CN107779441B - 一种禽流感抗原的浓缩纯化方法、禽流感抗原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种禽流感抗原的浓缩纯化方法、禽流感抗原，属于抗原浓缩纯化领域。本发明禽流感抗原的浓缩纯化方法，包括以下步骤：1)将禽流感病毒液通过1000KD的膜包浓缩至所述病毒液体积的1/10～1/8，得回流液A；2)向回流液A中加入灭菌的PBS使其与步骤1)中的禽流感病毒液体积相同，然后通过1000KD的膜包浓缩至所述病毒液体积的1/10～1/8，得回流液B；3)将回流液B重复步骤2)中的操作1‑5次，得回流液C；4)向步骤3)所得回流液C中加入NaCl和PEG6000，混匀，静置，离心，收集沉淀，即得。本发明浓缩纯化方法，杂蛋白去除率可达到95％以上，内毒素含量明显减少。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽流感抗原的浓缩纯化方法、禽流感抗原，属于抗原浓缩纯化领域。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种对人类和禽类危害极大的传染性疾病，被国际兽医局确定为I型烈性传染病，其特征为从低致病毒株引起的轻度呼吸疾病、产蛋下降到高致病性毒株引起的急性致病性疫病等多种形式。自1988年以来在我国大部分地区仍然不断发生H9N2亚型AI。近几年在我国部分商品蛋鸡场及养鸡专业村的禽流感调查中发现H9亚型AIV阳性鸡群占总AIV抗体阳性鸡群的93.67％，说明在我国大部分地区都存在H9亚型AIV，仍是我国现有AIV的主要亚型。因此禽流感(H9亚型)灭活疫苗仍然是防控的有效手段之一。
目前我国大部分企业仍采用鸡胚培养生产禽流感疫苗，制备工艺简单，免疫效果良好，免疫持续时间长。但是鸡胚生产仍然存在一些弊端，鸡胚尿囊液中含有蛋白、细胞碎片、脂类等复杂成分，不易去除，制成苗之后免疫商品鸡，对鸡的应激较大，影响鸡的生长性能，尤其是产蛋鸡，产蛋率明显下降。因此，在不增加成本的基础上，如何去除胚液中存在的异源性物质成为了一个难题。
目前，大部分企业采用300KD膜包浓缩禽流感病毒液，去除的杂质不彻底，仍存在大量残留；使用蔗糖密度梯度离心、层析等方法纯化，生产成本会明显增加。
申请公布号为CN 106540249A的中国发明专利公开了一种禽流感(H5N1)或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法，包括以下步骤：(一)病毒培养和收获；(二)病毒的灭活；(三)病毒液初步分离：含有灭活的病毒细胞培养液或鸡胚尿囊液，经0.65μm滤膜过滤，除去细胞碎片及微粒体，澄清液体；(四)滤膜过滤灭活病毒液：以0.45μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备过滤病毒液；(五)病毒液超滤浓缩：分别使用中空纤维750K和500K超滤柱、300K和500K超滤膜包进行病毒液的浓缩洗滤；(六)将精制纯化病毒液按照固定工艺制成疫苗产品；(七)进行病毒毒力滴定、效力测定、蛋白含量测定。该专利公开的抗原浓缩纯化方法步骤繁琐复杂，且杂蛋白去除率有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种禽流感抗原的浓缩纯化方法，利用该方法得到的禽流感抗原杂蛋白去除率高达95％以上。
本发明的第二个目的在于提供一种禽流感抗原。
为实现上述目的，本发明禽流感抗原的浓缩纯化方法的技术方案是：
一种禽流感抗原的浓缩纯化方法，包括以下步骤：
1)将H9亚型禽流感病毒液通过孔径为1000KD的膜包浓缩至所述禽流感病毒液体积的1/10～1/8，得回流液A；
2)向回流液A中加入灭菌的PBS使其与步骤1)中的禽流感病毒液体积相同，然后通过孔径为1000KD的膜包浓缩至所述禽流感病毒液体积的1/10～1/8，得回流液B；
3)将回流液B重复步骤2)中的操作1-5次，得回流液C；
4)向步骤3)所得回流液C中加入NaCl和PEG6000，混匀，3～5℃静置，然后离心，收集沉淀，即得。
步骤1)中的H9亚型禽流感病毒液通过以下方法获得：
将H9亚型禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种，孵化，照检，收获，即得。
上述接种采用全自动接种机进行鸡胚接种。每胚接种0.1mL。
上述孵化为于37℃孵化72h。所述孵化在湿度为70％的孵化箱中进行。
通过照检，可以弃去死胚、弱胚，将活胚全部取出。然后于2～8℃冷却4～24h。之后用75％的酒精消毒后，采用全自动收获机收获鸡胚尿囊液，血凝价≥1：27。
步骤1)中的H9亚型禽流感病毒液在浓缩前依次通过10μm、1μm、0.65μm的切向流微滤中空纤维膜过滤。上述过滤，可除去尿囊液残渣和其它粗颗粒杂质。
步骤1)中的H9亚型禽流感病毒液在通过切向流微滤中空纤维膜过滤前以10000～12000rpm/min的转速离心30～40min。上述离心用以除去抗原中的大颗粒杂质。
步骤1)中浓缩至所述禽流感病毒液体积的1/10～1/8，优选为1/10。
步骤2)中浓缩至所述禽流感病毒液体积的1/10～1/8，优选为1/10。
步骤2)中灭菌的PBS的浓度为0.01mol/L。
步骤3)中3～5℃静置，优选为4℃静置。
步骤3)回流液C中红细胞血凝价≥1：29。步骤3)中弃去的透析液中无血凝价。
步骤4)中PEG6000的加入量为所述回流液C质量的6％。
步骤4)中NaCl的加入量为所述回流液C质量的4％。
步骤4)中的混匀的方式为搅拌混合4h。
步骤4)中的离心为于3～5℃以12000rpm/min的转速离心1h。优选为于4℃以12000rpm/min的转速离心1h。
步骤4)中的3～5℃静置为静置过夜。
步骤4)中将收集的沉淀用0.01mol/L灭菌的PBS重悬沉淀。
一种禽流感抗原，采用上述禽流感抗原的浓缩纯化方法处理得到。
本发明的禽流感抗原的浓缩纯化方法，采用1000KD膜包浓缩除去大部分杂质，PBS反复过滤，再用PEG6000沉淀病毒，可以得到纯度高的禽流感抗原。杂蛋白去除率可达到95％以上，内毒素含量明显减少。本发明方法可有效降低禽用灭活疫苗的免疫副反应，提高免疫效果，对生产具有积极的指导意义。
具体实施方式
实施例1
本实施例的禽流感抗原的浓缩纯化方法，包括以下步骤：
1)病毒接种与培养：将生产种毒H9亚型禽流感病毒用灭菌生理盐水做适当稀释后，采用全自动接种机进行鸡胚接种，每胚接种0.1mL，置于37℃、湿度为70％的孵化箱孵育72h；
2)病毒液收获：通过照检，弃去死胚、弱胚，将活胚全部取出，于2℃冷却24h，然后用75％酒精消毒后，采用全自动收获机收获鸡胚尿囊液，得收获病毒液，血凝价≥1：27；
3)病毒液粗离过滤：将收获的病毒液以12000rpm的转速离心30min，用以除去抗原中的大颗粒杂质；然后将离心后的病毒液依次通过10μm、1μm和0.65μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备，进一步除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质，得处理后的病毒液；
4)病毒液浓缩：将处理后的病毒液使用切向流过滤系统通过孔径为1000KD的膜包浓缩10倍，弃去透析液，得回流液A；
5)重复滤过：在步骤4)的回流液A中加0.01mol/L的灭菌PBS使其体积与步骤4)处理后的病毒液体积相同，使用切向流过滤系统通过孔径为1000KD的膜包浓缩至原体积的1/10，得回流液B；
6)将回流液B重复步骤5)中的操作5次，弃去透析液，得回流液C；回流液C中红细胞血凝价≥1：29，而透析液中无血凝价；
7)PEG6000沉淀病毒：在步骤6)回流液C中加入NaCl和PEG6000，搅拌混合4h，4℃静置过夜，4℃离心机离心，离心的转速为12000rpm/min，时间为1h；倒掉上清液，收集沉淀，将沉淀使用0.01mol/L的灭菌PBS重悬沉淀，即得；其中，NaCl的加入量为回流液C质量的4％；PEG6000的加入量为回流液C质量的6％。
本实施例的禽流感抗原，采用上述禽流感抗原的浓缩纯化方法处理得到。
实施例2
本实施例的禽流感抗原的浓缩纯化方法，包括以下步骤：
1)病毒接种与培养：将生产种毒H9亚型禽流感病毒用灭菌生理盐水做适当稀释后，采用全自动接种机进行鸡胚接种，每胚接种0.1mL，置于37℃、湿度为70％的孵化箱孵育72h；
2)病毒液收获：通过照检，弃去死胚、弱胚，将活胚全部取出，于8℃冷却4h，然后用75％酒精消毒后，采用全自动收获机收获鸡胚尿囊液，得收获病毒液，血凝价≥1：27；
3)病毒液粗离过滤：将收获的病毒液以10000rpm的转速离心40min，用以除去抗原中的大颗粒杂质；然后将离心后的病毒液依次通过10μm、1μm和0.65μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备，进一步除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质，得处理后的病毒液；
4)病毒液浓缩：将处理后的病毒液使用切向流过滤系统通过孔径为1000KD的膜包浓缩8倍，弃去透析液，得回流液A；
5)重复滤过：在步骤4)的回流液A中加0.01mol/L的灭菌PBS使其体积与步骤4)处理后的病毒液体积相同，使用切向流过滤系统通过孔径为1000KD的膜包浓缩至原体积的1/8，得回流液B；
6)将回流液B重复步骤5)中的操作1次，弃去透析液，得回流液C；回流液C中红细胞血凝价≥1：29，而透析液中无血凝价；
7)PEG6000沉淀病毒：在步骤6)回流液C中加入NaCl和PEG6000，搅拌混合4h，3℃静置过夜，3℃离心机离心，离心的转速为12000rpm/min，时间为1h；倒掉上清液，收集沉淀，将沉淀使用0.01mol/L的灭菌PBS重悬沉淀，即得；其中，NaCl的加入量为回流液C质量的4％；PEG6000的加入量为回流液C质量的6％。
本实施例的禽流感抗原，采用上述禽流感抗原的浓缩纯化方法处理得到。
实施例3
本实施例的禽流感抗原的浓缩纯化方法，包括以下步骤：
1)病毒接种与培养：将生产种毒H9亚型禽流感病毒用灭菌生理盐水做适当稀释后，采用全自动接种机进行鸡胚接种，每胚接种0.1mL，置于37℃、湿度为70％的孵化箱孵育72h；
2)病毒液收获：通过照检，弃去死胚、弱胚，将活胚全部取出，于5℃冷却15h，然后用75％酒精消毒后，采用全自动收获机收获鸡胚尿囊液，得收获病毒液，血凝价≥1：27；
3)病毒液粗离过滤：将收获的病毒液以11000rpm的转速离心35min，用以除去抗原中的大颗粒杂质；然后将离心后的病毒液依次通过10μm、1μm和0.65μm的切向流微滤中空纤维膜过滤设备，进一步除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质，得处理后的病毒液；
4)病毒液浓缩：将处理后的病毒液使用切向流过滤系统通过孔径为1000KD的膜包浓缩9倍，弃去透析液，得回流液A；
5)重复滤过：在步骤4)的回流液A中加0.01mol/L的灭菌PBS使其体积与步骤4)处理后的病毒液体积相同，使用切向流过滤系统通过孔径为1000KD的膜包浓缩至原体积的1/9，得回流液B；
6)将回流液B重复步骤5)中的操作1次，弃去透析液，得回流液C；回流液C中红细胞血凝价≥1：29，而透析液中无血凝价；
7)PEG6000沉淀病毒：在步骤6)回流液C中加NaCl和PEG6000，搅拌混合4h，5℃静置过夜，5℃离心机离心，离心的转速为12000rpm/min，时间为1h；倒掉上清液，收集沉淀，将沉淀使用0.01mol/L的灭菌PBS重悬沉淀，即得；其中，NaCl的加入量为回流液C质量的4％；PEG6000的加入量为回流液C质量的6％。
本实施例的禽流感抗原，采用上述禽流感抗原的浓缩纯化方法处理得到。
实验例
采用紫外分光光度计分别测定粗离后浓缩前(即实施例1步骤3)处理后的病毒液)和纯化后(即实施例1的禽流感抗原)中蛋白浓度和血凝滴度，采用鲎试剂实验检测内毒素含量，并计算杂蛋白去除率和内毒素去除率。杂蛋白去除率等于浓缩前蛋白质含量和纯化后蛋白含量的差值与浓缩前蛋白质含量的比值，内毒素去除率等于浓缩前内毒素含量和纯化后内毒素含量的差值与浓缩前内毒素含量的比值。
实验的重复性测定：按照上述实施例1的方法，生产6批不同批次的禽流感病毒，测定纯化后蛋白浓度、血凝滴度和内毒素含量。结果见表1。
表1禽流感抗原纯化检测结果
Claims (7)
1.一种禽流感抗原的浓缩纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将H9亚型禽流感病毒液通过孔径为1000KD的膜包浓缩至所述禽流感病毒液体积的1/10~1/8，得回流液A；
2）向回流液A中加入灭菌的PBS使其与步骤1）中的禽流感病毒液体积相同，然后通过孔径为1000KD的膜包浓缩至所述禽流感病毒液体积的1/10~1/8，得回流液B；
3）将回流液B重复步骤2）中的操作1-5次，得回流液C；
4）向步骤3）所得回流液C中加入NaCl和PEG6000，混匀，3~5℃静置，然后离心，收集沉淀，即得；
步骤1）中的H9亚型禽流感病毒液在浓缩前依次通过10μm、1μm、0.65μm的切向流微滤中空纤维膜过滤；
步骤1）中的H9亚型禽流感病毒液在通过切向流微滤中空纤维膜过滤前以10000~12000rpm/min的转速离心30~40min。
2.根据权利要求1所述的禽流感抗原的浓缩纯化方法，其特征在于，步骤2）中灭菌的PBS的浓度为0.01mol/L。
3.根据权利要求1所述的禽流感抗原的浓缩纯化方法，其特征在于，步骤4）中PEG6000的加入量为所述回流液C质量的6%。
4.根据权利要求1所述的禽流感抗原的浓缩纯化方法，其特征在于，步骤4）中NaCl的加入量为所述回流液C质量的4%。
5.根据权利要求1所述的禽流感抗原的浓缩纯化方法，其特征在于，步骤4）中的离心为于3~5℃以12000rpm/min的转速离心1h。
6.根据权利要求1所述的禽流感抗原的浓缩纯化方法，其特征在于，步骤4）中将收集的沉淀用0.01mol/L灭菌的PBS重悬沉淀。
7.一种禽流感抗原，其特征在于，采用权利要求1所述的禽流感抗原的浓缩纯化方法处理得到。
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