CN107164334B

CN107164334B - 一种猪圆环病毒繁殖培养基及其应用

Info

Publication number: CN107164334B
Application number: CN201710283815.9A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞爱; 徐家华; 刘郁夫; 张舒琼; 吴达兴; 廖世昌
Original assignee: South China Agricultural University; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: South China Agricultural University; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2037-04-26
Also published as: CN107164334A

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒繁殖培养基及其应用，包括按体积百分比计的以下成分：DMEM培养基84.5‑96.9％；非必须要氨基酸0.5‑2％；脂肪酸0.1‑1.5％；维生素溶液0.5‑2％；肽类物质溶液2‑10％；该应用为将培养基应用于猪圆环病毒的培养中，培养包括以下步骤：1)将PK‑15细胞经传代和培养；2)病毒繁殖结束后，离心去除细胞碎片；3)采用超滤的方式去除小分子蛋白质，收集被截流的浓缩液；4)使用分子筛层析方法分离猪圆环病毒，收集第一个蛋白质峰，得到猪圆环病毒；该培养基使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物质等替代血清，有利于提高病毒与在繁殖过程中产生的杂蛋白分离度，提高圆环灭活疫苗的品质。

Description

一种猪圆环病毒繁殖培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒繁殖培养基及其应用，属于病毒繁殖技术领域。

背景技术

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14-25nm，平均直径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA，由脱氧核糖核酸组成，沉降系数为52S，是目前发现的最小的动物病毒。PCV对外界的抵抗力较强，在pH＝3的酸性环境中很长时间不被灭活。该病毒对氯仿不敏感，在56℃或70℃处理一段时间不被灭活。在高温环境也能存活一段时间。不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV-1无致病性，1974年由德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现，1982年证实该病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织。后来证实该病毒只是一种可以感染猪的常规病毒，不会对感染猪造成危害。PCV-2却具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。PCV2及其相关的猪病，死亡率10％-30％不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40％，给养猪业造成严重的经济损失。目前，本病尚无有效治疗方法，要坚持预防为主的方针，除了加强饲养管理和卫生防疫措施，杜绝疫病的发生外，免疫接种圆环病毒疫苗是预防该病的最可靠措施。

目前，圆环病毒灭活疫苗很多都需要通过细胞培养来进行生产，在生产过程需要使用血清。在病毒繁殖过程中，病毒裂解细胞所产生的细胞碎片、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸等杂质成分，以及细胞代谢副产物等，易使接种猪产生过敏，持续发热等副作用。怎么样减少疫苗副反应，提高圆环病毒灭活疫苗的安全性是目前所有兽用疫苗关注的焦点问题。在生产过程中使用血清，由于血清成分复杂，多为白蛋白和免疫球蛋白其分子量相对较大，在很大程度上影响病毒与这些杂蛋白的分离。所以本发明了在PK-15细胞繁殖圆环病毒的基础上进一步进行了研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒繁殖培养基，该培养基使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物质等替代血清，有利于提高病毒与在繁殖过程中产生的杂蛋白分离度，提高圆环灭活疫苗的品质。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪圆环病毒繁殖培养基，包括按体积百分比计的以下成分：

作为优选，包括按体积百分比计的以下成分：

作为优选，肽类物质溶液为明胶酶解物溶液，肽类物质的分子量为10-500K，肽在溶液中的浓度为10-60mg/mL。

再优选地，肽类物质的分子量为30-100K，肽在溶液中的浓度为20-30mg/mL。

再优选地，明胶酶解物溶液通过以下方法制备获得：使用0.25％EDTA-胰酶溶液在温度为37℃的条件下酶解明胶，酶解时间为24～95h；然后用超滤膜进行过滤，得到明胶酶解物溶液。

再优选地，酶解明胶时，明胶与EDTA-胰酶溶液的质量体积比为1:10。

本发明的第二个目的在于提供一种上述培养基的应用。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种上述的猪圆环病毒繁殖培养基的应用，将培养基应用于猪圆环病毒的培养中。

作为优选，猪圆环病毒的培养包括以下步骤：

1)将PK-15细胞经传代和培养，PK-15细胞达到病毒接种的细胞密度时，将病毒接种至PK-15细胞中，并用猪圆环病毒繁殖培养基替换传代和培养PK-15细胞的培养基；

2)病毒繁殖结束后，离心去除细胞碎片；

3)采用超滤的方式去除小分子蛋白质，收集被截流的浓缩液；

4)使用分子筛层析方法分离猪圆环病毒，收集第一个蛋白质峰，得到猪圆环病毒。

作为优选，步骤2)中，离心的速度为3000-8000rmp/min，离心时间为10-50min。

作为优选，步骤3)中，超滤的方式中超滤膜的孔径为10-500K。

本发明的猪圆环病毒繁殖培养基设计原理如下：

猪圆环病毒在繁殖过程中需要各类营养物质，例如氨基酸、多肽等，通常繁殖病毒是需要使用血清，由于血清中存在大量的高分子蛋白质等，大大影响了病毒裂解细胞所产生的细胞碎片、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸等杂质成分与病毒的分离，而残留的杂质易使接种猪产生过敏、持续发热等副作用。因此本发明使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物质替代血清，通过研究得到培养基的新配方，培养基中不含血清，用于繁殖猪圆环病毒，再以超滤方式去除杂质，有利于病毒繁殖与纯化。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明猪圆环病毒繁殖培养基使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物质等替代血清，有利于提高病毒与在繁殖过程中产生的杂蛋白分离度，提高圆环灭活疫苗的品质；

2、本发明猪圆环病毒繁殖培养基的应用中提供了猪圆环病毒的培养方法，针对培养基的特性，以超滤的方式结合分子筛层析方法，可以去除病毒液中70％以上的蛋白质。

附图说明

图1为实施例2的层析图谱。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种猪圆环病毒繁殖培养基，包括按体积百分比计的以下成分：

其中非必须要氨基酸采用Gibco公司的产品，货号为：11140050；脂肪酸采用Gibco公司的产品，货号为：11905031；维生素溶液采用Gibco公司的产品，货号为：11120052；

其中，肽类物质溶液为明胶酶解物溶液，肽类物质的分子量为30-100K，肽在溶液中的浓度为20-30mg/mL；明胶酶解物溶液通过以下方法制备获得：使用0.25％EDTA-胰酶溶液在温度为37℃的条件下酶解明胶，明胶与EDTA-胰酶溶液的质量体积比为1:10；酶解时间为24～95h；然后用超滤膜进行过滤，得到明胶酶解物溶液。

将培养基应用于猪圆环病毒的培养中，包括以下步骤：

其中培养PK-15细胞的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基；

2)病毒繁殖结束后，离心去除细胞碎片，离心的速度为3000-8000rmp/min，离心时间为10-50min；

3)采用超滤的方式去除小分子蛋白质，超滤膜的孔径为10-500K，收集被截流的浓缩液；

4)使用分子筛层析方法分离猪圆环病毒，层析过程中，采用G E公司的G200层析填料，使用超纯水洗脱，收集第一个蛋白质峰，得到猪圆环病毒。

检测方法：通过TCID₅₀法测定猪圆环病毒的滴度。

实施例1：

猪圆环病毒繁殖培养基的制备，并将其用于病毒培养：

一、制备明胶酶解物溶液：使用0.25％EDTA-胰酶溶液在温度为37℃的条件下酶解明胶，明胶与EDTA-胰酶溶液的质量体积比为1:10；酶解时间为48h；然后用100K超滤膜进行过滤，得到平均分子直径为0.01μm的明胶酶解物溶液，肽在溶液中的浓度为12mg/mL，其中肽在溶液中的浓度用常规方法测定，包括考马斯亮蓝或微量法。

二、将明胶酶解物溶液用于制备培养基：猪圆环病毒繁殖培养基，包括按体积百分比计的以下成分：

以上物质的来源如具体实施方式所述。

三、采用猪圆环病毒繁殖培养基培养猪圆环病毒：包括以下步骤：

1)将PK-15细胞经传代和培养，PK-15细胞达到病毒接种的细胞密度时，将病毒接种至PK-15细胞中，并用猪圆环病毒繁殖培养基替换传代和培养PK-15细胞的培养基；其中培养PK-15细胞的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基；

2)病毒繁殖结束后，离心去除细胞碎片，离心的速度为5000rmp/min，离心时间为30min；

3)采用超滤的方式去除小分子蛋白质，超滤膜的孔径为100K，收集被截流的浓缩液；

4)用传统TCID₅₀法测定圆环病毒的滴度，考马斯亮蓝或者微量法检测接种前后的总蛋白量，结果如表格1所示：

表格1实施例1猪圆环病毒的滴度及处理前后的总蛋白量

实施例2：

实施例2的特点在于：步骤三的4)：使用分子筛层析方法分离猪圆环病毒，层析过程中，采用GE公司的G200层析填料，使用超纯水洗脱，层析图谱如图1所示，出现两个峰值的线表示蛋白质的变化情况，出现一个峰值的线表示溶液中电导(各种离子浓度)变化情况，收集第一个蛋白质峰(如图中箭头所指)，得到猪圆环病毒。

表格2实施例2猪圆环病毒的滴度及处理前后的总蛋白量

从实施例1和2的数据可得，实施例2中采用分子筛层析方法分离猪圆环病毒，能够更好地去除蛋白质。

实施例3-4：

实施例3-4提供了猪圆环病毒繁殖培养基的制备，并将其用于病毒培养，其中明胶酶解物溶液、猪圆环病毒的培养方法与实施例2相同，实施例2-4的培养基参数如表格3所示：

表格3实施例2-4的培养基成分参数

成分	实施例2	实施例3	实施例4
				DMEM培养基(％)	92.6	96	94.1
非必须要氨基酸(％)	1	0.5	0.5
				脂肪酸(％)	0.4	0.2	0.4
维生素溶液(％)	1	0.8	1.5
				明胶酶解物溶液(％)	5	2.5	3.5

对比例1-3

对比例1-3分别采用含体积百分数10％、5％和3％胎牛血清的DMEM培养基作为病毒繁殖培养基，培养猪圆环病毒的方法和实施例2相同。

使用TCID₅₀法测定测定病毒滴度，如表格3所示：

表格3病毒滴度结果

	对比例1	对比例2	对比例3	实施例2	实施例3	实施例4
							TCID<sub>50</sub>/mL	7.5	7.8	7.5	7.1	7.1	7.3

结果表明：圆环病毒繁殖专用培养基比含有胎牛血清的培养基繁殖圆环病毒的滴度略低，而不同猪圆环病毒繁殖培养基繁殖圆环病毒的滴度相似，表现出培养基的稳定性。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种猪圆环病毒繁殖培养基，其特征在于，包括按体积百分比计的以下成分：

所述肽类物质溶液为明胶酶解物溶液，肽类物质的分子量为30-100K，肽在溶液中的浓度为20-30mg/mL；

所述明胶酶解物溶液通过以下方法制备获得：使用0.25％EDTA-胰酶溶液在温度为37℃的条件下酶解明胶，酶解时间为24～95h；然后用超滤膜进行过滤，得到明胶酶解物溶液；

酶解明胶时，明胶与EDTA-胰酶溶液的质量体积比为1:10。

2.一种如权利要求1所述的猪圆环病毒繁殖培养基的应用，其特征在于，将培养基应用于猪圆环病毒的培养中。

3.一种如权利要求1所述的猪圆环病毒繁殖培养基的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒的培养包括以下步骤：

2)病毒繁殖结束后，离心去除细胞碎片；

4.如权利要求3所述的猪圆环病毒繁殖培养基的应用，其特征在于，步骤2)中，离心的速度为3000-8000rmp/min，离心时间为10-50min。

5.如权利要求3所述的猪圆环病毒繁殖培养基的应用，其特征在于，步骤3)中，超滤的方式中超滤膜的孔径为10-500K。