CN102018955A - 一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 - Google Patents
一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102018955A CN102018955A CN2010106055353A CN201010605535A CN102018955A CN 102018955 A CN102018955 A CN 102018955A CN 2010106055353 A CN2010106055353 A CN 2010106055353A CN 201010605535 A CN201010605535 A CN 201010605535A CN 102018955 A CN102018955 A CN 102018955A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- host cell
- vaccine
- purification
- chromatographic column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供了病毒性疫苗大规模生产的纯化方法，利用疏水层析方法去除宿主细胞DNA和杂蛋白。疏水柱层析采用低吸附疏水层析介质进行纯化，主要是利用病毒在一定硫酸铵浓度下，充分暴露其疏水性，从而使其能够结合在层析柱上，而部分杂蛋白由于疏水性弱，残余宿主细胞DNA不具有疏水性，不能结合，所以流穿出来，这样就可以达到去除杂蛋白及宿主细胞DNA目的，其中杂蛋白去除率在90%以上，宿主细胞残余DNA含量达到500pg左右。本发明提供了一种创新性的病毒性疫苗纯化方法，该方法纯化效果好、重复性好、适宜于规模化疫苗制备。经疏水层析后宿主细胞残余DNA在500pg/ml左右，再辅以离子交换等纯化方法可以达到国家药典标准。
Description
技术领域
本发明是对传统病毒性疫苗纯化工艺的改进，提供一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法，可用于多种病毒的纯化处理，属于生物技术领域。
背景技术
病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提纯出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是开发高质量疫苗的前提条件，另外病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质--DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。一种好的病毒抗原纯化工艺可以有效去除病毒培养过程中所带来的杂蛋白、宿主细胞DNA、内毒素、及其它杂质，并且具有很好的病毒抗原回收率及纯度。
传统的病毒类疫苗纯化采用蔗糖密度梯度超速离心纯化工艺，该工艺需要大型离心设备，价格高，上样量少，花费时间长，去除宿主细胞DNA效果也不理想，不适合疫苗产业化的要求；亲和层析方法虽然分离蛋白纯度高，但其对分离条件较严格，相对处理能力低，特别是由于易在表层形成蛋白胶质层，阻碍后期样品渗透，同样不适合大规模生产需要。
采用常规的凝胶过滤层析虽然其条件温和、重复性好、便于产业化，在疫苗纯化工艺中被广泛采用，但去除杂蛋白和DNA效果并不明显，所以在疫苗制备纯化工艺中只能作为辅助手段。
离子交换柱层析去除宿主细胞DNA效果较为理想，但其去除杂蛋白效果没有疏水层析效果好。其工作机理主要是利用病毒、杂蛋白和DNA的等电点不同，通过改变缓冲液浓度的办法，收集病毒，其操作简单，对病毒作用温和，可反复上样，上样量大，适合疫苗产业化的要求
目前国内对于Vero细胞等传代细胞的宿主残余细胞DNA，严格限制在每剂小于100pg，远远小于WHO和欧盟药典标准即小于10ng水平，因此应用传统的疫苗工艺很难达到我们国家药典标准，因此，需要对疫苗纯化工艺进行创新研究。
目前除重组疫苗以外尚无文献报道使用疏水层析方法纯化传统病毒性疫苗。
发明内容
本发明提供了一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法，克服了传统疫苗现有纯化技术的缺陷，具有纯化效果好、重复性好、便于疫苗产业化的特点。
本发明病毒性疫苗纯化方法的技术方案，包括下面步骤：
1）采用细胞培养技术收获的病毒抗原；
2）取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)疏水层析介质，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中；
3）用0.1-0.5M NaOH溶液，冲洗层析柱，至液体流出为PH8~14，保存1-24小时；
4）用注射用水冲洗层析柱至中性为止；
5）用10-40%硫酸铵，0.01-0.05MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积；
6）将疫苗稀释成含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样；
7）上样后继续用平衡液冲洗至基线；
8）用PB缓冲液、注射用水或0.01-0.2MTris-HCL洗脱收集疫苗抗原；
9）收集的洗脱峰样品用凝胶层析或超滤除盐，并进行相应指标测定。
所述病毒抗原为一种有包膜或无包膜病毒：如甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒、H5N1流感病毒、肾综合症出血热病毒、狂犬病病毒、甲型肝炎病毒，可以在灭活之前或灭活后进行纯化。
病毒抗原在纯化前可以用离心、0.45-2.5μm滤芯澄清过滤，然后用100-500KD超滤膜进行浓缩。
本发明的积极效果是：利用疏水层析方法去除宿主细胞DNA和杂蛋白。疏水柱层析采用低吸附疏水层析介质进行纯化，主要是利用病毒在一定硫酸铵浓度下，充分暴露其疏水性，从而使其能够结合在层析柱上，而部分杂蛋白由于疏水性弱，残余宿主细胞DNA不具有疏水性，不能结合，所以流穿出来，这样就可以达到去除杂蛋白及宿主细胞DNA目的，其中杂蛋白去除率在90%以上，宿主细胞残余DNA含量达到500pg左右。本发明提供了一种创新性的病毒性疫苗纯化方法，该方法纯化效果好、重复性好、适宜于规模化疫苗制备。经疏水层析后宿主细胞残余DNA在500pg/ml左右，再辅以离子交换等纯化方法可以达到国家药典标准。
附图说明
图1为甲1型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图2为甲3型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图3为乙型流感宿主细胞残余DNA含量图谱；
图4为H5N1流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图5为狂犬病疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图6为肾综合症出血热疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱。
具体实施方式：
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
将甲1型流感毒种，A/Solomon/3/06 (H1N1)-,IVR-145,来源于英国NIBSC，代次E8C3接种于经洗液冲洗的Vero单层细胞，143代，37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加含胰酶1-6μg/ml的普通培养基，33-35℃继续培育，当病变达+++-++++时收获细胞上清液，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，即为待纯化的甲1型流感病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、血凝滴度、宿主残余DNA含量等。方法同上，采用注射用水洗脱收集洗脱峰后，进行各项检测。
血凝素含量测定：
采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定：
采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
PB缓冲液洗脱结果： 注射用水洗脱结果
甲1型流感抗原回收率 85.6% 89.2%
蛋白去除率 92.5% 90.4%
内毒素含量 原倍合格 原倍合格
宿主细胞残余DNA含量 500pg/0.5ml 500pg/0.5ml
甲1型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱见图1；
结论：利用疏水柱层析纯化后，甲1型抗原回收率在85%以上，宿主残余DNA含量在500pg左右。
实施例2
将甲3型流感毒种，A/wisconsin/67/2005 (H3N2)-,NYMC-161,来源于NIBSC，代次E10C3接种于经洗液冲洗的Vero单层细胞，145代，37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加含胰酶1-6μg/ml的普通培养基，33-35℃继续培育，当病变达+++-++++时收获细胞上清液，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，即为待纯化的甲3型流感病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、血凝滴度、宿主残余DNA含量等。方法同上，采用Tris-HCL缓冲液洗脱收集洗脱峰后，进行各项检测。
血凝素含量测定：采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定： 采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
PB缓冲液洗脱结果： Tris-HCL缓冲液洗脱结果
甲3型流感抗原回收率 87.6% 91.2%
蛋白去除率 93.5% 90.4%
内毒素含量 原倍合格 原倍合格
宿主细胞残余DNA含量 500pg/0.5ml 500pg/0.5ml
甲3型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱见图2；
结论：利用疏水柱层析纯化后，甲3型抗原回收率在87%以上，宿主残余DNA含量在500pg左右。
实施例3
将乙型流感毒种，B/Malaysia/2506/2004,来源于英国NIBSC，代次E5C3接种于经洗液冲洗的Vero单层细胞，143代，37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加含胰酶1-6μg/ml的普通培养基，33-35℃继续培育，当病变达+++-++++时收获细胞上清液，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，即为待纯化的乙型流感病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、血凝滴度、宿主残余DNA含量等。
血凝素含量测定：采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定： 采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
纯化结果：
乙型流感抗原回收率 85.0%
蛋白去除率 90.2%
内毒素含量 原倍合格
宿主细胞残余DNA含量 500pg/0.5ml
乙型流感宿主细胞残余DNA含量图谱见图3；
结论：利用疏水柱层析纯化后，乙型抗原回收率在85%以上，宿主残余DNA含量在500pg左右。
实施例4
将A/Vietnam/1194/2004 （H5N1)（NIBRG-14）毒种代次E4C3接种于经洗液冲洗的Vero单层细胞，144代，37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加含胰酶1-6μg/ml的普通培养基，33-35℃继续培育，当病变达+++-++++时收获细胞上清液，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，即为待纯化的H5N1型流感病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、血凝滴度、宿主残余DNA含量等。
血凝素含量测定：采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定：采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
纯化结果：
H5N1抗原回收率 88.2%
蛋白去除率 92.0%
内毒素含量 原倍合格
宿主细胞残余DNA含量 500pg/ml
H5N1流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱见图4；
结论：利用疏水柱层析纯化后，H5N1型抗原回收率在88%以上，宿主残余DNA含量在500pg左右。
实施例5
将狂犬病病毒固定毒aG株接种于Vero单层细胞上，4-10天内收获细胞上清液3次，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，经分子筛凝胶过滤收集第一峰即为待进一步纯化的狂犬病病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、血凝滴度、宿主残余DNA含量等。
宿主细胞残余DNA测定： 采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
纯化结果：
狂犬病病毒NIH效价 5.26
蛋白去除率 93.0%
内毒素含量 原倍合格
宿主残余DNA含量 小于500pg/ml
狂犬病疫苗宿主残余DNA含量图谱见图5；
结论：利用疏水柱层析纯化后，H5N1型抗原回收率在88%以上，宿主残余DNA含量在500pg以下。
实施例6
将肾综合症出血热Ⅱ型病毒接种于Vero单层细胞上，收获细胞上清液，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤100-500kd膜包超滤浓缩，经分子筛凝胶过滤收集第一峰即为待进一步纯化的肾综合症出血热病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、血凝滴度、宿主细胞残余DNA含量等。
宿主细胞残余DNA测定： 采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
肾综合症出血热病毒中和抗体检测：取样品接种2kg左右的白色家兔4只，免疫两次，间隔7天，每只后肢肌肉注射1.0ml。第一次免疫后4周采血分离血清，用蚀斑减少中和试验检测中和抗体，中和病毒为出血热病毒Ⅱ型病毒株，同时用血清参考品做对照。
内毒素检测：采用鲎试剂检测法。
纯化结果：
肾综合症出血热病毒中和抗体滴度 1：1 0
蛋白去除率 95.0%
内毒素含量 原倍合格
宿主残余DNA含量 小于500pg/ml
肾综合症出血热疫苗宿主残余DNA含量图谱见图6；
结论：利用疏水柱层析纯化后，肾综合症出血热病毒中和抗体滴度 1：1 0
，宿主残余DNA含量在500pg以下。
实施例7
将甲型肝炎减毒病毒株接种于MRC-5单层细胞上，收获细胞冻融液，等量氯仿抽提后，经4500转离心、0.45μm滤芯过滤100kd膜包超滤浓缩，经分子筛凝胶过滤收集第一峰即为待进一步纯化的甲型肝炎病毒抗原。
取柱层析胶Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，经分子筛凝胶过滤后分别测定甲肝抗原含量、内毒素、蛋白质含量、病毒感染性滴度等。
蛋白含量测定:采用Lowrry法进行测定。
病毒感染性滴度LogCCID50/ml测定：病毒按1：10倍递增稀释至10-6-10-8，分别接种小方瓶的MRC-5单层细胞，每瓶1ml，37℃吸附3小时，补加维持液PH7.6 每瓶10ml，35℃培养4周，每周更换维持液，第四周冻融收获，经酶联免疫法进行抗原测定后，按Reed-Muench法计算病毒滴度LogCCID 50/ml。
纯化结果：
甲型肝炎病毒LogCCID50/ml 7.0
蛋白去除率 92.0%。
结论，通过此纯化可以制备纯化的甲型肝炎减毒活疫苗。
Claims (3)
1.一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法，所述方法包括下面步骤：
1）采用细胞培养技术收获的病毒抗原；
2）取柱层析胶Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中；
3）用0.1-1.0M NaOH溶液，冲洗层析柱，至液体流出为PH8~14，保存1-24小时；
4）用注射用水冲洗层析柱至中性为止；
5）用10-40%硫酸铵，0.01-0.05MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积；
6）将疫苗稀释成含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样；
7）上样后继续用平衡液冲洗至基线；
8）用PB缓冲液、注射用水或0.01-0.2MTris-HCL洗脱收集疫苗抗原；
9）收集的洗脱峰样品用凝胶层析或超滤除盐，并进行相应指标测定。
2.根据权利1要求所述的病毒纯化方法，其特征是：
1）所述病毒抗原为一种有包膜或无包膜病毒：如甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒、H5N1禽流感病毒、肾综合症出血热病毒、狂犬病病毒、甲型肝炎病毒。
3.根据权利1要求所述的病毒纯化方法，其特征是：该方法可以独立作为各种疫苗的纯化方法或与其它纯化方法组合成各种疫苗的纯化工艺。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010106055353A CN102018955A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010106055353A CN102018955A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102018955A true CN102018955A (zh) | 2011-04-20 |
Family
ID=43861005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010106055353A Pending CN102018955A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102018955A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007264A (zh) * | 2012-12-14 | 2013-04-03 | 北京民海生物科技有限公司 | b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用 |
| CN106668854A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-17 | 江苏中慧元通生物科技有限公司 | 一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法 |
| CN110274982A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 中牧实业股份有限公司 | 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 |
| CN114106154A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 上海健士拜生物科技有限公司 | 纳米抗体的层析方法 |
| CN114907430A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-16 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999019345A1 (en) * | 1997-10-14 | 1999-04-22 | Institute For Vaccine Development | Method for purifying retroviral particles and soluble viral antigens |
| CN1435260A (zh) * | 2002-01-28 | 2003-08-13 | 上海海欣生物技术有限公司 | 一种卵黄抗轮状病毒抗体制剂及制备方法和用途 |
| WO2007054297A2 (de) * | 2005-11-11 | 2007-05-18 | Csl Behring Gmbh | Verwendung hydrophober interaktionschromatographie zur virusabreichung |
| CN101018804A (zh) * | 2004-07-27 | 2007-08-15 | 基诺美生物工程（制药）公司 | 纯化病毒包膜的方法 |
-
2010
- 2010-12-27 CN CN2010106055353A patent/CN102018955A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999019345A1 (en) * | 1997-10-14 | 1999-04-22 | Institute For Vaccine Development | Method for purifying retroviral particles and soluble viral antigens |
| CN1435260A (zh) * | 2002-01-28 | 2003-08-13 | 上海海欣生物技术有限公司 | 一种卵黄抗轮状病毒抗体制剂及制备方法和用途 |
| CN101018804A (zh) * | 2004-07-27 | 2007-08-15 | 基诺美生物工程（制药）公司 | 纯化病毒包膜的方法 |
| WO2007054297A2 (de) * | 2005-11-11 | 2007-05-18 | Csl Behring Gmbh | Verwendung hydrophober interaktionschromatographie zur virusabreichung |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》 20071015 李殿申 基因工程干扰素2a纯化工艺研究 第13页 1－3 , * |
| WHO: "《WHO Guidelines and Recommendations- Technical Report》", 31 December 2004 * |
| 张景海主编: "《生物化学实验》", 31 March 2006, 中国医药科技出版社 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007264A (zh) * | 2012-12-14 | 2013-04-03 | 北京民海生物科技有限公司 | b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用 |
| CN106668854A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-17 | 江苏中慧元通生物科技有限公司 | 一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法 |
| CN110274982A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 中牧实业股份有限公司 | 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 |
| CN110274982B (zh) * | 2019-06-27 | 2021-09-14 | 中牧实业股份有限公司 | 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 |
| CN114106154A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 上海健士拜生物科技有限公司 | 纳米抗体的层析方法 |
| CN114907430A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-16 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
| CN114907430B (zh) * | 2022-06-21 | 2023-12-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102078605B (zh) | Vero细胞流感病毒疫苗制备方法 | |
| Fischer et al. | Purification of cell culture-derived influenza A virus via continuous anion exchange chromatography on monoliths | |
| CN107384877A (zh) | 一种慢病毒的纯化方法 | |
| Junter et al. | Polysaccharide-based chromatographic adsorbents for virus purification and viral clearance | |
| CN102018955A (zh) | 一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 | |
| WO2018103619A1 (zh) | 一种口蹄疫疫苗的制备方法 | |
| Opitz et al. | Sulfated membrane adsorbers for economic pseudo‐affinity capture of influenza virus particles | |
| CN101897963B (zh) | 一种手足口病病毒疫苗 | |
| CN101638427B (zh) | 一种病毒抗原的纯化方法 | |
| CN104560895A (zh) | 猪圆环病毒疫苗的纯化方法 | |
| CN102520169A (zh) | 一种动物狂犬病中和抗体elisa检测试剂盒及其应用 | |
| CN108623677A (zh) | 一种静注人免疫球蛋白的提纯方法 | |
| CN102552898B (zh) | 离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法 | |
| CN105349499B (zh) | 一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法及其产品和用途 | |
| CN102133399B (zh) | 一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺 | |
| CN103468653B (zh) | 一种肠道病毒71型的纯化方法 | |
| CN103111270B (zh) | 一种乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方法 | |
| CN104984739B (zh) | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 | |
| CN103937754A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法 | |
| Peries et al. | Studies on measles viral hemagglutination. | |
| CN107384878A (zh) | 一种精纯猪圆环病毒的方法 | |
| CN109134622A (zh) | 口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法 | |
| TWI242644B (en) | Method for screening autoantigen | |
| CN103642760B (zh) | 一种制备柯萨奇a16型病毒完整实心颗粒的方法 | |
| CN107779441B (zh) | 一种禽流感抗原的浓缩纯化方法、禽流感抗原 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110420 |