CN109529031A - 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置 - Google Patents

一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置 Download PDF

Info

Publication number
CN109529031A
CN109529031A CN201910075135.7A CN201910075135A CN109529031A CN 109529031 A CN109529031 A CN 109529031A CN 201910075135 A CN201910075135 A CN 201910075135A CN 109529031 A CN109529031 A CN 109529031A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouth disease
cell
foot
disease virus
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910075135.7A
Other languages
English (en)
Inventor
付显东
孙素芳
姬彦波
张三喜
马力
陈奎
王劲松
李华
赵书强
罗志忠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201910075135.7A priority Critical patent/CN109529031A/zh
Publication of CN109529031A publication Critical patent/CN109529031A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/02—Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液；S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。本发明还公开了上述口蹄疫疫苗的制备装置。本发明利用BHK‑21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，将BHK‑21贴壁细胞培养技术与分离纯化浓缩技术有机结合，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情，生产周期更短，成本更低，且质量更好。

Description

一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置。
背景技术
口蹄疫(Foot andmouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV)引起的引起的一种急性、发热性、高度接触性传染的动物传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄类动物，其临床诊断特征为口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱，易感动物多达70多种。口蹄疫疫病传染性极强，可引起动物生产性能下降，一旦爆发会给被感染地区的畜牧业造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易，被世界动物卫生组织列为必须在第一时间报告疫情的疫病之一。
FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，血清型众多，包括0、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型共7个血清型。FMD疫苗经历了灭活疫苗、活疫苗、灭活疫苗这一历发展趋势，目前也有部分新型疫苗(合成肽疫苗)面市。
其中，灭活疫苗最初使用舌皮组织毒经甲醛灭活制成的疫苗，经过将近20年的发展，现在主要通过细胞培养病毒经BEI灭活制成疫苗。对于口蹄疫疫苗的制备方法，目前本领域通常采用的是各种分离纯化加工单元的简单组合，例如，采用连续流离心搭配直流过滤、深层过滤、或者中空纤维过滤、PEG沉淀法或者色谱层析法等手段对收获的口蹄疫病毒细胞培养液进行分离和纯化，以获得纯化的口蹄疫病毒疫苗。这种分离纯化加工单元的简单组合难以发挥各加工单元的最佳分离纯化效率，造成产品品质、生产效率和生产成本极不平衡的状况，而这是人们所不希望的。
随着家畜集约化养殖水平的提高，尤其是奶牛饲养量的增大，疫苗的轻微副反应，就可带来巨大的经济损失，如怀孕牛流产、泌乳牛产奶量下降、乳品质下降等，无任何副反应的疫苗在市场上有巨大的需求空间。
现有的口蹄疫灭活疫苗主要存在以下两个问题：1.免疫保护力不稳定，主要表现在：免疫后检测不到中和抗体或者抗体水平很低，或者免疫期较短，只有2～3个月；2.免疫副反应大，主要是：下游生产工艺仍为传统方法，未经纯化处理，疫苗中存在一些培养基和宿主细胞中的杂质及过敏性物质，而且有效抗原含量低。这对口蹄疫的免疫防控工作带来极大的影响。
近些年来，国内外关于疫苗分离纯化的研究群雄并起，异军突起，成绩斐然。在人用生物制品中，通过FDA认证的疫苗已有上百种，而正在研制开发中的疫苗达数千种之多，有关疫苗研究的科学论文和专利几乎都涉及到分离纯化技术，近年来这类文献呈现指数增长态势。但分离纯化技术仍未在兽用疫苗的生产中得到应用。随着我国畜牧业的发展，人们对兽用疫苗纯度和安全性等提出更高要求。
疫苗的分离纯化主要是去除培养基和宿主细胞中的杂蛋白、肽、核酸及污染菌和它产生的内毒素，传统的蔗糖密度梯度离心法、沉淀和过滤技术在疫苗的抗原纯化中仍被普遍采用，但绝大部分是简单分离得到的粗制疫苗，其中抗原含量较低，且可能含有一些杂质和过敏性物质，这些传统疫苗的处理方法一般均存在纯度、活力以及安全性偏低，不适合应用于规模化生产等缺点，满足不了新疫苗的研制和生产的需要。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置。
本发明所采用的技术方案为：一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
可选地，所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
可选地，所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。
可选地，所述步骤S2具体包括以下过程：除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质并除去口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液。所述大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，其中，所述大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm。所述小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，其中，所述小分子杂质的尺寸小于5x105道尔顿。
可选地，所述步骤S4具体包括以下过程：用1mM～3mM的BEI30℃灭活28小时，灭活液经2-10倍稀释后，按1:1重量比加矿物油佐剂乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明还公开了上述口蹄疫疫苗的制备装置，包括依次连接的生物反应器、细胞罐、第一过滤组件和第二过滤组件；所述第一过滤组件包括依次连接的第一料液罐、第一主泵、第一过滤罐和第一恒流泵；所述第二过滤组件包括依次连接的浓缩罐、第二主泵、第二过滤罐和第二恒流泵；所述第一恒流泵与所述浓缩罐相连；所述第一过滤罐内设有去除所述大颗粒杂质的滤芯单元，所述第二过滤罐内设有去除所述小分子杂质的滤膜单元。
工作时，在生物反应器中培养细胞液，当细胞密度达到2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml时，将全部细胞液转移至细胞罐中进行接种毒株，培养以获得毒液，获得的毒液进入第一料液罐中，由第一主泵抽至第一过滤罐中，经过第一次过滤去除大颗粒杂质后，再经过第一恒流泵送至浓缩罐中，浓缩罐中的毒液经过第二主泵送至第二过滤罐内，小分子杂质通过第二过滤罐内的滤膜单元随着滤过液排出。设置第一恒流泵和第二恒流泵以控制膜通量。
其中，大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm，大颗粒杂质的尺寸大于滤芯单元的孔径，因此不能通过滤芯单元而被截留在第一过滤罐中；小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，小分子杂质的尺寸小于5x105道尔顿，这些小分子杂质的尺寸小于滤膜单元的孔径，因此可以透过滤膜单元而存在于滤过液中，随着滤过液排出。
可选地，所述滤芯单元包括沿着滤液流动方向依次设置的孔径分别为5微米、1微米和0.45微米的滤芯。
可选地，所述滤膜单元为截留分子量为6kd-20kd的中空纤维柱或者截留分子量为6kd-20kd的膜包。
本发明的有益效果为：本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，将BHK-21贴壁细胞培养技术与分离纯化浓缩技术有机结合，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情，生产周期更短，成本更低，且质量更好；本发明中，使用BHK-21贴壁细胞用于制备口蹄疫疫苗，免去了将贴壁细胞驯化为悬浮细胞的过程，避免了现有的BHK-21细胞大规模悬浮培养制备口蹄疫疫苗技术中必需的逐级放大过程，简化了工艺流程，缩短生产周期，在短时间内大规模培养得到极高密度的贴壁BHK-21细胞，为口蹄疫病毒的感染和复制提供更优的环境，从而提高抗原数量和质量；结合高效率的生物反应器灌流培养方式与广泛应用的大型细胞罐一次性接毒方式，在提高生产效率的同时最大程度的减小了口蹄疫病毒的逃逸，减少污染机会。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图。
图2是本发明装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例1：
如图1所示，一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
实施例2：
如图1所示，一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
实施例3：
如图1所示，一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
实施例4：
如图1所示，一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。
实施例5：
如图1所示，一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。
所述步骤S2具体包括以下过程：除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质并除去口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液。所述大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，其中，所述大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm。所述小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，其中，所述小分子杂质的尺寸小于5x105道尔顿。
实施例6：
如图1所示，一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
本发明中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本发明利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。
所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。
所述步骤S2具体包括以下过程：除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质并除去口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液。所述大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，其中，所述大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm。所述小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，其中，所述小分子杂质的尺寸小于5x105道尔顿。
所述步骤S4具体包括以下过程：用1mM～3mM的BEI30℃灭活28小时，灭活液经2-10倍稀释后，按1:1重量比加矿物油佐剂乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
实施例7：
如图2所示，一种口蹄疫疫苗的制备装置，包括依次连接的生物反应器1、细胞罐2、第一过滤组件和第二过滤组件；所述第一过滤组件包括依次连接的第一料液罐3、第一主泵4、第一过滤罐5和第一恒流泵6；所述第二过滤组件包括依次连接的浓缩罐7、第二主泵8、第二过滤罐9和第二恒流泵10；所述第一恒流泵6与所述浓缩罐7相连；所述第一过滤罐5内设有去除大颗粒杂质的滤芯单元，所述第二过滤罐9内设有去除小分子杂质的滤膜单元。其中，所述滤芯单元包括沿着滤液流动方向依次设置的孔径分别为5微米、1微米和0.45微米的滤芯；所述滤膜单元为截留分子量为6kd-20kd的中空纤维柱或者截留分子量为6kd-20kd的膜包。
工作时，在生物反应器1中培养细胞液，当细胞密度达到2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml时，将全部细胞液转移至细胞罐2中进行接种毒株，培养以获得毒液，获得的毒液进入第一料液罐3中，由第一主泵4抽至第一过滤罐5中，经过第一次过滤去除大颗粒杂质后，再经过第一恒流泵6送至浓缩罐7中，浓缩罐7中的毒液经过第二主泵8送至第二过滤罐9内，小分子杂质通过第二过滤罐9内的滤膜单元随着滤过液排出。设置第一恒流泵6和第二恒流泵10以控制膜通量。
其中，大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm，大颗粒杂质的尺寸大于滤芯单元的孔径，因此不能通过滤芯单元而被截留在第一过滤罐5中；小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，小分子杂质的尺寸小于5x105道尔顿，这些小分子杂质的尺寸小于滤膜单元的孔径，因此可以透过滤膜单元而存在于滤过液中，随着滤过液排出。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (9)

1.一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液；
S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；
S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下过程：
S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度大于2x107个细胞/ml；
S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。
3.根据权利要求2所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。
4.根据权利要求2所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。
5.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括以下过程：除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质并除去口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液。
6.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S4具体包括以下过程：用1mM～3mM的BEI30℃灭活28小时，灭活液经2-10倍稀释后，按1:1重量比加矿物油佐剂乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。
7.根据权利要求5所述的口蹄疫疫苗的制备装置，其特征在于：包括依次连接的生物反应器、细胞罐、第一过滤组件和第二过滤组件；所述第一过滤组件包括依次连接的第一料液罐、第一主泵、第一过滤罐和第一恒流泵；所述第二过滤组件包括依次连接的浓缩罐、第二主泵、第二过滤罐和第二恒流泵；所述第一恒流泵与所述浓缩罐相连；所述第一过滤罐内设有去除所述大颗粒杂质的滤芯单元，所述第二过滤罐内设有去除所述小分子杂质的滤膜单元。
8.根据权利要求7所述的口蹄疫疫苗的制备装置，其特征在于：所述滤芯单元包括沿着滤液流动方向依次设置的孔径分别为5微米、1微米和0.45微米的滤芯。
9.根据权利要求7所述的口蹄疫疫苗的制备装置，其特征在于：所述滤膜单元为截留分子量为6kd-20kd的中空纤维柱或者截留分子量为6kd-20kd的膜包。
CN201910075135.7A 2019-01-25 2019-01-25 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置 Pending CN109529031A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910075135.7A CN109529031A (zh) 2019-01-25 2019-01-25 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910075135.7A CN109529031A (zh) 2019-01-25 2019-01-25 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109529031A true CN109529031A (zh) 2019-03-29

Family

ID=65838648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910075135.7A Pending CN109529031A (zh) 2019-01-25 2019-01-25 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109529031A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181287A (zh) * 2021-12-10 2022-03-15 商丘安华生物疫苗有限公司 一种dna病毒疫苗的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087995A (zh) * 2012-12-28 2013-05-08 杭州国牧生物科技有限公司 一种使用bhk-21贴壁细胞制备口蹄疫疫苗的方法
CN103374547A (zh) * 2012-07-04 2013-10-30 北京健翔和牧生物科技有限公司 一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法
CN106474466A (zh) * 2016-12-07 2017-03-08 申联生物医药（上海）股份有限公司 一种口蹄疫疫苗的制备方法
CN107794249A (zh) * 2016-09-02 2018-03-13 生源霸科乌拉圭有限公司 感染、提纯、灭活和浓缩口蹄疫病毒生产疫苗抗原的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103374547A (zh) * 2012-07-04 2013-10-30 北京健翔和牧生物科技有限公司 一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法
CN103087995A (zh) * 2012-12-28 2013-05-08 杭州国牧生物科技有限公司 一种使用bhk-21贴壁细胞制备口蹄疫疫苗的方法
CN107794249A (zh) * 2016-09-02 2018-03-13 生源霸科乌拉圭有限公司 感染、提纯、灭活和浓缩口蹄疫病毒生产疫苗抗原的方法
CN106474466A (zh) * 2016-12-07 2017-03-08 申联生物医药（上海）股份有限公司 一种口蹄疫疫苗的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181287A (zh) * 2021-12-10 2022-03-15 商丘安华生物疫苗有限公司 一种dna病毒疫苗的制备方法
CN114181287B (zh) * 2021-12-10 2023-09-19 商丘美兰生物工程有限公司 一种dna病毒疫苗的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19612966B4 (de) MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
CN107267466B (zh) 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法
CN104491855B (zh) 一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品
CN103374547B (zh) 一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法
CN102344912B (zh) 猪伪狂犬病毒毒株及用其制备的猪伪狂犬病灭活疫苗
CN101491672A (zh) 一种鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活疫苗及其制备方法
CN107567496A (zh) 有关病毒的无菌纯化方法
CN106540249A (zh) 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法
CN101234198A (zh) 猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“sd1株”的制备方法
CN103223163A (zh) Ipv-dpt疫苗
CN109529031A (zh) 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置
CN106754765A (zh) 一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用
CN104826097A (zh) 一种口蹄疫疫苗的制备方法
CN102988970B (zh) 口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用
CN101851609A (zh) 猪细小病毒l株及在制备猪细小病毒病灭活疫苗中的用途
CN101633911A (zh) 适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术
CN103937754A (zh) 一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法
CN106279376A (zh) 一种猪圆环病毒抗原纯化方法
CN114645024B (zh) 降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及dna残留的方法
CN106237323A (zh) 猪蓝耳病纯化疫苗及其制备方法
CN101633912A (zh) 适合于大规模生产人用禽流感疫苗的裂解方法
CN107164334A (zh) 一种猪圆环病毒繁殖培养基及其应用
Wang et al. Efficient purification of cell culture-derived classical swine fever virus by ultrafiltration and size-exclusion chromatography
CN106674346A (zh) 一种预防牛支原体疾病的特异性卵黄抗体及其制备方法与应用
CN108261543A (zh) 传代细胞源nd、ib、ai三联灭活疫苗的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190329