CN103374547A

CN103374547A - 一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN103374547A
Application number: CN2012102303940A
Authority: CN
Inventors: 张澍; 吕宏亮
Original assignee: SHANXI LONGKEER BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd; BEIJING JIANXIANG HEMU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Bi Wei Antai Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-07-04
Also published as: CN103374547B

Abstract

本发明公开了一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，还涉及一种无血清或无动物源性成分的培养基及其在制备口蹄疫疫苗中的应用。属于生物技术领域。本发明的一种纯化口蹄疫疫苗的制备方法，包括采用无血清或无动物源性成分培养基培养口蹄疫病毒，进而对收获得到的病毒液进行纯化，获得纯化抗原。细胞株BHK-21或BSR经无血清培养基驯化培养多代形成300L的微载体悬浮培养，又经接种口蹄疫病毒，以30~50rpm的转速搅拌，经微滤、超滤、浓缩50~200倍，再经Sephawse6FF分子筛层析或蔗糖密度区带连续流离心，在经β丙内酯灭活，可用于配制针对牛、羊、猪各血清型单价以及多价苗。

Description

一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，还涉及一种无血清或无动物源性成分的培养基及其在制备口蹄疫疫苗中的应用。属于生物技术领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。该病一旦爆发将对发病国造成巨大的经济损失，世界各国对该病的研究极为重视，国际兽医局将其列为A类传染病之首。口蹄疫属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，有A、O、C、Asia I、SA T1、SA T2和SA T3型7个血清型。目前我国口蹄疫的防制仍以预防为主。尽管传统疫苗在口蹄疫预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的口蹄疫疫苗仍显得非常必要。

随着家畜集约化养殖水平的提高，尤其是奶牛饲养量的增大，疫苗的轻微副反应，就可带来巨大的经济损失，如怀孕牛流产、泌乳牛产奶量下降、乳品质下降等，无任何副反应的疫苗在市场上有巨大的需求空间。

现有的口蹄疫灭活疫苗主要存在以下两个问题：1.免疫保护力不稳定，主要表现在：免疫后检测不到中和抗体或者抗体水平很低，或者免疫期较短，只有2～3个月；2.免疫副反应大，主要是：下游生产工艺仍为传统方法，未经纯化处理，疫苗中存在一些培养基和宿主细胞中的杂质及过敏性物质，而且有效抗原含量低。这对口蹄疫的免疫防控工作带来极大的影响。

从采用的培养基上看，含有动物源血清或成分的培养基使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险升高，因此使用无有动物源血清或成分的培养基降低生产中的污染风险，并且能够排除牛血清杂蛋白在疫苗使用引起的应急反应，也降低了疫苗污染外源因子的风险。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种适用于BHK-21细胞或BSR细胞培养的无血清或无动物源性成分的培养基。

本发明的目的之二在于提供一种利用本发明的培养基生产口蹄疫纯化疫苗的方法及由该方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种无血清或无动物源性成分的培养基，其特征在于每升所述的培养基中含有以下成分：350-400mg L-丙氨酸，80-100mg L-盐酸精氨酸，250-300mg L-天冬氨酸，50-90mg L-盐酸半胱氨酸，100-140mg L-谷氨酸，25-75mg L-精氨酸，80-120mg L-酪氨酸，110-150mg L-缬氨酸，2.0-3.0Kg蔗糖，80-120mg枸缘酸钠，7.0-8.0Kg NaCl，280-320mg KCl，180-220mg CaCl₂以及15-25mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

在本发明的一种无血清或无动物源性成分的培养基，优选的，每升所述的培养基中含有以下成分：380mg L-丙氨酸，90mg L-盐酸精氨酸，280mg L-天冬氨酸，70mgL-盐酸半胱氨酸，120mg L-谷氨酸，50mg L-精氨酸，100mg L-酪氨酸，130mg L-缬氨酸，2.5Kg蔗糖，100mg枸缘酸钠，7.5Kg NaCl，300mg KCl，200mg CaCl₂以及20mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

本发明还提供了所述的培养基在培养BHK-21细胞或BSR细胞中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）BHK-21细胞的培养：采用权利要求1或2所述的培养基对BHK-21细胞进行微载体悬浮培养；

（2）病毒接种与培养：步骤（1）中BHK-21细胞在生物反应器中培养6-7天后，停止搅拌，微载体沉入反应器底部，放出细胞培养液后，加入含有0.15g/L葡萄糖的MEM培养液，搅拌0.5-1.0h，放出洗液，加入口蹄疫病毒液，使每个细胞感染的病毒颗粒达0.1-0.5TCID₅₀，吸附一小时，补加培养液，培养72~96小时，进行收获，同时用0.22μm的膜过滤，4℃保存；

（3）病毒的浓缩和纯化：采用中空纤维柱对病毒液进行澄清、微滤、浓缩后，采用连续流蔗糖密度梯度离心或分子筛层析柱对滤液进行纯化；

（4）病毒的灭活及疫苗的制备。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的BHK-21细胞传代在10个代次内。

在本发明中，优选的，向步骤（1）中所述的培养基中加入Cytodex-3微载体，使微载体的浓度达5~8g/ml。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SAT-1、SAT-2或SAT-3型口蹄疫病毒。

在本发明中，优选的，生物反应器体积在750L以上，搅拌速度为25-45rpm，病毒培养温度为35℃，溶氧20%，pH7.4。

在本发明中，优选的，采用中空纤维柱对病毒液进行50~200倍的超滤浓缩。

进一步的，本发明该提供了由以上任一项所述的方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、采用本发明的一种无血清或无动物源性成分的培养基培养得到的病毒液不含动物血清或成分，排除了疫苗的牛血清杂蛋白在疫苗使用引起的应急反应，也降低了疫苗污染外源因子的风险。

2、后续的多步纯化使疫苗的宿主细胞残余DNA，残余福尔马林，残余宿主蛋白，残余硫柳汞以及残余抗生素等小分子物质或化学物质如PEG\氯仿等降至最低，保证了疫苗和动物的安全性，因而保证动物性食品安全。

3、后续的多步纯化使一剂疫苗的体积变小，活性抗原增加使多价疫苗的制备成为现实。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1口蹄疫病毒液的生产

1、BHK-21细胞的培养

按照以下配方配制无血清或无动物源性成分的培养基（1L）：

380mg L-丙氨酸，90mg L-盐酸精氨酸，280mg L-天冬氨酸，70mg L-盐酸半胱氨酸，120mg L-谷氨酸，50mg L-精氨酸，100mg L-酪氨酸，130mg L-缬氨酸，2.5Kg蔗糖，100mg枸缘酸钠，7.5Kg NaCl，300mg KCl，200mg CaCl₂以及20mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

BHK-21细胞的无血清微载体悬浮培养BHK-21细胞来自ATCC，工作细胞库细胞代次，应不超过主细胞库的10代，BHK-21工作细胞应在10个代次内。本发明的无血清培养基按5~8g/ml加入Cytodex-3微载体，用1.5L的生物反应器37℃培养6-7天，搅拌速度20rpm，再进行消化，转至15L生物反应器，相同条件培养至1000L。

2、病毒的接种与培养

各自不同血清型的口蹄疫病毒株分别培养，1000L工作细胞库细胞经培养6-7天后，停止搅拌，微载体加入反应器底部放出细胞培养液，加入艾氏液的MEM(含0.1%的葡萄糖)，搅拌0.5-1.0h，放出洗液，加入199培养液（含相同浓度双抗），加入500ml工作种子批的毒液，使每个细胞的感染颗粒达0.3-0.5TCID₅₀,吸附一小时，培养温度36℃，培养72~96小时，进行收获，同时用0.22μm的膜过滤，贮存于4℃，分别得到病毒粗制液。

所述的口蹄疫病毒毒株可为O型口蹄疫毒种ONXC/92株（口蹄疫病毒O型-AsiaⅠ型二价灭活疫苗毒种种子批的建立(Ⅰ)，徐春河等，中国畜牧兽医学会口蹄疫学分会第十一次学术研讨会会议论文）、亚洲I型毒种Asia1/JSL/GSZY/06株（口蹄疫O型、Asia I型二价灭活疫苗的研制与应用，黄炯，兽医导刊，2009年06期）、O型口蹄疫毒种OR/80株（猪口蹄疫O型灭活疫苗PD(50)效检攻毒方式探索，郎洪武等，《中国兽药杂志》2004年03期）或O型口蹄疫毒种O/ZK/93-08株（猪口蹄疫O型灭活疫苗OZK/93株与OZK/93株+OS/99株免疫效果对比试验，徐新红等，饲料与畜牧·规模养猪2010,(9)）等。所述的毒种——O型口蹄疫毒种ONXC/92株、亚洲I型毒种Asia1/JSL/GSZY/06株、O型口蹄疫毒种OR/80株或O型口蹄疫毒种O/ZK/93-08株均可购买自兰州兽医研究所。

本领域技术人员应当理解的是，本发明方法适用于任何不同血清型的口蹄疫病毒株的培养，以上所述的毒株只为范例性的，并不对本发明形成任何限定。

本发明中采用O型口蹄疫毒种ONXC/92株作为制备疫苗的病毒株进行了以下研究。

3、病毒液（ONXC/92株病毒液）澄清、微滤、透析、纯化

澄清、微滤、透析：病毒粗制液通过过滤澄清进一步除去细胞碎片以及小部分杂质，可用0.8~1μm的中空纤维柱进行澄清、微滤，超滤/透析口蹄疫病毒液，根据口蹄疫病毒的大小，可选用100KD分子截留值的中空纤维柱，对澄清或微滤的原液进行50-100倍浓缩，也可用中空纤维柱进行透析除去小分子化学物质如PEG或氯仿，透析液含0.4M NaCl。

层析纯化：高倍浓缩溶液置于装Separate6FF层析柱，用pH7.0的磷酸缓冲液平衡，用紫外分光光度计检测洗脱液，260nm波长检查核酸，280nm检测蛋白。采用DEAE阴离子柱纯化，病毒则流出穿过，收集贮存于4℃，得到纯化病毒液（纯化抗原）。

表1纯化疫苗与动物安全和食品安全检验

实施例2纯化口蹄疫病毒的灭活

实施例1制备得到的纯化病毒液及病毒粗制液用0.22μm的膜进行除菌过滤加入1/4000β丙内酯37℃灭活3-4天，贮存于4℃备用。

实施例3疫苗配制

灭活后的纯化灭活液及病毒粗制液用199培养基（pH7.2）稀释分装使含各血清型抗原20μg/头份。配制纯化疫苗与粗制疫苗的比较见表2。

表2纯化口蹄疫疫苗诱导猪的免疫反应

实施例4中和抗体实验

灭活口蹄疫抗原免疫的动物血清，56℃水浴灭活30分钟，加入96孔板，阴性对照血清也加入96孔板，不同倍数稀释后，96孔板振荡1min，在5%CO2 37℃孵化2h，每孔加入用Eagle's MEM（含5%胎牛血清，106/孔BHK-21口蹄疫感染的细胞）稀释的口蹄疫病毒或抗原100μl/孔，在潮湿5%CO₂ 37℃的环境中孵育48h，不引起细胞病变的血清最高50%的最高稀释度则为血清滴度，结果见表3。

表3纯化口蹄疫疫苗诱导的中和抗体

实施例5猪的免疫效力试验

选择SPF猪全部雌性或者雄性，每组4头。每头颈部肌肉注射乳化的疫苗，内含20-25μg实施例1制备得到的口蹄疫纯化抗原，另外2只为对照组注射疫苗稀释液，28天和56天分别注射乳化纯化疫苗。免疫组动物分别在0、42、77天抽血，第二次加强免疫后，所有的猪用0.5ml含10⁵TCID50的流行毒攻击，观察猪口蹄疫的症状14天，包括猪的体温连续3天超过40℃的体温，蹄冠，蹄踵，蹄叉，副蹄和吻突皮肤，口腔，颊部以及舌面，乳头，乳房等部位出现大小不等的水泡和溃疡、跛行。所有猪应无症状，对照组猪死亡。结果如表4和表5所示。

表4纯化口蹄疫疫苗诱导猪的免疫反应

表5纯化口蹄疫疫苗50%保护剂量（猪）

实施例6牛的免疫效力试验

6只牛为免疫组，5只牛颈部皮下免疫纯化疫苗1ml（含有实施例1制备得到纯化抗原10μg），第6只牛颈部皮下免疫2ml（含有实施例1制备得到纯化抗原20μg）。31天后在同一部位皮下免疫，前5只免疫2ml，第6只免疫1ml纯化疫苗，分别在0、6、11、21、31、38、42、52天取血，所有免疫动物和对照组的2只牛仔初免42天采用舌皮下野毒攻击，观察每头牛的体温、舌部、四蹄口蹄疫的症状，检测口蹄疫的中和抗体。所有的免疫牛存活，对照组牛攻击后出现症状、死亡。结果如表6、表7所示。

表6对照组牛攻击后的口蹄疫症状

表7纯化口蹄疫疫苗的保护免疫

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种无血清或无动物源性成分的培养基，其特征在于每升所述的培养基中含有以下成分：350-400mg L-丙氨酸，80-100mg L-盐酸精氨酸，250-300mg L-天冬氨酸，50-90mg L-盐酸半胱氨酸，100-140mg L-谷氨酸，25-75mg L-精氨酸，80-120mgL-酪氨酸，110-150mg L-缬氨酸，2.0-3.0Kg蔗糖，80-120mg枸缘酸钠，7.0-8.0KgNaCl，280-320mg KCl，180-220mg CaCl₂以及15-25mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于每升所述的培养基中含有以下成分：380mg L-丙氨酸，90mg L-盐酸精氨酸，280mg L-天冬氨酸，70mg L-盐酸半胱氨酸，120mg L-谷氨酸，50mg L-精氨酸，100mg L-酪氨酸，130mg L-缬氨酸，2.5Kg蔗糖，100mg枸缘酸钠，7.5Kg NaCl，300mg KCl，200mg CaCl₂以及20mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

3.权利要求1或2所述的培养基在培养BHK-21细胞或BSR细胞中的应用。

4.一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）病毒接种与培养：步骤（1）中BHK-21细胞在生物反应器中培养6-7天后，停止搅拌，微载体沉入反应器底部，放出细胞培养液后，加入含有0.1%葡萄糖的MEM培养液，搅拌0.5-1.0h，放出洗液，加入口蹄疫病毒液，使每个细胞感染的病毒颗粒达0.1-0.5TCID₅₀，吸附一小时，补加培养液，培养72~96小时，进行收获，同时用0.22μm的膜过滤，4℃保存；

（4）病毒的灭活及疫苗的制备。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述的BHK-21细胞传代在10个代次内。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于向步骤（1）中所述的培养基中加入Cytodex-3微载体，使微载体的浓度达5~8g/ml。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述的口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SAT-1、SAT-2或SAT-3型口蹄疫病毒。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于生物反应器体积在750L以上，搅拌速度为25-45rpm，病毒培养温度为35℃，溶氧20%，pH 7.4。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于采用中空纤维柱对病毒液进行50~200倍的超滤浓缩。

10.由权利要求4-9任一项所述的方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。