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养16h后，采用等体积甲醛溶液4℃固定30 min，洗净甲醛，随后依次加入用5%BSA-PBS pH7.2溶液稀释的豚鼠抗轮状病毒ZTR-5纯-1株全病毒颗粒多克隆抗体（1：500 稀释）和FITC标记的兔抗豚鼠 IgG（1：2000 稀释），且每次加完抗体后在37℃，5%CO2 条件下孵育60min后洗板，荧光显微镜下观察结果，如表1。
表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果
表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果（续前）
Figure DEST_PATH_IMAGE004AAA
如表1，病毒收获液感染性滴度为4.25 lgCCID50 /ml，经超滤浓缩和层析纯化后，其感染性滴度分别为7.10 lgCCID50 /ml（透析后为7.0 lgCCID50 /ml）,透析前后抗原量无变化，最终抗原回收率为65.3%。
文献“氯化铯密度梯度离心纯化轮状病毒”（中华现代内科学杂志.2005年第3期第195-197页）纯化产物最高的感染性滴度为6.0 lgCCID50，较低于本发明的最后透析产物的7.0 lgCCID50，同时该文献未报道抗原回收率指标。
（b）检测病毒纯化前后蛋白含量测定及总蛋白去除率
采用Lowry法测定纯化前后样品蛋白含量，计算纯化后病毒收获液总蛋白去除率。Lowry法具体步骤参见2010年版《中国药典》生物制品方法附录中蛋白含量测定第二法。
如图4，Lowry法检测各步骤样品中蛋白含量标准曲线。病毒收获液在超滤浓缩之后，经过QFF离子交换层析纯化，病毒蛋白与杂蛋白分离效果明显，其总蛋白去除率达到99.69%（见表2）。
表 2 经过Q FF 离子交换层析纯化后病毒收获液的总蛋白去除率
Figure DEST_PATH_IMAGE006AA
实施例3：
除以下纯化过程中病毒液的SDS-PAGE和 Western-blot检测步骤之外，其余步骤
与实施例1或实施例2一致。该检测步骤如下： 
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）分析：浓缩胶5%，分离胶10%。将纯化的轮状病毒样品与6×上样缓冲液混合，95℃加热5min裂解，上样15μl，90V电泳。考马斯亮蓝染色检测纯化效果。
Western-blot ：纯化轮状病毒蛋白经10%SDS-PAGE电泳分离后，转印至硝酸纤维素膜。首先将膜用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2h。然后用TBST缓冲液1：500稀释的豚鼠抗轮状病毒免疫血清与蛋白结合；最后用1：2000辣根过氧化物酶标记的山羊抗豚鼠IgG结合，DAB显色，观察结果。
SDS-PAGE结果显示，与超滤浓缩液相比，QFF纯化目的峰样品蛋白条带数明显减少，未见明显杂蛋白条带（见图5A），相对应的Western-blot 结果显示，图中蛋白条带为轮状病毒特异性蛋白条带（见图5B）。
实施例4：
    除以下病毒在纯化过程中的基因组带型电泳检测步骤之外，其余步骤与实施例1或实施例2或实施例3一致。该检测步骤如下： 
采用小量病毒RNA/DNA抽提试剂盒提取病毒基因组RNA，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、银染，检测病毒的核酸带型。
如图6，PAGE结果显示：病毒在纯化过程中，基因组带型未发生变异，带型稳定。
二、免疫原性检测和评价
18～20g雌性Balb/c小鼠，购自昆明医学院实验动物中心。经ELISA检测血清轮状病毒抗体，抗体阴性且无其他病原体感染的小鼠用于实验。用于免疫的Q Sepharose Fast Flow纯化后灭活样品与Al(OH)3吸附制备为实验性疫苗，以256EU人轮状病毒（P[2]G3株）灭活抗原免疫试验动物，同时设置免疫PBS的阴性对照组，共计2组实验动物，每组六只小鼠，免疫途径为肌肉注射，免疫间隔为两周，共免疫三次，其中加强免疫为两次。每次免疫后两周从尾静脉采血，分离血清。采用间接ELISA法检测血清抗体效价。
与采用蔗糖密度梯度离心结合CsCl密度梯度离心纯化的病毒免疫小鼠的文献记载（Baoming Jiang, Yuhuan Wang, Jean-Francois Saluzzo, et al. Immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine in mice. Human Vaccines.2008  March/April； 4（2）： 143-147.）比较，该文献抗体几何平均滴度最高达80000以上，但其免疫剂量为20ug纯化产物；本发明方法免疫剂量为256EU，经换算其免疫量以重量单位计仅为0.6ug。与本申请人已提出的蔗糖密度梯度离心或者柱层析纯化产物免疫豚鼠（申请号：200710065708.5“一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法”）比较，该申请方法几何平均滴度为415.8，低于本发明方法所得的12800。
实验组小鼠经过首次免疫后，所有实验动物抗体均获得阳转，阳转率为100%，第一次加强免疫后血清特异性抗体水平明显升高，第二次加强免疫后，实验组ELISA抗体效价达到了1:12800，说明经过QFF离子交换层析纯化的病毒样品能保持良好的抗原性和免疫原性。

Claims (2)

1.离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
（1）病毒液的制备和浓缩：
在Vero 细胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒，细胞密度为：1.33×105个细胞/cm2×850cm2/转瓶 =1.1×108个细胞/转瓶；当病毒增殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，8000rpm离心20min 取上清液收获得到9.8L含有病毒颗粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL～700ug/mL,病毒感染性滴度为4.0lgCCID50 /mL以上；用截留分子量为100KDa的切向流超滤系统将9.8L病毒原液超滤浓缩36倍至0.27L,以备进入步骤（2）；
（2）病毒的纯化：
（a）Q Sepharose Fast Flow(简称QFF)离子交换层析纯化
取20 ml病毒浓缩液以2ml/min 的流速加入预先用10mM、pH 7.60之PBS平衡好的装有QFF填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7.60之PBS以2ml/min的流速过柱，直至在QFF离子交换层析图谱OD280nm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用1mol /L NaCl洗脱大于5倍柱体积时间，收集洗脱时OD280nm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰，收集后-80℃保存备用；
（b）纯化洗脱峰的透析脱盐
将步骤（a）的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、pH7.20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌，透析袋旋转速度为60～80次/min, 4℃透析24h，每8h更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7.0～7.40；
（3）除菌过滤和灭活：
用0.22 μm 滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56℃灭活半小时，之后置于37℃灭活72小时，双抗体夹心ELISA检测灭活后的纯化轮状病毒抗原含量和免疫原性，灭活后抗原量应不低于20480EU/ml；
所述方法的纯化效果是通过检测纯化前后感染性滴度、抗原量及总蛋白去除率来实现的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是用荧光灶法(Fluorescence focus assays, FFA)测定病毒纯化前后感染性滴度和抗原量：
取病毒10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行CCID50检测：
将MA104细胞按1.5×104个/孔接种在96孔板上，于37℃，5%CO2孵箱中培养至长成致密单层，加入10倍系列稀释的病毒，稀释度从10-1～10-8，每个稀释度设10个孔，37℃吸附1h后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养16h后，采用等体积甲醛溶液4℃固定30 min，洗净甲醛，随后依次加入用5%BSA-PBS pH7.2溶液稀释的豚鼠抗轮状病毒ZTR-5纯-1株全病毒颗粒多克隆抗体1：500 稀释和FITC标记的兔抗豚鼠 IgG1：2000 稀释，且每次加完抗体后在37℃，5%CO2 条件下孵育60min后洗板，荧光显微镜下观察结果。
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