CN116769733B

CN116769733B - 一种柯萨奇病毒b组4型毒株及应用

Info

Publication number: CN116769733B
Application number: CN202310962457.XA
Authority: CN
Inventors: 马绍辉; 冯昌增; 张名; 郭伟; 刘煜菡; 王晓辉; 杨昭庆; 和占龙; 孙浩; 叶尤松
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2023-08-02
Filing date: 2023-08-02
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2043-08-02
Also published as: CN116769733A

Abstract

本发明提供一种柯萨奇病毒B组4型毒株及其应用。该毒株命名为KM140‑G01，于2023年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202356，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该毒株是一种人源性柯萨奇病毒B组4型野生型单一纯化毒株，该毒株病毒复制能力强，遗传稳定性和免疫原性好；该毒株可应用于开发人用柯萨奇病毒B组4型疫苗的生产毒种，适用于包括减毒型柯萨奇病毒B组4型疫苗及灭活型柯萨奇病毒B组4型疫苗的研制；也可以在Vero细胞及乳鼠上建立感染模型，用于CVB4感染和致病机制研究以及CVB4疫苗评价和抗病毒药物筛选。

Description

一种柯萨奇病毒B组4型毒株及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地说是涉及一种柯萨奇病毒B组4型毒株及其应用。

背景技术

柯萨奇病毒B组4型（coxsackievirus B4，CVB4）属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属，是B组柯萨奇病毒（CVB）的一个主要成员。CVB4感染会引起多种不同程度的疾病或症状，如手足口病（Hand foot mouth disease，HFMD）、脑炎、心肌炎、无菌性脑膜炎甚至死亡。CVB4的感染中新生儿和儿童感染的风险较高，能够引起新生儿急性心肌炎和脑膜炎，存在着较高的致死风险，并且妊娠期间CVB4的感染可导致患有先天性心脏病变的婴儿出生。此外，CVB4还与1型糖尿病（T1DM）密切相关，临床研究发现，在子宫内和儿童期暴露于肠道病毒感染能够诱导胰岛β细胞损伤，并在持续感染中发展为T1D。长期以来，CVB4在全球范围内持续传播流行。美国1970-2005年的肠道病毒检测报告指出，CVB4占已知血清型报告的4.2%，而且一直出现在15种最常见的肠道病毒中。波兰、法国、意大利等多个国家亦有CVB4相关报告。从已有的文献来看，在中国，CVB4的病例多为散发病例。鉴于目前我国对HFMD的监测仍主要针对肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）、柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16, CVA16）、柯萨奇病毒A6型（Coxsackievirus A6, CVA6）和柯萨奇病毒A10型（Coxsackievirus A10, CVA10）等少数几个血清型来开展，包括CVB4在内的其它血清型在国内的流行情况很可能被低估。作为预防疾病最为经济、有效的措施之一，很有必要尽快开发出针对CVB4的单价或包含CVB4抗原成分的多价预防性疫苗。

迄今，尚无针对CVB4的疫苗或特异性抗病毒药批准上市。目前，肠道病毒领域内，仅有脊髓灰质炎病毒的减毒和灭活疫苗以及针对肠道病毒71型的灭活疫苗上市使用。不过以上疫苗对该血清型以外的其它血清型肠道病毒并无交叉保护作用。当前，针对B组柯萨奇病毒的疫苗研究主要是国外的研究人员和机构在推进。上世纪90年代，美国加州大学研究人员See等测试了福尔马林灭活柯萨奇病毒B1-6原型株开发的多价疫苗在小鼠中的功效，该疫苗可降低柯萨奇B组病毒临床株急性感染的严重程度。近年，瑞典学者Stone等进行了新型实验性六价CVB疫苗的开发和临床前测试，该疫苗在几种品系的小鼠和非人灵长类动物模型中具有较好的诱导中和抗体的能力；此外该疫苗可预防急性CVB感染，阻断心脏CVB感染以及预防CVB诱导的胰腺炎和糖尿病。目前该六价CVB疫苗的研究由Vactech与Provention Bio公司继续推动，旨在用于预防急性CVB感染及其并发症，以及潜在的延迟或预防CVB相关的自身免疫性疾病T1D和乳糜泻。

尽管随着病毒学和免疫学等相关学科的长足发展，近年来涌现出多种多样的新的疫苗开发技术路线，但受限于对肠道病毒生物学特性及抗原表位的研究和认识还不够深入、充分，相关的疫苗开发仍主要是在全病毒颗粒的基础上进行。已上市使用的肠道病毒相关疫苗（如脊髓灰质炎病毒疫苗、肠道病毒71型疫苗）均采用减毒或灭活等传统疫苗技术开发生产，并且获得了极其显著的免疫保护效果。开发中的产品也以灭活或减毒疫苗为主。此外，相对于减毒活疫苗，灭活疫苗没有毒力返祖及可引发疫苗相关疾病的缺点，具有较好免疫原性和安全性，是目前最为可行、合理的技术路线。CVB4病毒存在遗传多样性，尽管只有一个血清型，但是已经分化为5个基因型。文献报道不同基因型之间存在中和效价的差异。因此，开发对中国CVB4流行株（D和E基因型为优势基因型）具有高效防护作用的CVB4灭活疫苗已势在必行。在传统技术路线的疫苗开发中，筛选在细胞基质内复制能力强、遗传稳定性高，免疫原性和安全性好的毒株作为疫苗生产用毒种至关重要。

因此，如何提供一种符合疫苗开发要求的CVB4毒株，并将其应用于制备柯萨奇病毒疫苗是本领域亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种柯萨奇病毒B组4型毒株，应用于制备柯萨奇病毒B组4型疫苗，具备良好的复制能力、遗传稳定性和免疫原性。

本发明采用如下技术方案：

一种柯萨奇病毒B组4型毒株，所述毒株的基因组序列如SEQ ID NO：1或如SEQ IDNO：1所示序列的完全互补序列所示。

优选的，所述毒株命名为柯萨奇病毒B 组 4 型 KM140-G01Coxsackieviru B4CVB4 KM140-G01，于2023年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202356，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明的另一目的是，提供一种生物材料，为以下任意一种：

A .序列如SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

B.含有A所述核酸分子的表达盒；

C.含有A所述核酸分子的重组载体；

D.含有A所述核酸分子或B所述表达盒或C所述重组载体的重组微生物；

E.含有A所述核酸分子或B所述表达盒或C所述重组载体的细胞系。

本发明的另一目的是，提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有上述的柯萨奇病毒B组4型毒株或含有上述的生物材料。

本发明的另一目的是，提供上述柯萨奇病毒B组4型毒株或上述生物材料或上述免疫原性组合物的应用，为以下任意一种：

a.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物中的应用；

b.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

c.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

d.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

e.在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

.f.在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

g.在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

h.在制备柯萨奇病毒感染细胞模型中的应用；

i.在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

g.在预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物筛选或药效评价中的应用。

本发明的另一目的是，提供一种疫苗，所述疫苗含有上述的柯萨奇病毒B组4型毒株或含有上述的生物材料。

本发明的另一目的是，提供述疫苗的制备方法，将上述的柯萨奇病毒B组4型毒株或上述的生物材料在Vero细胞上培养，收获病毒液，经灭活和纯化后，加入佐剂配制，得灭活疫苗；

或经适应性传代或反向遗传学方法获得毒力弱化的减毒株，经细胞培养，收获病毒液，纯化后加入稳定剂和佐剂配制，得减毒疫苗。

有益效果：本发明筛选了一株具有代表性的柯萨奇病毒B组4型毒株KM140-G01，该毒株的分离和培养均采用Vero细胞，这种细胞基质作为人用疫苗细胞基质是安全可靠的。该毒株增殖能力强、遗传稳定性高、免疫原性好，所属的基因型D为中国两种优势CVB4基因型（D和E）之一，以其为毒种制备的灭活疫苗免疫动物后获得的抗血清对D和E基因型的同源和异源CVB4分离株均具有很高的中和效力。另外，本发明提供了以KM140-G01为毒种的灭活疫苗的制备和免疫学评价方法，为开发安全、有效、经济的CVB4灭活疫苗打下了坚实的基础。此外，利用本发明的KM140-G01毒株还可以构建稳定且重复性好的柯萨奇病毒B组4型的细胞内增殖模型和急性感染的动物模型，以上模型可为开展CVB4感染致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗免疫保护效果评价提供研究工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明中CVB4毒株在Vero细胞上适应增殖示意图，其中图1左为Vero正常细胞，图1右为CBV4毒株致细胞病变效应；

图2是本发明中KM140-G01毒株蚀斑形态；

图3是本发明中基于全长 VP1序列的 CVB4系统进化树；其中●代表本研究所涉及的D和E基因型的CVB4分离株；▲代表CVB4原型株；

图4是本发明中CVB4病毒浓缩液层析纯化峰图；

图5是本发明中CVB4灭活疫苗免疫原性；

图6是本发明中CVB4毒株在Vero细胞上的增殖模型；

图7是本发明中CVB4毒株感染新生乳鼠的临床表现；

图8是本发明中CVB4毒株感染新生乳鼠HE染色切片图；

图9是本发明中CVB4毒株感染新生乳鼠IHC染色切片图；

图10是本发明中CVB4毒株感染新生乳鼠组织病毒载量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 ：柯萨奇病毒B组4型(CVB4)毒株KM140-G01的分离和鉴定

（1）样本处理

收集云南省手足口病儿童患者粪便，取1g用PBS悬浮至5ml，混匀，1500g离心20min，上清液用0.22μm滤膜过滤除菌。

（2）病毒在Vero上的适应和分离

取过滤液100μL接种于已长成单层的Vero细胞，加入不含牛血清的MEM培养基，置35℃、5%CO₂培养并观察细胞病变，出现病变后收获培养物继续同法接种Vero细胞传代两次，收获培养物冻存备用，见附图1。

（3）蚀斑纯化

将在Vero细胞上已适应传代到第3代的病毒收获液进行10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度分别接种单层Vero细胞，37℃、5%CO₂吸附1h后，加入1.5%甲基纤维素-MEM，置35℃、5%CO₂培养，显微镜下观察细胞病变。蚀斑形成后，用吸头吸取出蚀斑，随即接种于单层Vero细胞，37℃、5%CO₂培养，待细胞病变达到90％以上后收获病毒，同法继续接种于Vero细胞进行蚀斑纯化两次。经过三轮蚀斑纯化后挑取单斑即为单克隆纯化毒株，接种于Vero细胞并收集病毒液，制成柯萨奇病毒B组4型野生型单一纯化毒株，见附图2。

（4）病毒鉴定

取200μL病毒液，按照IAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen, 德国）操作说明，提取病毒RNA，于-80℃冰箱保存。

根据PrimescriptTM One Step RT PCR Kit Ver.2（Takara，大连）的操作说明并利用引物“BOS-BOAS”对上述提取的病毒RNA进行RT-PCR。反应体系：总体积20μl，BOS、BOAS各1μl；2×1 Step buffer10μl；病毒RNA 3μl；PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μl；无酶水4μl。 RT-PCR反应条件：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃进一步延伸10min。取PCR产物5μl，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，由昆明擎科生物科技有限公司测序（Sanger测序法，ABI373XL测序仪）获得VP1序列，通过NCBI中Blast比对从而确定病毒血清型为CVB4。之后，利用MEGA7.0软件对GenBank数据库中获得的CVB4 VP1序列进行比对，根据保守区域设计引物 B4VP1F和B4VP1R，并利用NCBI数据库中Primer-BLAST检测引物特异性。利用B4VP1F和B4VP1R测通CVB4全长VP1序列。使用MEGA7.0的最大似然法（Maximum Likelihood, ML）和Kimura 2-parameter模型构建系统发育树，并将Bootstrap重复数设为1000用于评估进化树的可靠性与可重复性，对本次分离到的CVB4毒株进行系统进化分析。毒株KM140-G01属D基因型，为中国主要的CVB4基因型之一，见附图3。

所涉及全基因组序列测序引物及扩增位置如下（其中Y代表C或T，N代表A或C或G或T，R代表A或G ）：

B-OS（上游引物）：5’-GGYTAYATNCANTGYTGGTAYCARAC-3’，SEQ ID NO：2，扩增2296-2321；

B-OAS（下游引物）：5’-GGTGCTCACTAGGAGGTCYCTRTTRTARTCYTCCCR-3’，SEQ ID NO：3，扩增3414-3379；

EV1F（上游引物）：5’-TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3’，SEQ ID NO：4，扩增1-20；

B41f（上游引物）：5’-GTACCAGAAGCCGAAATGG-3’，SEQ ID NO：5，扩增863-882；

B41r（下游引物）：5’-CTAGCACTCAGACTAGTC-3’，SEQ ID NO：6，扩增774-752；

B42f（上游引物）：5’-GATACGTGGTGGATGAT-3’，SEQ ID NO：7，扩增774-752；

B42r（下游引物）：5’-GGCCTCTAGCAATTGTGTC-3’，SEQ ID NO：8，扩增2356-2338；

B43f（上游引物）：5’-TATATGGTTACAACTCACT-3’，SEQ ID NO：9，扩增2912-2930；

B44f（上游引物）：5’-TGTGGCTAGAAGATGATG-3’，SEQ ID NO：10，扩增3557-3574；

B45f（上游引物）：5’-AGCTCAACAGCTCGGTGT-3’，SEQ ID NO：11，扩增4328-4345；

B45r（下游引物）：5’-GGAGCTTTCAATGAACTC-3’，SEQ ID NO：12，扩增5778-5761；

B46f（上游引物）：5’-ACCTGAATCCAGGCATAG-3’，SEQ ID NO：13，扩增6347-6364；

B46r（下游引物）：5’-TTGTGGGAGTATCCTAGC-3’，SEQ ID NO：14，扩增6533-6516；

B47f（上游引物）：5’-GAATCAATCAGGTGGACC-3’，SEQ ID NO：15，扩增7105-7122；

B4VP1F（上游引物）：5’-TAATGTGTCTTGTGTCGGCT-3’，SEQ ID NO：16，扩增2207-2226；

B4VP1R（下游引物）：5’-TTGCCAATCAAAACTTGTTG-3’，SEQ ID NO：17，扩增3222-3203；

EV8R（下游引物）：5’-CACCGAATGCGGAGAATTTA-3’，SEQ ID NO：18。

利用上述引物分段扩增出病毒全基因组的各片段，经拼接获得全长基因组核苷酸序列。本实施例获得的CVB4分离株KM140-G01的全基因组核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将CVB4毒株KM140-G01于2023年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202356，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

（5）病毒感染性滴度检测

使用微量细胞病变法对CVB4毒株KM140-G01进行滴度测定。CVB4病毒液使用病毒稀释液（不含血清的MEM培养基）进行10倍系列稀释，获得10^-1~10^-8的病毒液，按照每个稀释度8孔重复加入96孔板中，每孔100μL不同稀释度的病毒液。并且至少留出8孔作为对照，加入 100μL病毒稀释液。将消化好的Vero细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，约10⁴个细胞。在35℃，5% CO₂下培养7天，显微镜下观察细胞病变。并按Karber法计算细胞半数感染量（50% cell culture infectious dose，CCID₅₀）。计算公式如下：LgCCID₅₀=L+d（S-0.5），L为病毒的最低稀释倍数的对数，d为稀释系数，S为细胞病变孔比例总和。

结果：毒株KM140-G01病毒滴度为：7.25lgCCID₅₀/ml。

（6）遗传稳定性分析

通过在Vero细胞上多次传代培养，收获P1代次至P15代次的病毒收获液。选用P1、P5、P10和P15代病毒收获液，各取200μl，按照IAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen, 德国）操作说明，提取病毒RNA。根据PrimescriptTM One Step RT PCR Kit Ver.2（Takara，大连）的操作说明并利用步骤（4）所述引物分段扩增出病毒全基因组。RT-PCR反应条件：50°C逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃进一步延伸5min。PCR产物送往昆明擎科生物科技有限公司测序（Sanger测序法，ABI373XL测序仪），测序引物见步骤（4）。使用DNAStar7.1软件中的SeqMan对全基因组序列进行比对拼接从而获得各代次病毒的全基因组序列。使用MEGA7.0软件对不同代次的全基因序列上核苷酸和氨基酸变化情况进行分析。

KM140-G01毒株在传代过程中出现5个核苷酸突变，分别位于序列CDS区第447、1166、4251、4342和4390位；在P5代出现2个氨基酸突变，CDS区第389和1448个氨基酸分别突变为K→R和S→A，位于VP3和3A区段；在P15代出现3个氨基酸突变，CDS区第149、1417和1464位氨基酸分别突变为W→G、S→R和Y→H，分别位于VP2、2C和3A区段。见表1。遗传稳定性结果显示，在连续传代过程中，KM140-G01毒株突变位点较少且在VP1区段没有发生突变，表现出较好的遗传稳定性。

表1 KM140-G01株各代次全基因序列核苷酸和氨基酸序列变化

实施例2 ：以KM140-G01毒株作为毒种制备CVB4灭活疫苗

1、CVB4灭活疫苗的制备

（1）病毒培养

使用10层细胞工厂或T225细胞培养瓶培养Vero细胞至所需数量，培养条件为：含10%新生牛血清的MEM培养基，37℃、5%CO₂静置培养。至细胞长成单层。将柯萨奇病毒B组4型毒株KM140-G01以感染复数为0.01~0.1接种到单层Vero上，使用不含牛血清的MEM培养基，35℃、5%CO₂下培养2-4天直至细胞病变达到90％以上，收获病毒液，即为病毒收获液。

（2）病毒灭活

病毒收获液经过室温/-20℃反复冻融3次后，用终浓度100μg/ml的甲醛在37℃条件下灭活，即得灭活病毒液。取灭活144h的病毒液样品，经亚硫酸氢钠中和后接种Vero细胞并盲传3代以验证灭活效果。未出现细胞病变，表明上述浓度的甲醛能在144h（6天）内将病毒完全灭活。为更好的确保病毒灭活的彻底性，将灭活时长定为7天。

（3）灭活病毒液澄清、浓缩与纯化

灭活病毒液经8000rpm离心30min，去除细胞碎片；采用孔径为100kD的超滤膜包对澄清的病毒液进行切向流过滤，浓缩50~200倍，制得病毒浓缩液；经Capto Core 400层析柱纯化，收取流穿液，即为病毒纯化液，见附图4。病毒纯化液经0.22um滤器过滤除菌后即成为病毒原液。

（4）灭活疫苗配制

根据设计的体积、抗原剂量和佐剂浓度，加入相应体积的病毒原液、铝佐剂和稀释剂（PBS），混匀后即成为CVB4灭活疫苗。在评价该疫苗的免疫原性实验中，疫苗体积为0.1ml/剂，抗原含量为3-20ug/0.1ml，铝含量浓度为0.35mg/ml。

2、CVB4病毒中和抗体检测

中和实验方法：病毒感染敏感细胞后，引起细胞形态学变化，出现致细胞病变效应(CPE)，特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE 的出现。

（1）攻击病毒CCID₅₀滴定和滴度梯度制备

按照上述步骤1的方法滴定病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml 中含100CCID₅₀的病毒载量；按照计算好的稀释比例稀释攻击病毒，得到实验所需的病毒总量(100CCID₅₀/0.05ml) 。取3支小管，每管加病毒稀释液0.9ml ，吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液到第一支小管中(即10CCID₅₀/0.05ml)，更换吸头混匀，按照此方法依次稀释至1CCID₅₀/0.05ml 和0.1CCID₅₀/0.05ml，进行病毒回滴试验。

（2）稀释待检血清

待检血清-20℃冻存备检。取无菌小管若干支置试管架上，每管加稀释液0.3ml，加待检血清0.1ml，盖紧盖子，震摇混匀，即为1:4稀释血清。56℃灭活30min。打开无菌包装96孔组织培养板，每孔加0.05ml稀释液，每份血清标本进行2倍系列稀释，每份血清标本的每个稀释度做两个复孔，同时设置每份待测血清对照孔、细胞对照孔各两孔。

（3）病毒中和抗体测定的操作步骤：

稀释好血清的96孔板中分别加入0.05ml攻击病毒 (含100CCID₅₀/0.05ml) ，置37℃孵育2h 。取一块新的96孔板，做病毒回滴试验 ( 每次实验都必须做)。孵育完成后，用胰酶消化液消化细胞，制备细胞悬液，调节细胞悬液的浓度为2×10⁵个/ml。待检标本板和病毒回滴板每孔分别加入0.1ml 细胞悬液，置35℃、5%CO₂培养，7天判定最终结果，并记录病毒滴定结果。注意：如果病毒回滴结果不在32-320CCID₅₀/0.05ml 的范围内，则试验无效，需重试。

（4）结果判定：

当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。

3、CVB4灭活疫苗的免疫原性评价

（1）将按照上述步骤1的方法制备的疫苗抗原免疫BALB/c小鼠，对不同剂量抗原的免疫效果进行分析，疫苗抗原含量为0.1ml含有3μg、5μg、10μg、20μg。免疫程序：3针皮下注射免疫，0.1ml/只，分别于1免后、2免后、3免后采血，分离血清，检测中和抗体。试验过程中，BALB/c小鼠共分6组，每组10只，对照为铝佐剂组和PBS缓冲液组。

中和抗体测定方案如下：

血清按照1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:1024，1:2048，1:4096稀释；阳性对照：本实验室制备的兔多抗血清；阴性对照：本实验室制备的兔阴性血清。按照步骤2中和抗体检测方法对各实验组和对照组免疫后的血清中和抗体效价进行检测。

结果表明：疫苗的量效关系显著，随着剂量提高，中和效价随之提高，3免后对KM140-G01的中和抗体效价大于1 ∶ 152，达到了保护性抗体水平，见图5。

（2）使用本实验室分离的其它3个D基因型CVB4分离株、1个E基因型CVB4以及20ug剂量组3免后的血清，检测KM140-G01制备的疫苗对同属D基因型的其它分离株和E基因型的CVB4毒株的免疫效果。

结果表明：20ug剂量组3免后的血清对其它D和E基因型CVB4毒株的中和抗体效价均大于1:1024，存在保护作用。

4、CVB4灭活疫苗的保护效力评价

为研究母传抗体对新生乳鼠的免疫保护作用，设置实验组为20μg/100μl组的CVB4疫苗、对照组为PBS组和铝佐剂组。对8周龄BALB/c母鼠进行免疫，每组免疫5只动物。对母鼠第一次进行免疫后，让其与雄鼠合笼，在母鼠怀孕后对其进行第二次免疫，二免后约两周母鼠妊娠。分娩后3天，对3日龄乳鼠进行攻毒实验，每只乳鼠颅脑注射致死剂量（30μl，病毒含量为10^5.5CCID₅₀）的步骤3所涉及的4个D基因型CVB4分离株病毒液，每日观察每组乳鼠的体重变化和临床评分，评估其母传抗体的保护性。

结果显示，实验母鼠组孕育的乳鼠在接种病毒后体重正常增加，无临床症状，健康，最终生存率均为100％。对照组孕育的乳鼠在接种病毒后体重几乎没有增加，临床症状明显，第2天开始死亡，第3天全部死亡，最终生存率均为0％。以上数据表明，实验组的母传抗体能为乳鼠提供对致死剂量的CVB4的完全保护能力。

实施例3 ：利用CVB4病毒毒株KM140-G01制备感染细胞模型

培养Vero细胞至单层，去除细胞培养基，使用PBS清洗，以MOI=1接种KM140-G01病毒，在37℃，5% CO₂下吸附1h后，去除病毒液，使用PBS清洗细胞表面3次，加入不含牛血清的MEM培养基，在35℃，5% CO₂下培养。以加入病毒液作为0h时点，于0h、3h、6h、12h、18h、24h和30h取样，提取样品RNA。使用根据CVB4病毒VP1的保守序列设计的引物CVB4vp1-F3（TGT CCTGTT TCC ACT GCT GTT，SEQ ID NO：19）、CVB4vp1-R3（GAA GAA TCA GTG GAG CGT GC，SEQID NO：20）和Taqman探针CVB4vp1-P3（CTC TGA ACA AAT CC 5’FAM 3’MGB，SEQ ID NO：21）及本实验室制备的CVB4 RNA标准品，采用RT-qPCR检测病毒拷贝数，从而确定KM140-G01在Vero上一个完整的感染周期的时长并建立其在Vero上的增殖曲线。毒株KM140-G01在Vero上的增殖模型见附图6。

RT-qPCR反应体系（20μL）：

2×一步法RT-PCR Buffer III缓冲液 10μL，TaKaRa Ex Taq HS（5U/μL）0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.4μL，CVB4vp1-P3（10μmol/L）0.4μL，CVB4vp1-F3（10μmol/L）1μL，CVB4vp1-R3（10μmol /L）1μL，无酶水5.8μL，RNA模板1μL。

反应条件：42℃逆转录 5min；95℃预变性10s，95℃变性5s，60℃退火延伸30s（40个循环）。

实施例4：利用CVB4病毒毒株KM140-G01制备感染动物模型

通过颅腔注射(Intracerebral injection，IC)途径，分别用10^3.5、10^4.5、10^5.5CCID₅₀/只三种不同的感染剂量的KM140-G01病毒感染3日龄BALB/c 新生乳鼠，探索建立3日龄BALB/c 新生乳鼠CVB4感染模型最佳的感染剂量。

乳鼠临床评分标准如下：健康（0分）；嗜睡，精神萎靡（1分）；消瘦（2分）；四肢乏力、毛发稀疏、驼背或无力（3分），濒死和死亡（4分）。

结果显示，对照组各相同日龄小鼠的体重、生存率及临床得分均无显著差异。实验组10^5.5CCID₅₀/只剂量实验组在攻毒后出现体重降低的情况，1天出现发病症状且较为严重，第2天乳鼠出现濒死或者死亡，该剂量实验组乳鼠存活时间均为2~3天。10^3.5和10^4.5CCID₅₀/只剂量实验组体重基本不增长，相较于对照组生长状态较差；实验组乳鼠在1~2天后出现发病症状，乳鼠存活时间不超过7天。见附图7。

选择10^3.5、10^4.5、10^5.5CCID₅₀/只三种不同的感染剂量的KM140-G01病毒感染后濒死乳鼠，取其脑、心脏、肺脏、脾脏、胰腺、上肢肌、上肢肌、肠道；其余脏器置10％中性福尔马林固定48h后，经石蜡包埋制作石蜡切片用以进行HE染色和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测。对于免疫组化检测，石蜡切片经过60℃烤片1h、酒精梯度脱蜡、EDTA抗原修复、脱水，使用本实验室制备的CVB4多克隆抗体4℃孵育过夜，室温孵育30min后滴加DAB显色，苏木素反蓝。阴性对照组切片抗体采用阴性血清。显微镜下检测结果。

HE染色显示，3个剂量的实验组中出现严重的肺部、脑部和肝脏的病理改变，具体的病理变化体现为：肺部存在较多的肺泡轻度扩张，相互融合，体积增大，并伴随较大面积出血，肺泡腔内可见多量的红细胞。大脑出现皮层、海马区结构紊乱，多量神经元坏死；皮层、海马及脑膜出血，可见较多的红细胞；丘脑少见神经元坏死，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失。肝脏组织多处坏死，结构紊乱，多见坏死的细胞碎片，周围并伴有少量的粒细胞浸润；多处可见髓外造血细胞呈灶状分布，10^5.5CCID₅₀/只剂量组见附图8。免疫组化实验结果显示，最大剂量（10^5.5CCID₅₀/只）攻毒后，在乳鼠的肺、脑和肝脏处出现CVB4抗原分布，其他组织未见明显的CVB4抗原分布，见附图9。收集10^5.5CCID₅₀/只剂量组乳鼠各个组织，提取RNA，参照实施例3，使用一步法实时荧光定量RT-PCR反应，对乳鼠各组织进行病毒载量测定，测定结果显示，实验组中，脑和肝脏的病毒载量水平明显高于其他组织，见附图10。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种柯萨奇病毒B组4型毒株，其特征在于，所述毒株的基因组序列如SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示序列的完全互补序列所示。

2.根据权利要求1所述的一种柯萨奇病毒B组4型毒株，其特征在于，所述毒株命名为KM140-G01，于2023年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202356，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

3.一种生物材料，其特征在于，为以下任意一种：

A.序列如SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

B.含有A所述核酸分子的表达盒；

C.含有A所述核酸分子的重组载体；

4.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物含有权利要求1或2所述的柯萨奇病毒B组4型毒株或含有权利要求3所述的生物材料。

5.权利要求1或2所述柯萨奇病毒B组4型毒株或权利要求3所述生物材料或权利要求4所述免疫原性组合物的应用，其特征在于，为以下任意一种：

a.在制备预防柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物中的应用；

b.在制备预防柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

c.在制备预防柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

d.在制备预防柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

e.在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

f.在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

h.在制备柯萨奇病毒感染细胞模型中的应用；

i.在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

j.在预防柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物筛选中的应用；

所述柯萨奇病毒为B组4型D基因型和/或B组4型E基因型柯萨奇病毒。

6.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1或2所述的柯萨奇病毒B组4型毒株或权利要求3所述的生物材料制备的灭活疫苗或减毒疫苗。

7.权利要求6所述疫苗的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的柯萨奇病毒B组4型毒株或权利要求3所述的生物材料在Vero细胞上培养，收获病毒液，经灭活和纯化后，加入佐剂配制，得灭活疫苗；