CN108531462A - 一种禽腺病毒精纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种禽腺病毒精纯化的方法，包括步骤如下：1.取在细胞瓶中培养的鸡胚细胞，进行病毒接种，并加入DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒后，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，经离心后收集上清液；2.使用超滤膜包对步骤1所获得的上清液进行10‑40倍浓缩；3.通过G200分子筛层析填料对步骤2所得液体进行分子筛层析；4.使用超滤膜包对步骤3回收的病毒液进行3‑10倍浓缩；5.使用阴离子交换层柱对步骤4所得病毒液进行层析纯化；6.使用超滤膜包对步骤5回收的病毒液进行4‑10倍浓缩，得到纯化后的禽腺病毒。本发明的纯化方法可在保持病毒具有良好活性的前提下对病毒液中的杂蛋白进行高效纯化，方便病毒的后续生物学应用。

Description

一种禽腺病毒精纯化的方法
技术领域
本发明涉及一种病毒精纯化的方法，特别是涉及一种禽腺病毒精纯化的方法。
背景技术
近年来，禽腺病毒(FAdV)在我国禽群中具有流行范围越发广泛、禽群感染率逐级升高的趋势，由该类属病毒引起的疾病发病率呈逐年上升，且危害性不断增加。特别是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型引起的心包积液-肝炎综合征在全国多个省份的养鸡场均有大规模暴发，造成雏鸡的大量死亡，严重影响禽类养殖的生产效率，给我国养禽业带来巨大的经济损失。由于禽腺病毒疫情不可忽视，对禽腺病毒的防控刻不容缓。
腺病毒粒子呈二十面体对称结构，无囊膜，病毒粒子直径为70～90nm。腺病毒粒子具有252个衣壳粒，其中240个非顶角衣壳粒为六邻体，12个顶角衣壳粒为五邻体，每个五邻体有两条纤维突起。目前对禽腺病毒的防控主要采用禽腺病毒灭活疫苗等，而评价疫苗免疫效果的手段主要是监测免疫禽类体内的抗体水平。国内外研究人员已报道建立了很多用于禽腺病毒抗体检测的ELISA方法，而这些研究报道均采用腺病毒的表达蛋白作为ELISA的包被抗原，但病毒在表达的过程中经过宿主修饰后，其表达蛋白的空间结构和有效抗原位点均与病毒的实际抗原位点差异巨大，造成了其检测的抗体与疫苗实际产生的抗体具有很大差异，导致检测效果的下降。为解决该问题采用全病毒作为ELISA包被抗原较为合适。
一般用于动物的病毒性疫苗多含有源于动物组织、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸、以及细胞代谢副产物等杂质成分，这些物质与病毒的相互结合影响病毒的纯度及滴度，进而导致疫苗效果降低。鉴于此，本发明针对细胞源禽腺病毒，根据其分子大小和带电荷情况，针对性的去除绝大部分生物源性杂质成分，纯化富集禽腺病毒抗原成分，获得较纯的腺病毒。
发明内容
本发明提供了一种禽腺病毒精纯化的方法，以实现在不影响禽腺病毒活性的前提下对细胞源禽腺病毒进行纯化。
本发明提供了一种禽腺病毒精纯化的方法，包括步骤如下：
步骤1：取在细胞瓶中培养的鸡胚细胞，弃去瓶内营养液，使用无菌PBS对瓶内鸡胚细胞洗涤3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培养液进行病毒接种，在37℃的条件下吸附1h后，弃去病毒液，加入DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒3d后，取出细胞瓶，反复冻融3次，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，将培养液在4000r/min的条件下离心30min，收集上清液；按照每次所需用量进行分装，并冻存于-80℃的冰箱中；
步骤2：使用超滤膜包对步骤1所获得的上清液进行10-40倍浓缩；
步骤3：对步骤2所得液体的蛋白含量和病毒含量进行测定；
步骤4：通过G200分子筛层析填料对步骤3所得液体进行分子筛层析，并使用1-3柱体积0.1M的PBS平衡层析柱，然后将步骤3所得病毒液上样，并使用0.1M的PBS洗脱，依据280nm紫外光吸收值与时间关系图，收集病毒吸收峰的样品液，并按照步骤3的方法测定溶液中的蛋白含量与病毒含量；
步骤5：使用超滤膜包对步骤4回收的病毒液进行3-10倍浓缩，并按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤6：使用阴离子交换层柱对步骤5所得病毒液进行层析纯化，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤7：使用超滤膜包对步骤6回收的病毒液进行4-10倍浓缩，得到纯化后的禽腺病毒，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量。
进一步地，所述步骤1中鸡胚细胞为长成良好的单层CEF细胞。
进一步地，所述步骤3中蛋白含量的测定方法为：
使用超微量紫外-可见光光度计，选定A280蛋白测量法，以BSA作为内标蛋白，以0.1M的PBS作空白对照组，每个样品各测三次，记录测量所得数据。
进一步地，所述步骤3中病毒含量的测定方法为：
用灭菌的PBS溶液将收获的禽腺病毒培养液按10倍梯度稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8的四个稀释度，每个稀释度分别接种10枚9日龄SPF鸡胚，按照每枚0.1mL病毒培养液进行病毒接种，将接种后的鸡胚置于37℃温箱中进行孵化，弃掉24h内死亡的鸡胚，在孵化至72h后分别收集各稀释度病毒培养液接种鸡胚的尿囊液，利用Reed-Muench法对病毒EID50进行计算。
进一步地，所述超滤膜包为100K的膜包。
进一步地，所述步骤6中阴离子交换层析柱为Macro-prep High Q层析柱
更进一步地，所述步骤6中使用阴离子交换层析对病毒进行纯化的具体方法如下：
使用3个柱体积的0.01M PBS溶液对Macro-prep High Q阴离子交换层析柱进行平衡；取10mL步骤5所得浓缩病毒液，并加入2mL含0.5mol/LTris的样品缓冲液稀释后进行上样，使用洗脱液对病毒进行纯化，其中洗脱液由A液、B液混合得到，A液为1.5mol/LNaCl溶液，B液为0.025mol/LTris溶液，以含25％A液、75％B液的混合液作为初始洗脱液对层析柱进行冲洗，初始洗脱液体积为2个柱体积；待初始洗脱液用完后，以4个柱体积的A液对层析柱进行冲洗；对收集到液体进行紫外检测，收集病毒吸收峰的样品液，得到纯化的病毒溶液。
更进一步地，所述病毒吸收峰的紫外检测波长为280nm。
进一步地，所述步骤1中DMEM培养基为含1％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
进一步地，所述精纯化的方法还包括步骤8：取纯化后的禽腺病毒按照0.5mL/管进行分装，并置于-80℃的条件下保存。
本发明相对于现有技术，采用分子筛、阴离子交换层析的联合纯化，对禽腺病毒进行高效纯化，对病毒液中的杂蛋白除去率可高达97％以上。此外，本发明采用超滤膜包对禽腺病毒液进行浓缩纯化，提高了病毒回收率，使最终纯化后的病毒液与初始病毒液相比，回收率高达32％，最大程度的降低了病毒在纯化过程中的损失。
附图说明
图1为G200层析分离病毒情况检测图；
图2为Macro-prep High Q层析分离病毒情况检测图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
本发明实施例禽腺病毒精纯化的方法如下：
步骤1：取在细胞瓶中培养长成良好的单层CEF细胞，弃去瓶内营养液，使用无菌PBS对瓶内鸡胚细胞洗涤3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培养液进行病毒接种，在37℃的条件下吸附1h后，弃去病毒液，加入含1％胎牛血清的高糖DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒3d后，取出细胞瓶，反复冻融3次，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，将培养液在4000r/min的条件下离心30min，收集上清液；按照每次所需用量进行分装，并冻存于-80℃的冰箱中；
步骤2：取步骤1所获得的上清液1000mL，并使用孔径为100K的膜包进行20倍浓缩；
步骤3：使用超微量紫外-可见光光度计，选定A280蛋白测量法，以BSA作为内标蛋白，以0.1M的PBS作空白对照组，每个样品各测三次，记录测量所得数据；用灭菌的PBS溶液将收获的禽腺病毒培养液按10倍梯度稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8的四个稀释度，每个稀释度分别接种10枚9日龄SPF鸡胚，按照每枚0.1mL病毒培养液进行病毒接种，将接种后的鸡胚置于37℃温箱中进行孵化，弃掉24h内死亡的鸡胚，在孵化至72h后分别收集各稀释度病毒培养液接种鸡胚的尿囊液，利用Reed-Muench法对病毒EID50进行计算；
步骤4：通过液相色谱仪对步骤3所得液体进行分子筛层析，使用G200分子筛层析填料进行层析，使用2柱体的0.1M PBS平衡层析柱，然后将步骤3所得液体上样，使用0.1M的PBS洗脱，图1为液相色谱仪流出液体的280nm紫外光吸收值与时间关系图，如图1所示，在起始处位于上方的曲线为禽腺病毒粗样品在G200层析填料的分离情况，而在起始处位于下方则为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况；黑色箭头为禽腺病毒病毒峰，根据禽腺病毒病毒峰的出峰时间回收病毒液，得到含病毒的溶液150mL，并按照步骤3的方法测定溶液中的蛋白含量与病毒含量；
步骤5：使用孔径为100K的膜包对步骤4回收的病毒液进行10倍浓缩，并按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤6：取Macro-prep High Q阴离子交换层柱对步骤5所得病毒液进行层析纯化，并使用3个柱体积的0.01M PBS溶液对Macro-prep High Q阴离子交换层析柱进行平衡；取10mL步骤5所得浓缩病毒液，并加入2mL含0.5mol/LTris的样品缓冲液稀释后进行上样，使用洗脱液对病毒进行纯化，其中洗脱液由A液、B液混合得到，A液为1.5mol/LNaCl溶液，B液为0.025mol/LTris溶液，以含25％A液、75％B液的混合液作为初始洗脱液对层析柱进行冲洗，初始洗脱液体积为2个柱体积；待初始洗脱液用完后，以4个柱体积的A液对层析柱进行冲洗；对收集到液体进行紫外检测，如图2所示，在起始处位于上方的曲线为禽腺病毒粗样品在Macro-prep High Q阴离子交换层柱中的分离情况，而在起始处位于下方的曲线则为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况；箭头所指处为禽腺病毒病毒峰，根据禽腺病毒病毒峰的出峰时间收集病毒吸收峰的样品液，得到纯化的病毒溶液60mL；按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤7：使用孔径为100K的膜包对步骤6回收的病毒液进行4倍浓缩，得到纯化后的禽腺病毒，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤8：取纯化后的禽腺病毒按照0.5mL/管进行分装，并置于-80℃的条件下保存。
对每个操作步骤的病毒回收率和病毒液中杂蛋白的去除率进行计算。采用公式(病毒回收率＝每个步骤病毒回收总量/最初病毒总量×100％)对病毒回收率进行计算。其中，最初病毒总量为最初病毒含量×最初病毒液总体积；每个步骤病毒回收总量为每个步骤病毒含量×该步骤回收溶液的总体积。而病毒液中杂蛋白去除率的计算公式为病毒液中杂蛋白的去除率＝(相同病毒含量的情况下每个步骤回收病毒液中蛋白总量/相同病毒含量的情况下最初病毒液中蛋白总量)×100％。
收集到各步骤所得病毒液体的病毒含量、总蛋白含量、病毒回收率、蛋白去除率数值并列表如下：
表1不同处理步骤对病毒含量和蛋白含量的影响
注：a.每个步骤的病毒含量已换算为处理前病毒液总体积的含量；b.总蛋白含量是指相同病毒含量条件下病毒液中蛋白的总含量
如表1所示，结果表明，在采用G200分子筛进行纯化后，可以将病毒液中蛋白除去率提高到90％以上，且保持病毒的回收率高达63％。而通过Macro-prep High Q阴离子交换层析进一步纯化后，可将蛋白除去率进一步提高到96％以上，并确保病毒的回收率仍可达到44％以上。Macro-prep High Q阴离子交换层析联合超滤浓缩纯化禽腺病毒，病毒回收率为31.62％，在相同病毒含量的情况下病毒液中蛋白去除率为97.56％。
综上所述，本发明实施例采用分子筛、阴离子交换层析的联合纯化，对禽腺病毒进行高效纯化，使病毒液中的杂蛋白除去率可高达97％以上。此外，本发明实施例采用100K超滤膜包对禽腺病毒液进行浓缩纯化，提高了病毒回收率，使最终纯化后的病毒液与初始病毒液相比，回收率高达32％，最大程度的降低了病毒在纯化过程中的损失。同时，本发明实施例在对病毒进行有效纯化的同时，仍能保持病毒具有的良好活性，提高了本发明纯化方法的应用价值。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述精纯化方法的步骤如下：
步骤1：取在细胞瓶中培养的鸡胚细胞，弃去瓶内营养液，使用无菌PBS对瓶内鸡胚细胞洗涤3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培养液进行病毒接种，在37℃的条件下吸附1h后，弃去病毒液，加入DMEM培养基，将细胞瓶置于37℃转瓶培养箱中继续培养，接毒3d后，取出细胞瓶，反复冻融3次，收获瓶内所有的病毒细胞培养液，将培养液在4000r/min的条件下离心30min，收集上清液；按照每次所需用量进行分装，并冻存于-80℃的冰箱中；
步骤2：使用超滤膜包对步骤1所获得的上清液进行10-40倍浓缩；
步骤3：对步骤2所得液体的蛋白含量和病毒含量进行测定；
步骤4：通过G200分子筛层析填料对步骤3所得液体进行分子筛层析，并使用1-3柱体积0.1M的PBS平衡层析柱，然后将步骤3所得病毒液上样，并使用0.1M的PBS洗脱，依据280nm紫外光吸收值与时间关系图，收集病毒吸收峰的样品液，并按照步骤3的方法测定溶液中的蛋白含量与病毒含量；
步骤5：使用超滤膜包对步骤4回收的病毒液进行3-10倍浓缩，并按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤6：使用阴离子交换层柱对步骤5所得病毒液进行层析纯化，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量；
步骤7：使用超滤膜包对步骤6回收的病毒液进行4-10倍浓缩，得到纯化后的禽腺病毒，按照步骤3的方法测定蛋白含量与病毒含量。
2.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤1中鸡胚细胞为长成良好的单层CEF细胞。
3.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中蛋白含量的测定方法为：
使用超微量紫外-可见光光度计，选定A280蛋白测量法，以BSA作为内标蛋白，以0.1M的PBS作空白对照组，每个样品各测三次，记录测量所得数据。
4.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中病毒含量的测定方法为：
用灭菌的PBS溶液将收获的禽腺病毒培养液按10倍梯度稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8的四个稀释度，每个稀释度分别接种10枚9日龄SPF鸡胚，按照每枚0.1mL病毒培养液进行病毒接种，将接种后的鸡胚置于37℃温箱中进行孵化，弃掉24h内死亡的鸡胚，在孵化至72h后分别收集各稀释度病毒培养液接种鸡胚的尿囊液，利用Reed-Muench法对病毒EID50进行计算。
5.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述超滤膜包为100K的膜包。
6.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤6中阴离子交换层析柱为Macro-prep High Q层析柱。
7.根据权利要求6所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤6中使用阴离子交换层析对病毒进行纯化的具体方法如下：
使用3个柱体积的0.01M PBS溶液对Macro-prep High Q阴离子交换层析柱进行平衡；取10mL步骤5所得浓缩病毒液，并加入2mL含0.5mol/LTris的样品缓冲液稀释后进行上样，使用洗脱液对病毒进行纯化，其中洗脱液由A液、B液混合得到，A液为1.5mol/LNaCl溶液，B液为0.025mol/LTris溶液，以含25％A液、75％B液的混合液作为初始洗脱液对层析柱进行冲洗，初始洗脱液体积为2个柱体积；待初始洗脱液用完后，以4个柱体积的A液对层析柱进行冲洗；对收集到液体进行紫外检测，收集病毒吸收峰的样品液，得到纯化的病毒溶液。
8.根据权利要求7所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述病毒吸收峰的紫外检测波长为280nm。
9.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述步骤1中DMEM培养基为含1％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
10.根据权利要求1所述的禽腺病毒精纯化的方法，其特征在于，所述精纯化的方法还包括步骤8：取纯化后的禽腺病毒按照0.5mL/管进行分装，并置于-80℃的条件下保存。
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