CN101522209A - Ipv-dpt疫苗 - Google Patents

Ipv-dpt疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN101522209A
CN101522209A CNA2007800362477A CN200780036247A CN101522209A CN 101522209 A CN101522209 A CN 101522209A CN A2007800362477 A CNA2007800362477 A CN A2007800362477A CN 200780036247 A CN200780036247 A CN 200780036247A CN 101522209 A CN101522209 A CN 101522209A
Authority
CN
China
Prior art keywords
poliovirus
cell
strain
guest
husky
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800362477A
Other languages
English (en)
Inventor
安部忍
清水文七
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Japan Poliomyelitis Research Institute
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Poliomyelitis Research Institute, Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Japan Poliomyelitis Research Institute
Priority to CN201510553022.5A priority Critical patent/CN105126095A/zh
Publication of CN101522209A publication Critical patent/CN101522209A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/099—Bordetella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/13—Poliovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供下述混合疫苗的制备方法，该方法包括制备高效价脊髓灰质炎病毒沙宾株的步骤，所述混合疫苗包括灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株、百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素以及破伤风类毒素。混合疫苗的制备方法包括下述步骤：在约4g/L～约6g/L微载体存在下，培养待接种本发明脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞，该方法作为含有灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株的混合疫苗的高效制备方法是很有用的。

Description

IPV-DPT疫苗
技术领域
本发明涉及混合疫苗，尤其是含有灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株(セ—ビン株ポリオウイルス)(sIPV)的混合疫苗以及该混合疫苗的制备方法。
发明背景
脊髓灰质炎是脊髓灰质炎病毒引发的传染病。对于人而言，脊髓灰质炎病毒是经口感染，并在肠道增殖，经血液进入中枢神经系统的。进入中枢神经系统的脊髓灰质炎病毒通过在大型运动神经细胞中增殖，引起运动神经细胞变性、坏死，导致四肢发生急性弛缓性麻痹。此外，脊髓灰质炎病毒侵入延髓的呼吸中枢时，有时因呼吸麻痹而致死。为了抑制引发这些危重症状的脊髓灰质炎的发病，脊髓灰质炎疫苗广为使用。
可使用2种脊髓灰质炎疫苗：口服活脊髓灰质炎疫苗和灭活的脊髓灰质炎疫苗。口服活脊髓灰质炎疫苗是使用脊髓灰质炎病毒的弱毒株(沙宾株)的疫苗。口服给药的脊髓灰质炎病毒弱毒株引发通常的感染。口服活脊髓灰质炎疫苗来源的脊髓灰质炎病毒在人肠道大量增殖，其结果，在肠道局部形成免疫。另外，口服活脊髓灰质炎疫苗来源的脊髓灰质炎病毒进入血液中，通过引发病毒血症促进血中抗体的产生。但是由于脊髓灰质炎病毒弱毒株在中枢神经系统的增殖能力非常弱，通常不引起麻痹。此外，于被接种者的体内，在接种后约4～6周，口服活脊髓灰质炎疫苗来源的脊髓灰质炎病毒增殖，经排泄物排出。该排出的病毒感染被接种者周围对脊髓灰质炎免疫弱或无免疫的人，则与被接种者的情况相同，显示出赋予免疫或增强免疫的效果。
但口服活脊髓灰质炎疫苗来源的脊髓灰质炎病毒弱毒株在被接种者体内反复增殖期间，或在被所述排出的病毒感染的人的体内反复增殖期间，有时发生向强毒性转化的变异。在极少数情况下，该突变株导致疫苗相关的麻痹。
灭活的脊髓灰质炎疫苗是将脊髓灰质炎病毒经福尔马林灭活，失去感染力的疫苗。由于灭活的脊髓灰质炎疫苗不在被接种者体内增殖、不感染被接种者周围的人，不会导致疫苗相关的麻痹。制备灭活的脊髓灰质炎疫苗时，以往使用强毒株，近年来逐渐开发了弱毒株(沙宾株)(Biologicals 34(2006)151-154，Dev Bil.Basel.Karger，2001，vol.105，pp163-169，临床和病毒Vol.30No.5(2002.12)336-343)。认为存在下述缺点：弱毒株(沙宾株)的增殖性稍弱于强毒株的增殖性。
含有百日咳菌的保护性抗原(防御抗原)、白喉类毒素(ジフテリアトキソイド)、以及破伤风类毒素(破傷風トキソイド)的疫苗作为百日咳白喉破伤风混合疫苗而广泛使用。
已知由无细胞性百日咳疫苗、白喉类毒素、破伤风类毒素以及灭活的脊髓灰质炎病毒构成的多价疫苗(特表2000-504032号公报)。
Vero细胞是绿猴肾脏来源的传代细胞，对各种病毒具有宽范围的敏感性，广泛用于病毒培养。文献公开了培养肠道病毒71疫苗的制备方法，该方法包括在微载体(マイクロキヤリア—)上培养Vero细胞，用所培养的Vero细胞使培养肠道病毒71增殖(Optimization of microcarrier cell culture processfor the inactivated enterovirus type 71 vaccine development：Suh-Chin Wu，etc.，Vaccine，22，3858-3864，2004)。文献还公开了使用微载体的通常的细胞培养条件(Microcarrier cell culture principles & methods：Pharmacia LKB，Biotechnology，1988)。
发明内容
在上述情况下，期望一种包括制备高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株的步骤，制备含有灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株(sIPV)和百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素(DPT)的混合疫苗的方法。
为了解决上述问题，本发明者们经过潜心研究，结果发现通过在约4g/L～约6g/L的微载体存在下，培养待接种脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞，可以制备高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株。基于这些发现，进行了反复研究，结果完成了本发明。
即，本发明提供：
(1)一种混合疫苗的制备方法，所述混合疫苗含有
(A)灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株、
(B)百日咳菌的保护性抗原、
(C)白喉类毒素、以及
(D)破伤风类毒素，
该方法包括下述步骤：
(a)在约4g/L～约6g/L的微载体存在下，培养待接种脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞。
(2)上述(1)所述的方法，其还包括下述步骤：
(b)使脊髓灰质炎病毒沙宾株感染所述Vero细胞的步骤，
(c)使该脊髓灰质炎病毒增殖的步骤，
(d)回收含有该脊髓灰质炎病毒的病毒液的步骤，以及
(e)灭活该脊髓灰质炎病毒的步骤。
(3)上述(1)所述的方法，其中，所述微载体的浓度为约5g/L。
(4)上述(1)所述的方法，其中，所述微载体为葡聚糖制微载体。
(5)上述(1)所述的方法，其中，使Vero细胞增殖的步骤(步骤(a))以约3L以上的规模进行。
(6)上述(1)所述的方法，其中，使Vero细胞增殖的步骤(步骤(a))以约30L以上的规模进行。
(7)上述(2)所述的方法还包括(d-2)将所述病毒液进行纯化的步骤。
(8)上述(7)所述的方法，其中，所述纯化步骤(步骤(d-2))包括下述步骤：
(i)将经所述步骤(d)回收的病毒液通过超离心进行沉淀(ペレツト)化、
(ii)将该沉淀的重悬液进行超声波处理、
(iii)经柱色谱纯化。
(9)上述(8)所述的方法，其中，所述(iii)经柱色谱纯化的步骤只进行1次。
(10)以上述(1)所述方法制备的疫苗。
(11)上述(1)所述的方法，其中，培养Vero细胞的步骤(步骤(a))以约3L以上的规模进行。
(12)上述(1)所述的方法，其中，培养Vero细胞的步骤(步骤(a))以约30L以上的规模进行。
通过在约4g/L～约6g/L的微载体存在下，培养待接种脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞，可以得到高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株。通过使用高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株，可以高效地制备灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株。于是，包括下述步骤的混合疫苗的制备方法(本发明的制备方法)作为制备含有灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株的混合疫苗的高效制备方法是很有用的，所述步骤为在约4g/L～约6g/L的微载体存在下，培养待接种脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞。
附图说明
图1表示经微载体法培养Vero细胞时，Vero细胞的增殖曲线图。3L表示初始细胞数约为2 x 105细胞/mL(低浓度)，和3g/L的微载体。3H表示初始细胞数约为10 x 105细胞/mL(高浓度)，和3g/L的微载体。5L表示初始细胞数约为2 x 105细胞/mL(低浓度)，和5g/L的微载体。5H表示初始细胞数约为10 x 105细胞/mL(高浓度)，和5g/L的微载体。
图2为表示用在各种条件下培养的Vero细胞得到的I型脊髓灰质炎病毒的感染滴度(感染価)(病毒效价)的图。3L表示初始细胞数约为2 x 105细胞/mL(低浓度)，用3g/L的微载体培养的Vero细胞得到的I型脊髓灰质炎病毒。5L表示初始细胞数约2 x 105细胞/mL(低浓度)，用5g/L的微载体培养的Vero细胞得到的I型脊髓灰质炎病毒。5H表示初始细胞数约10 x 105细胞/mL(高浓度)，用5g/L的微载体培养的Vero细胞得到的I型脊髓灰质炎病毒。Ref.表示用绿猴肾脏细胞增殖的I型脊髓灰质炎病毒。
本发明提供下述混合疫苗的制备方法，该方法包括可制备高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株的步骤，所述混合疫苗包含灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株(sIPV)和百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素(DPT)。
以下，对本发明进行详细说明。
1.灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株
(1)脊髓灰质炎病毒沙宾株
在本说明书中，脊髓灰质炎病毒沙宾株是指来源于艾伯特B.沙宾博士(Dr.Albert B.Sabin)分离的脊髓灰质炎病毒的弱毒株的脊髓灰质炎病毒株(参照Sabin AB，Boulger LR.History of Sabin attenuated poliovirus oral livevaccine strains.J.Biol.Standard 1973，1，115-118等)。
脊髓灰质炎病毒沙宾株中包括脊髓灰质炎病毒沙宾I型株、脊髓灰质炎病毒沙宾II型株以及脊髓灰质炎病毒沙宾III型株。作为脊髓灰质炎病毒沙宾I型株，可以列举，LSc、2ab株等。作为脊髓灰质炎病毒沙宾II型株，可以列举，P712、Ch、2ab株等。作为脊髓灰质炎病毒沙宾III型株，可以列举，Leon，12a1b株等。
(2)灭活
在本说明书中，病毒的“灭活”是指使病毒失去感染能力。作为灭活的方法，可以列举，使用物理方法(例如，使用X射线照射、热、超声波等的方法)、化学方法(例如，使用福尔马林、汞、乙醇、氯等的方法)等，但并不限于这些方法。
脊髓灰质炎病毒的灭活可用公知的方法进行(例如，参照Biologicals 34(2006)151-154等)。具体来讲，例如，可通过将脊髓灰质炎病毒用福尔马林处理进行灭活。
(3)灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株的免疫原性
灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株中通常混合存在被称为D抗原以及C抗原的2种病毒抗原。D抗原为完全病毒粒子。D抗原对应的抗体具有中和活病毒的感染性的能力，作为保护性抗体(防御抗体)发挥作用。C抗原被称为缺损粒子，是完整病毒粒子缺失核心核酸RNA和部分病毒蛋白的粒子，是中空状粒子。C抗原对应的抗体无中和活病毒的感染性的能力，即使有该能力也是非常低的。因此，将灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株作为疫苗使用时，D抗原是必要的。
脊髓灰质炎病毒包括I型、II型、III型3种类型。对感染脊髓灰质炎病毒的免疫，对于I型、II型、III型3种病毒型是特异的，即使存在型间交差免疫也很微弱。I型、II型以及III型灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株的D抗原具有可产生下述中和抗体的免疫原性，所述中和抗体为分别对应于脊髓灰质炎病毒的I型、II型以及III型野生株(强毒株)的中和抗体。灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株的D抗原对I型、II型以及III型分别具有不同的免疫原性，为了产生足够的抗体用于中和脊髓灰质炎病毒的I型、II型以及III型的野生株(强毒株)，所必需的D抗原量因病毒型而异。
如上所述，脊髓灰质炎病毒包括I型、II型、III型3种类型，无论哪种类型都引发相同的脊髓灰质炎。因此，将灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株作为疫苗(灭活的脊髓灰质炎疫苗)使用时，必需具有可产生足够中和I型、II型以及III型各野生株(强毒株)的脊髓灰质炎病毒抗体的免疫原性，此外，优选与以往使用的强毒株来源的灭活脊髓灰质炎疫苗的免疫原性接近的免疫原性。为了表现出该免疫原性，以D抗原量计，优选疫苗含有I型、II型以及III型灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株的比例为2～4:80～120:80～120，特别优选约3:约100:约100的比例。由于按照上述特定比例含有I型、II型以及III型，本发明使用的灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株表现出与强毒株来源的灭活脊髓灰质炎疫苗(例如，Salk(ソ—ク)疫苗)相同的免疫原性。
2.灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株的制备
本发明所用灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株可通过下述方法制备。
首先，在约4g/L～约6g/L微载体存在下，培养Vero细胞，得到脊髓灰质炎病毒培养用细胞。在所得脊髓灰质炎病毒培养用细胞中接种种病毒(脊髓灰质炎病毒沙宾株)，通过培养病毒得到增殖的脊髓灰质炎病毒沙宾株。将所得脊髓灰质炎病毒沙宾株灭活，得到灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株。通过使用的种病毒(沙宾I型株、沙宾II型株或沙宾III型株)，可以得到相应的灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株。在病毒灭活前或后，可将病毒浓缩以及/或纯化。
如上所述，在灭活的脊髓灰质炎疫苗中，必需具有可产生足够中和I型、II型以及III型各野生株(强毒株)的抗体的免疫原性。但是，灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株的D抗原对I型、II型以及III型分别具有不同的免疫原性。于是，关于具有可产生足够中和I型、II型以及III型各野生株(强毒株)抗体的免疫原性的灭活脊髓灰质炎疫苗，可通过调节含有的I型、II型以及III型灭活脊髓灰质炎病毒的量而得到。
(Vero细胞)
Vero细胞是绿猴(Cercopithecus aethiops)肾脏来源的传代细胞，在ATCC(American Type Culture Collection)进行了登记。Vero细胞表现出成纤维细胞样的细胞形态，对各种病毒具有广范围敏感性，由于易于传代培养和维持，在病毒培养中被广泛使用。作为已知的可由ATCC获得的Vero细胞，可以列举，ATCC号CCL-81、CRL-1587等。
(微载体)
在本说明书中，“微载体”是指使细胞附着在表面，可在液体培养基中以混悬状态进行细胞培养的载体。只要是使细胞附着在表面，可在液体培养基中以混悬状态进行细胞培养的载体即可，对材质、形状、大小等没有特别限制。
作为微载体的材质，可以列举，葡聚糖(デキストラン)、明胶、胶原、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、纤维素等。作为微载体的材质，优选葡聚糖。
作为微载体的形状，可以列举，球状(珠状)、圆盘状等。微载体的形状优选为球状。
球状微载体的大小例如为约0.01～1mm，优选为约0.05～0.5mm，更优选为约0.1～0.3mm。
微载体可以是多孔性的。
作为本发明使用的球状微载体，可以列举，Cytodex1(商品名)、Cytodex3(商品名)、Cytopore(商品名)(以上为GE Health Biosciences公司制)等。作为圆盘状微载体，可以列举，Cytoline 1(商品名)、Cytoline 2(商品名)(以上为GE Health Biosciences公司制)等。作为多孔性微载体，可以列举，Cytopore(商品名)、Cytoline 1(商品名)、Cytoline 2(商品名)(以上为GE HealthBiosciences公司制)等。作为本发明使用的微载体，特别优选球状葡聚糖制微载体。作为球状葡聚糖制微载体，优选Cytodex 1(商品名)、Cytodex 3(商品名)以及Cytopore(商品名)，更优选Cytodex 1(商品名)以及Cytodex 3(商品名)，特别优选Cytodex 1(商品名)。
(Vero细胞的培养)
在本发明中，通过在约4g/L～约6g/L的微载体存在下，培养Vero细胞，进行增殖。微载体浓度优选为约4.5g/L～约5.5g/L，更优选为约5g/L。
关于上述使Vero细胞增殖的步骤，作为液体量，优选以3L以上的规模进行，更优选30L以上，特别优选150L以上。此外，使Vero细胞增殖的步骤通常以1000L以下的规模进行。
在微载体存在下，培养Vero细胞时，作为培养基，可以使用含有约5～20vol％的小牛血清或胎牛血清的ME培养基〔Science，122卷，501(1952)〕、DME培养基〔Virology，8卷，396(1959)〕、RPMI 1640培养基〔The Journalofthe American Medical Association 199卷，519(1967)〕、199培养基〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73卷，1(1950)〕等。作为培养基，优选DME培养基，更优选含有小牛血清的DME培养基，特别优选含有约5vol％小牛血清的DME培养基。在细胞培养期间，根据需要交换培养基。优选pH为约6～8，更优选pH为约6.5～7.5，特别优选pH为约7。培养通常在约35℃～40℃进行约5～9日，根据需要进行通气、搅拌。细胞培养时的溶氧浓度(DO)优选为约60～90％，更优选为约70～80％，特别优选为约75％。
开始在微载体存在下的培养时，培养基中Vero细胞的细胞数(初始细胞数)可根据培养基、微载体的种类、培养规模等进行适当设定。优选初始细胞数为2×104个/mL～10×105个/mL，特别优选2×105个/mL～10×105个/mL。
(脊髓灰质炎病毒的培养)
关于脊髓灰质炎病毒的培养，可通过下述方法进行：在Vero细胞的培养细胞中接种脊髓灰质炎病毒沙宾株(种病毒)，使之感染，在细胞内培养脊髓灰质炎病毒。感染细胞的培养可按照与上述Vero细胞培养相同的方法进行。作为培养脊髓灰质炎病毒使用的培养基，优选199培养基，更优选添加了碳酸氢钠的199培养基，特别优选添加了0.3w/v％碳酸钠的199培养基。
病毒培养时的培养温度优选为约30℃～38℃，更优选为约32℃～36℃，特别优选为约33℃～35℃。病毒培养时间优选为约1～5日，更优选为约2～4日，特别优选为约3日。而且，病毒培养可以以脊髓灰质炎病毒所致细胞变性效果(脊髓灰质炎病毒感染细胞引起细胞的圆形化，从微载体脱离)为指标，使之结束。
作为种病毒，可以使用预先用绿猴原代肾培养细胞培养的脊髓灰质炎病毒沙宾株。
(含有脊髓灰质炎病毒的病毒液的回收)
病毒培养结束后，除去微载体，回收含有脊髓灰质炎病毒的病毒液(有时称为脊髓灰质炎病毒液。)。
关于微载体的除去，例如可用特氟龙筛(例如、孔径120μm)等进行。由于筛上残留的微载体中残存(附着)有脊髓灰质炎病毒，可用病毒培养液等清洗，回收脊髓灰质炎病毒。
可用滤膜(例如0.2μm的滤膜)等过滤所得脊髓灰质炎病毒液，除去细胞屑。
可在灭活前或后，浓缩以及/或纯化脊髓灰质炎病毒液。
作为浓缩方法，可以列举，超滤法、超离心法、透析法等。作为浓缩方法，优选超滤法、超离心法，更优选超滤法和超离心法，进一步优选在进行超滤法后，进行超离心法。
作为超滤法中使用的超滤膜，可使用病毒浓缩时通常使用的超滤膜。作为超滤膜的分级分子量(分画分子量)，优选100kDa左右。作为超滤膜的材质，优选聚醚砜等。
关于通过超离心法浓缩脊髓灰质炎病毒，例如，可通过将脊髓灰质炎病毒液在4℃，以100,000g超离心4小时形成沉淀(pellet)来进行。所述沉淀可重悬于磷酸缓冲液等中。通过将沉淀的重悬液进行超声波处理，可粉碎凝集块。超声波处理可使用市售装置例如INSONATOR MODEL 200M(クボタ)等进行。关于超声波处理的条件，只要为可使凝集块散开的程度即可，可根据用于超声波处理的容器、超声波输出功率、重悬液的浓度等进行适当设定。作为超声波处理的条件，可以列举，在200W进行3～10分钟的超声波处理等。即使进行该超声波处理，脊髓灰质炎病毒沙宾株也不会失去免疫原性，可作为脊髓灰质炎病毒疫苗使用。
作为纯化方法，可以列举，利用纯化对象物的大小、密度、沉降系数等物理性质的方法、利用化学或物理化学反应(吸附和解吸等)的方法等，没有特别限制。作为纯化方法，可以更具体地列举，密度梯度离心法、过滤(包括超滤)、离子交换柱色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、盐析法等。作为纯化方法，优选柱色谱法，更优选离子交换柱色谱法，特别优选DEAE-离子交换柱色谱法。关于进行柱色谱的纯化次数，只要进行至达到必要的纯度即可，没有特别限制，从生产效率等角度考虑，优选以最小限度的步骤进行。
作为浓缩以及纯化，优选通过将脊髓灰质炎病毒液经超离心实现的沉淀化、对该沉淀的重悬液的超声波处理、以及柱色谱纯化而进行。从生产效率等角度考虑，经柱色谱的纯化优选只进行1次。通过将脊髓灰质炎病毒液通过超离心实现的沉淀化、对该沉淀的重悬液进行超声波处理以及只进行1次的经柱色谱的纯化，可以高效且充分地浓缩以及纯化脊髓灰质炎病毒液。
(脊髓灰质炎病毒的灭活)
脊髓灰质炎病毒的灭活可通过通常使用的方法进行。更具体地说，例如，向脊髓灰质炎病毒液中添加灭活剂，通过使脊髓灰质炎病毒与灭活剂反应，可以灭活脊髓灰质炎病毒。作为灭活剂，优选福尔马林。关于灭活条件，只要脊髓灰质炎病毒被灭活即可，没有特别限制。为了避免残留有灭活不充分的脊髓灰质炎病毒，灭活处理的时间通常为已确认脊髓灰质炎病毒灭活的时间的约2～4倍，优选为约2.5～3.5倍，更优选为约3倍。
例如，使用福尔马林作为灭活剂时，其添加量优选为约0.001w/v％～0.1w/v％，更优选为约0.005w/v％～0.05w/v％，特别优选为约0.01w/v％。灭活温度特别优选为约37℃。灭活时间因灭活剂的种类、灭活剂的浓度、灭活温度等而异。例如，使用约0.01w/v％的福尔马林作为灭活剂，当灭活温度为约37℃时，灭活时间优选为约8日～16日，更优选为约10日～14日，特别优选为约12日。使用约0.01w/v％的福尔马林，灭活温度为约37℃时，通常至第4日脊髓灰质炎病毒沙宾株被灭活。
3.百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素(DPT)
本发明使用的百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素没有特别限制。
关于百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素，作为百日咳白喉破伤风混合疫苗，可购得市售品(例如、武田药品工业株式会社制、阪大微生物病研究会制、化学及血清疗法研究所制等)。此外，百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素可通过公知的方法获得。具体来讲，百日咳菌的保护性抗原例如可通过下述操作得到：通过将百日咳菌I相菌(东浜株)的培养液用硫酸铵分级分离法(分画法)/蔗糖密度梯度离心分级分离法等物理化学方法而萃取、分离、纯化感染保护性抗原级分后，用福尔马林减弱残存的毒性。白喉类毒可通过下述例如操作得到：将白喉菌(Park-Williams No.8株)产生的毒素用柱色谱法等物理化学方法纯化浓缩后，用福尔马林进行无毒化。破伤风类毒素可通过下述例如操作得到：将破伤风菌(Harvard株)产生的毒素用柱色谱法等物理化学方法纯化浓缩后，用福尔马林进行无毒化。
百日咳菌的保护性抗原包括百日咳毒素(PT抗原)、纤维状红细胞凝集素(FHA抗原)、外膜蛋白(69KD抗原)、菌毛(線毛)(也称为FB抗原、凝集原(FGG))。作为百日咳菌的保护性抗原，不必须含有全部的上述各抗原，可含有这些抗原中的1种以上、优选2种以上、更优选3种以上。针对所述保护性抗原的抗体保护宿主不受百日咳的感染。
4.混合疫苗
本发明的混合疫苗含有灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株、百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素。百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素，如上所述，作为百日咳白喉破伤风混合疫苗，可购得市售品。因此，本发明的混合疫苗可通过混合灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株和百日咳白喉破伤风混合疫苗而制得。
灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株可通过混合灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾I型株、灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾II型株、以及灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾III型株而制得。如上所述，以D抗原量计，优选灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株含有I型、II型以及III型灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株的比例为2～4:80～120:80～120，特别优选为约3:约100:约100。
在本发明的混合疫苗中，百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素的含量只要是可预防百日咳、白喉以及破伤风的有效量即可。更具体地讲，所述百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素的含量可以与上述可作为市售品购得的百日咳白喉破伤风混合疫苗中的含量相同。而且，灭活脊髓灰质炎病毒沙宾株以外的其它成分对百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素或/以及破伤风类毒素的免疫原性有影响时，通过适当调节百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素的含量，可以制备有效预防各疾患的混合疫苗。
本发明的混合疫苗可按照常规方法制备、使用。具体来讲，可按照以下所述方法制备、使用。
本发明的混合疫苗可按照常规方法进行制剂化，制成注射剂。注射剂可按照本身已知的方法进行制备，例如，将上述物质溶解于注射剂中通常使用的无菌的水性或油性溶液中，通过混悬或乳化进行制备。作为注射用水性溶液，例如，可以使用生理盐水、含有葡萄糖或其它佐剂的等渗液等。通常将制备的注射液充填到适当的安瓿、注射器等中。
根据需要，本发明的混合疫苗可含有防腐剂、抗氧化剂、螯合剂等制剂添加剂。作为防腐剂，可以列举，硫柳汞、2-苯氧基乙醇等。作为螯合剂，可以列举，乙二胺四乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(グリコ—ルエ—テルジアミン四酢酸)等。
本发明的混合疫苗还可进一步含有佐剂。作为佐剂，可以列举，氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝等。
本发明的混合疫苗还可含有除灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株、百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素、以及破伤风类毒素以外的免疫原性成分。作为这些免疫原性成分，可以列举，除脊髓灰质炎病毒、百日咳菌、白喉菌以及破伤风菌以外的病毒或菌的免疫原性成分。作为免疫原性成分，可以列举，类毒素、弱毒化病毒、灭活的病毒、蛋白质、肽、多糖、脂多糖、脂肽、或这些的组合等。作为除脊髓灰质炎病毒、百日咳菌、白喉菌以及破伤风菌以外的病毒或菌，可以列举，流行性感冒病毒、麻疹病毒、耳下腺炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、水痘病毒、狂犬病病毒、人免疫不全病毒、肝炎病毒、肺炎双球菌、脑膜炎菌、伤寒菌、流行性感冒b菌等。
本发明的混合疫苗可经例如皮下注射或肌肉注射非经口的施用，优选经皮下注射。
可根据给药对象的年龄、体重等各种条件，对本发明混合疫苗1次的给药量进行适当选择。具体来讲，例如，可含有4国际单位以上的百日咳菌的保护性抗原、约15Lf的白喉类毒素、约2.5Lf的破伤风类毒素、约2～4单位(优选为约3单位)的灭活的沙宾I型脊髓灰质炎病毒(作为D抗原)、约80～120单位(优选为约100单位)的灭活的沙宾II型脊髓灰质炎病毒(作为D抗原)、约80～120单位(优选为约100单位)的灭活的沙宾III型脊髓灰质炎病毒(作为D抗原)。
关于本发明混合疫苗的给药次数，例如，作为初次免疫，以3～8周为间隔，可给药2～3次。作为初次免疫，优选在给药本发明混合疫苗2次的情况下，间隔3～8周再给药1次百日咳白喉破伤风混合疫苗(DPT疫苗)。作为追加免疫，在初次免疫后，间隔6个月以上(例如，在初次免疫结束后12个月至18个月期间)，可再给药1次。
实施例
下面，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
参考例1(脊髓灰质炎疫苗病毒制造用保存细胞库的建立)
由从ATCC获得的Vero细胞，按如下方法制作了疫苗病毒制造用的保存细胞库。
(i)原始细胞库(MCB：Master Cell Bank)的调制
融化从ATCC获得的装在安瓿中的冻存细胞(CCL 81 Vero，F-6573、传代数：124代)，将其移入空的4盎司瓶(容量154mL、细胞增殖面积为54cm2的培养瓶)。向装有细胞的4盎司瓶中滴加细胞增殖液(添加了5vol％小牛血清、0.075％碳酸氢钠、20μg/mL琥乙红霉素、100μg/mL卡那霉素(最终浓度)的DME(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、SIGMA(シグマ)、商品号D5523)，经约5分钟加入了15mL。将装有细胞和细胞增殖液的瓶子在36℃静置培养(1只4盎司瓶、125代)。第二天早上用新鲜的15mL细胞增殖液更换，再于36℃进行静置培养。静置培养开始后的第6天进行了传代(从1只4盎司瓶到4只4盎司瓶、126代)。传代方法按以下的方法进行。
传代方法
(1)弃掉培养液。
(2)在4盎司瓶中加入传代用0.25％胰岛素液5mL。
(3)浸润细胞表面约1分钟，然后弃掉传代用0.25％胰岛素液。
(4)将4盎司瓶在36℃静置，等待细胞从玻璃表面剥离。
(5)细胞出现剥离后，加入5mL细胞增殖液，用吸管吹打将全部细胞剥离。
(6)进一步用吸管吹打使细胞均匀悬浮，然后将细胞增殖液移入离心管。
(7)600rpm、离心5分钟，弃上清，将作为沉淀的细胞用吸管吹打从而均匀重悬在约8mL的新鲜的细胞增殖液中。
(8)在新的4只4盎司瓶(每只装入新鲜的细胞增殖液13mL)的每1只中加入2mL的细胞混悬液。
(9)将4只4盎司瓶在36℃静置，进行细胞培养。
传代用0.25％胰岛素液的组成如下。
5％胰岛素*1 50mL/L
5％聚乙烯基吡咯烷酮(90K) 20mL/L
0.247mol依地酸钠*2 56mL/L
EK*3 2mL/L
胰岛素稀释液*4 872mL/L
*1：使用猪胰脏来源的1:300活性的胰岛素。
*2：0.247mol依地酸钠的组成如下。
依地酸钠-2Na·2H2O 91.95g/L
NaOH 9.88g/L
*3：EK的组成如下。
乳糖酸红霉素 10,000μg/mL
硫酸卡那霉素 50,000μg/mL
*4：胰岛素稀释液的组成如下。
NaCl 8,000mg/L
KCl 400mg/L
Na2HPO4·12H2O 150mg/L
KH2PO4 60mg/L
以下，按相同的方法(因培养面积比在1次传代中为约3～4倍，所以培养瓶以及取液体量有所不同)每隔3～6日进行传代，制备了129代的细胞(每传代1次，传代数增加1)。在33只SR瓶(Small Roux瓶：容量727mL、细胞增殖面积156cm2的培养瓶)中，对培养的129代的细胞像传代时那样进行胰岛素处理，离心，将沉淀以约1.5×107个/mL重悬在冻存培养基(添加了10％DMSO(二甲亚砜)、10vol％小牛血清、0.075％碳酸氢钠、20μg/mL琥乙红霉素、100μg/mL卡那霉素(最终浓度)的DME(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium、SIGMA、商品号D5523))中。向安瓿中分注上述细胞混悬液1mL，以缓慢地冷却速度(约1分降低1℃)将温度降为-32℃后，移入液氮中保存。将上述这样得到的129代的细胞作为原始细胞库(MCB)使用。
(ii)制造用保存细胞库(MWCB：Manufacture’s Working Cell Bank)的调制
使用如上述(i)调制并保存的原始细胞库(MCB)，按与上述(i)的原始细胞库(MCB)的调制方法基本完全相同的方法，从融化安瓿中的细胞开始，通过细胞的传代进行增殖直至134代(因初始细胞数多，故取液体量、培养瓶种类和数量有不同)。前述的134代的细胞也像原始细胞库(MCB)那样在液氮中保存。将像上述那样得到的134代的细胞作为制造用保存细胞库(MWCB)使用。
实施例1(脊髓灰质炎疫苗病毒制造用细胞的制备)
(i)静置培养步骤
将上述参考例1中制备并保存的制造用保存细胞库(MWCB)的1个安瓿(134代的细胞)，用与制备上述参考例1的原始细胞库(MCB)及制造用保存细胞库(MWCB)时相同的方法进行解冻，将细胞用LR瓶(Large Roux瓶，容量约1540mL、细胞增殖面积约274cm2的培养瓶)(×3只)静置培养7天(135代)。静置培养开始后的第7天进行传代，将培养规模扩大至18只LR瓶(136)，并进行静置培养。静置培养及其传代按与上述参考例1的原始细胞库(MCB)的调制及制造用保存细胞库(MWCB)的制备相同的方法进行。
接下来，用40室细胞工厂(40段セルファクトリ—)(Nunc(ヌンク)、商品号139446)的静置培养7天(137代)。在静置培养开始后的第7天进行传代，再用40段细胞工厂4台静置培养7天(138代)。
(ii)微载体培养步骤
接下来，将上述(i)的静置培养步骤中得到的138代的细胞像上述(i)的传代时那样进行胰岛素处理，离心，将作为沉淀的细胞用吸管吹打均匀悬浮在1,000mL的微载体培养用细胞增殖液(添加了5vol％小牛血清(Thermo Trace公司制)、0.11％碳酸氢钠、0.1％果糖、20μg/mL琥乙红霉素、100μg/mL卡那霉素(最终浓度)的DME(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium、SIGMA、商品号D5523))中。将细胞混悬液与预先用PBS(磷酸缓冲盐水)膨润的、用微载体培养用细胞增殖液平衡化的微载体(Cytodex 1(商品名)、GE HealthcareBiosciences公司)相混合(所使用的Cytodex 1(商品名)膨润前的重量为5g/L)，用3台50L容量培养器于37℃、pH7.15在搅拌下进行培养。从培养的第2天开始，持续性地每1天将细胞增殖液的一半量更换为新鲜的细胞增殖液。将培养7天的细胞作为脊髓灰质炎疫苗病毒制造用细胞(139代)使用。
实施例2(灭活的脊髓灰质炎疫苗I型的制备)
(i)病毒培养步骤
对于实施例1得到的脊髓灰质炎疫苗病毒制造用细胞(139代)，在即将接种种病毒之前停止搅拌，使细胞沉淀，用添加了0.075％碳酸氢钠、20μg/mL琥乙红霉素、100μg/mL卡那霉素(最终浓度)的EBSS(Earl′s Balanced SaltSolution)清洗1次。除去与微载体一起收集的5mL细胞培养液的上清后，添加0.25％胰岛素液使其重新为5mL，将细胞从小珠上剥下并使之悬浮，测定细胞数，推测50L容量培养器中的总细胞数。接种弱毒沙宾株(Sabin株)的I型(LSc，2ab株)的种病毒，浓度是相对每个细胞为约10-3CCID50。种病毒接种后，立即向培养器中注入病毒培养液(添加0.3％碳酸氢钠、20μg/mL琥乙红霉素、100μg/mL卡那霉素(最终浓度)的M199(Medium 199))50L。而且，使用的种病毒是预先用美洲绿猴原代肾培养细胞在约33.3℃进行培养后、分装成小份在-70℃下冻存的种病毒。
病毒培养在34℃±1℃下进行3天。以脊髓灰质炎病毒引起的细胞变性效果(脊髓灰质炎病毒感染细胞发生细胞的圆形化，其后从微载体脱离)为指标，在95～100％的细胞从微载体脱离时结束病毒培养。病毒培养结束后，通过特氟龙筛(孔径120μm)除去微载体，回收了病毒混悬液。对于残留在筛网上的微载体，每1台50L容量培养器用约3L的病毒培养液清洗一次。将该清洗液加到回收的病毒混悬液中，以此作为“I型脊髓灰质炎病毒液”。
(ii)病毒浓缩·纯化步骤
将上述(i)得到的I型脊髓灰质炎病毒液约150L用0.2μm的滤膜(Pall，SLK7002NRP)过滤，除去细胞碎屑。将滤液用超滤膜(沙多利斯、PESU(聚醚砜)100kDa、0.1m2、3051466801E--SG)浓缩至1.2L。对于浓缩的病毒液，在6℃、100,000g、超离心4小时使其沉淀化，并重悬于PB(磷酸盐缓冲液，0.1mol/L)中(1只离心管(约100mL)的沉淀重悬于5mL的PB)。将沉淀的重悬液于4℃振荡一夜后，以200W进行8分钟超声波处理(Kubota、INSONATORMODEL 200M)，使凝集块分散。然后，15,000rpm、离心30分钟后取上清。将所得上清用DEAE Sepharose CL-6B(商品名、GE Healthcare Biosciences公司、GE 17-0710-05)纯化。使用PB(磷酸盐缓冲液，0.1mol/L)作为洗脱液。监测280nm处的吸光度，回收最初的峰，以此作为“纯化I型脊髓灰质炎病毒液”。对于采集的峰，通过计算260/280nm吸光度的值，确认了该值为1.5以上(脊髓灰质炎病毒完整粒子的260/280nm为1.6～1.7)。
(iii)灭活步骤
将上述(ii)得到的纯化I型脊髓灰质炎病毒液用灭活前稀释液(添加5％氨基乙酸(最终浓度)的不含Ca、Mg、酚红、碳酸氢钠的M199)稀释约10倍，用0.2μm的滤膜(Pall、SLK7002NRP)过滤，除去病毒凝集块。制备滤液后，迅速开始灭活，以防止病毒再次凝集。灭活开始1小时前，将滤液与1:200稀释的福尔马林分别在37℃加热备用。在对滤液进行充分搅拌的条件下，向其中加入福尔马林使得最终浓度为1:4,000，加温至37℃开始灭活。在福尔马林处理中，每天上午和下午搅拌液体共2次，均匀地进行病毒的灭活。推测存在灭活不充分的病毒附着在容器的栓或容器的某个特定位置的情况，在灭活开始第2、4天更换栓，在第6天更换容器。此外，考虑到灭活步骤中病毒发生凝集的可能性，在灭活的第6天用0.2μm的滤膜(Pall、SLK7002NRP)进行了过滤。福尔马林处理步骤在12天结束。在第12天，用亚硫酸钠(添加浓度为0.0264mol/L)中和福尔马林处理病毒液中的游离福尔马林，然后，添加依地酸钠(0.0009mol/L)作为稳定剂，以此作为“灭活脊髓灰质炎疫苗I型”的原液。
(iv)D抗原量的测定通过间接ELISA法进行，该方法使用了对类型(type)和D抗原特异性高的抗体。间接ELISA法是这样进行的：首先，将作为第1抗体的与被检抗原同型的D抗原特异性单克隆抗体(小鼠来源)包被在微板上。然后，加载稀释后的被检抗原。然后，加载作为第2抗体的与被检抗原同型的兔多克隆抗体，再加载HRPO标记抗兔IgG抗体进行反应。反应后，使用邻苯二胺溶液进行显色，然后，测定492nm的吸光度。通过采用平行线定量法比较被检抗体的吸光度测定值与对照抗原的测定值，求出被检抗原的D抗原量。
实施例3(灭活脊髓灰质炎疫苗II型的制备)
按照与实施例2相同的方法制备了“灭活脊髓灰质炎疫苗II型”的原液，除了用弱毒Sabin株II型(P712，Ch，2ab株)替代弱毒Sabin株I型(LSc，2ab株)作为种病毒。
实施例4(灭活脊髓灰质炎疫苗III型的制备)
按照与实施例2相同的方法制备了“灭活脊髓灰质炎疫苗III型”的原液，除了使用弱毒Sabin株III型(Leon，12a1b株)替代弱毒Sabin株I型(LSc，2ab株)作为种病毒。
实施例5(百日咳菌保护性抗原的制备)
(1)百日咳菌的培养
将百日咳菌I相菌(东浜株)用Cohen-Wheeler培养基于30～34℃在搅拌下培养20～24小时。将用Cohen-Wheeler培养基培养出的百日咳菌用ステイナ—ショルト培养基于30～34℃继续培养48～68小时。
采用超滤法将培养液浓缩至1/10量，采用离心分离将上清液和菌体分离。
(2)百日咳毒素的制备
向上述(1)得到的上清液中加入占1/10量的1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，再添加25w/v％乙酸钙溶液使其为0.1～2.0w/v％，经过滤得到含百日咳毒素(感染保护性抗原)的滤液。采用SP柱色谱法(平衡化溶液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0))将滤液过柱，用0.415mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱吸附的百日咳毒素，分级分离出含百日咳毒素的液体。然后，采用凝胶柱色谱法(平衡化溶液：添加了0.25mol/L氯化钠的0.025mol/L磷酸钠液(pH8.7))将含有百日咳毒素的液体过柱，然后进行过滤(孔径0.2μm)，由此得到纯化百日咳毒素(PT抗原)液。
(3)纤维状红细胞凝集素的制备
将上述(1)中分离的菌体用添加了1mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)溶解，然后通过离心分离重新分成上清液和菌体。向重新分离出的上清液中加入25w/v％乙酸钙溶液使其为0.1～2.0w/v％，通过过滤得到含纤维状红细胞凝集素(感染保护性抗原)的液体。对滤液用硫酸铵浓缩后，采用密度梯度离心法进行纯化，分级分离出纯化纤维状红细胞凝集素(FHA抗原)。
(4)外膜蛋白的制备
将上述(3)中重新分离出的菌体用添加0.145mol/L氯化钠的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解，于60℃加热90分钟，然后通过离心分离重新分离成上清液和菌体。向重新分离出的上清液中加入1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)使其占1/10量，再加入25w/v％乙酸钙溶液使其为0.1～2.0w/v％，过滤，得到了含有外膜蛋白(感染保护性抗原)的滤液。将含外膜蛋白(感染保护性抗原)的液体，经SP柱色谱法(平衡化溶液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0))纯化，回收通过柱的液体。然后，经凝胶柱色谱法(平衡化溶液：添加了0.25mol/L磷酸钠的0.025mol/L磷酸钠溶液(pH8.7))过柱之后，进行过滤(孔径0.2μm)，由此得到纯化外膜蛋白(69K抗原)。
(5)菌毛(凝集原(AGG))的制备
在上述(4)中收集含外膜蛋白的液体后的残渣中，加入上清液1/10量的添加了1mol/L氯化钠的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，进行过滤，得到了含菌毛(感染保护性抗原)的滤液。用硫酸铵浓缩所得含菌毛的液体后，采用密度梯度离心法进行纯化，分级分离出了纯化菌毛(FB抗原)。
(6)保护性抗原的制备(减毒)
将上述(2)～(5)中得到的PT抗原、FHA抗原、69KD抗原以及FB抗原以下列抗原比例为目标品质混合：相对于0.5mL的下述实施例8中制备的DPT混合疫苗，为PT抗原为1.89μg、FHA抗原为3.00μg、69K抗原为0.76μg、FB抗原为0.36μg，得到的液体为纯化的感染保护性抗原液。向纯化的感染保护性抗原液中加入0.2～0.5vol％的福尔马林，并且根据需要加入1w/v％以下的赖氨酸盐酸盐，37～41℃加热7天以上，进行减毒，得到百日咳保护性抗原液。采用超滤法除去多余的福尔马林和赖氨酸盐酸盐，得到百日咳保护性抗原原液。
实施例6(白喉类毒素的制备)
(1)白喉菌的培养
将白喉菌(Park Williams No.8)用Loeffler’s培养基于32.0～34.0℃培养5天。
(2)白喉类毒素的制备
向上述(1)所得的培养液中加入硫酸铵后，对上清液进行过滤(孔径0.45μm)，得到的滤液采用苯基疏水性柱色谱法(平衡化溶液：添加1.25mol/L硫酸铵的0.01mol/L磷酸钠溶液(pH6.5))过柱，采用DEAE离子交换柱色谱法(平衡化溶液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0))将所得毒素液过柱，然后采用凝胶柱色谱法(平衡化溶液：添加了0.145mol/L氯化钠的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0))过柱而分级分离出白喉类毒素，以此为纯化毒素液。
(3)白喉类毒素的类毒素化
向上述(2)所得的纯化毒素液中加入1w/v％以下的赖氨酸盐酸盐、0.3vol％的福尔马林，38.0～40.0℃加热21天，进行了类毒素化。
(4)白喉类毒素的制备
在上述(3)中进行类毒素化后，采用超滤法除去多余的福尔马林以及赖氨酸盐酸盐，得到白喉类毒素液。
实施例7(破伤风类毒素的制备)
(1)破伤风菌的培养
将破伤风菌(Harvard47-A)用肝肉汤(liver-liver broth)于34.5℃～36.5℃培养5天。
(2)破伤风类毒素的制备
向上述(1)中所得的培养液中添加硫酸铵，使其浓度为1.25mol/L。然后，采用苯基疏水性柱色谱法(平衡化溶液：添加1.25mol/L硫酸铵的0.01mol/L磷酸钠溶液(pH6.5))过柱，将所得毒素液经DEAE离子交换色谱法(平衡化溶液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5))过柱，然后再采用凝胶柱色谱法(平衡化溶液：添加0.145mol/L氯化钠的0.004mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0))过柱，分级分离出破伤风类毒素，以此为纯化毒素液。
(3)破伤风类毒素的类毒素化
向上述(2)中所得的纯化毒素液中加入0.3vol％的福尔马林，调整为pH7.0，于39℃加热15～23天进行了类毒素化。
(4)破伤风类毒素的制备
在上述(3)的类毒素化之后，采用超滤法除去多余的福尔马林以及赖氨酸盐酸盐，得到破伤风类毒素液。
实施例8(混合疫苗的制备)
(i)混合灭活的脊髓灰质炎疫苗的制备
将上述实施例2、3以及4所得的灭活脊髓灰质炎疫苗I型、灭活脊髓灰质炎疫苗II型以及灭活脊髓灰质炎疫苗III型的原液以D抗原量分别为3、100、10，与199培养基(M199)、最终浓度为0.5vol％的2-苯氧基乙醇以及最终浓度为0.09w/v％的氯化铝混合。将所得混合液的pH用氢氧化钠或盐酸调整为7，得到混合灭活脊髓灰质炎疫苗。
(ii)DPT混合疫苗的制备
将上述实施例5、6以及7中所得的百日咳菌的保护性抗原、白喉类毒素以及破伤风类毒素的原液与199培养基(M199)、最终浓度为0.5vol％的2-苯氧基乙醇以及最终浓度为0.24w/v％的氯化铝混合。将所得混合液的pH用氢氧化钠和盐酸调整为7，得到DPT混合疫苗。
(iii)混合疫苗的制备
将上述(i)中所得的混合灭活脊髓灰质炎疫苗与上述(ii)中所得的DPT混合疫苗等量混合，制备了混合疫苗。
实施例9(混合疫苗的稳定性)
对于实施例8所得的混合疫苗，在25℃进行加速试验来测定稳定性。稳定性通过对各病毒的效价试验来进行评价。
(1)沉淀纯化百日咳疫苗的效价试验
使用了受试物、标准百日咳疫苗以及百日咳菌18323株。分别稀释受试物及标准液，以此为基础，分别以4倍或其它合适的对数等间隔进行共计3个梯度稀释以上的稀释液。以16只以上的4周龄小鼠为1组，对于各稀释液分别使用1组。对于每1只小鼠1次腹腔内注射稀释液0.5mL。免疫注射21天后，对于每1只小鼠脑内注射用于攻击的菌混悬液0.025mL，观察14天，计算出死亡只数。用统计学方法处理试验结果并进行比较，发现受试物的效价一定为8单位/mL以上。
(2)沉淀白喉类毒素的效价试验
使用了受试物、对照沉淀白喉类毒素和适当的毒素液。受试物和对照品的稀释使用生理盐水，此外，毒素液的稀释使用添加0.2w/v％明胶的0.017mol/L磷酸盐缓冲氯化钠溶液(pH7.0)。分别稀释受试物和对照品，制作对数等间隔的梯度稀释液。以10只以上的5周龄小鼠为1组，对于受试物和对照品的各稀释液分别使用1组，对于每1只皮下注射0.5mL。免疫注射4～6周后，从各动物采血，测定血中抗毒素效价。用统计学方法处理试验结果并进行比较，发现受试物的效价一定在47单位/mL以上。
(3)沉淀破伤风类毒素的效价试验
使用了受试物、对照沉淀破伤风类毒素和适当的毒素液。受试物和对照品的稀释使用生理盐水，此外，毒素液的稀释使用添加0.2w/v％明胶的0.017mol/L磷酸盐缓冲氯化钠(pH7.0)。分别稀释受试物和对照品，制作对数等间隔的梯度稀释液。10只以上的5周龄小鼠为1组。对于受试物和对照品的各稀释液分别使用1组，对于每1只小鼠1次皮下注射0.5mL。免疫注射4～6周后，用约100LD50的毒素攻击各小鼠，观察4天。用统计学方法处理试验结果并进行比较，发现受试物的效价一定在27单位/mL以上。
(4)大鼠免疫原性试验
使用了受试物、IPV效价试验用对照品、各型标准血清、和用于中和试验攻击的脊髓灰质炎病毒沙宾株(I、II、III型)。分别稀释受试物和对照品，制作对数等间隔的稀释液。以10只以上的Wister系8周龄、雌性大鼠为1组，各稀释液分别使用1组。对于每1只，在后肢大腿部肌肉内接种0.5mL。接种21日后，从全部动物按个体采血，采集血清，56℃加热30分钟。添加个体动物血清和标准血清，各血清添加2孔以上，用MEM培养基进行2倍梯度稀释。而且，在各孔中接种各型中和用病毒混悬液至约100CCID50。然后，将全部板在36±1℃的CO2培养箱中放置3小时后，约4℃下反应一夜。第二天，向各孔中添加1×104个细胞的细胞混悬液，在36±1℃的CO2培养箱中培养7天。培养结束后，观察各孔的CPE，计算出50％中和点的血清稀释倍数，以其倒数为中和抗体价。用统计学方法处理试验结果并进行比较，发现受试物的效价一定与对照品相等或更高。
加速试验的结果示于表1。作为对照IPV，使用了Lot 04C(日本脊髓灰质炎研究所制)。
表1.
 
规格 开始时   1个月  2个月  3个月 
灭活脊髓灰质炎疫苗I型                与对照IPV相等或更高 1.7 1.7 1.5 2.1
灭活脊髓灰质炎疫苗II型               与对照IPV相等或更高 2.1 2.0 1.6 1.5
灭活脊髓灰质炎疫苗III型              与对照IPV相等或更高 20.3 12.3 5.9 6.0
沉淀纯化百日咳疫苗 8单位/mL 15.8 13.8 14.6 27.3
沉淀白喉类毒素 47单位/mL 97.9 109.3 85.9 102.9
沉淀破伤风类毒素 27单位/mL 72.3 88.6 105.5 79.4
实施例10(利用微载体法的Vero细胞培养和脊髓灰质炎病毒培养)
(i)Vero细胞的培养
使用胰岛素—EDTA溶液(0.25％胰岛素、0.014M EDTA)将下述细胞剥离后，于600rpm、离心10分钟，然后悬浮于细胞增殖用培养基(添加5vol％小牛血清、0.11％碳酸氢钠(NaHCO3)、0.1％果糖、20μg/mL琥乙红霉素以及100μg/mL卡那霉素的Dulbecco’s modified Eagle Medium(DME))，其中所述细胞是来源于Vero细胞的工作库(ヮ—キングバンク)(MWCB93)，以静置培养方式传代培养的细胞。
将微载体(Cytodex 1(商品名))用PBS(-)膨润后，用高压灭菌器121℃灭菌15分钟，更为细胞增殖用培养基后使用。
培养装置使用New Brunswick Scientific公司制造的セリジェンプラス和セリジェン，加入微载体、细胞混悬液后，用细胞增殖用培养基调整至最终4.8L(使用セリジェン时为3.5L)，在培养温度：37.0℃、溶氧浓度(DO)：15％、pH：7.15、转数：35～50rpm的条件下进行培养。使用NaHCO3浓度为0.15％的细胞增殖用培养基作为更换用培养基，从培养的第2天起以约4L/天的量连续进行培养基更换(使用セリジェン时，隔1日更换全量)。此外，细胞数的测定使用Coulter Counter(商品名)进行。
细胞培养的结果示于图1(仅3H的实验使用了セリジェン)。可知：当使用3g/L的载体时，低浓度初始细胞数(3L、约2×105个细胞/mL)在第7天、高浓度初始细胞数(3H、约10×105个细胞/mL)在第8天细胞数为最大，其后降低。此外，当使用5g/L的载体时，低浓度初始细胞数(5L、约2×105个细胞/mL)的情况下，可见的细胞数增加了11天，但在第12天细胞数降低。在低浓度初始细胞数的情况下，与3g/L载体相比，5g/L载体的总细胞数在第10天处于优势，但差别不大。在5g/L载体，高浓度初始细胞数(5H、约10×105个细胞/mL)的情况下，第9天仍处于细胞数增加的阶段，此时细胞数为约2.8 x 106个细胞/mL，增殖为初始细胞数的约2.7倍。
(ii)脊髓灰质炎病毒的培养
种病毒使用了1型脊髓灰质炎病毒(IS-90C)。细胞计数的最后1天，使用培养容量4倍量的添加了0.075％ NaHCO3的EBSS清洗细胞，然后在添加了0.3％ NaHCO3、20μg/mL琥乙红霉素以及100μg/mL卡那霉素M-199(E)的1L培养基(病毒培养用培养基)中稀释制备种病毒。将其接种于清洗后的细胞，添加病毒培养用培养基使其达到各培养装置的培养容量。病毒培养在下述条件下进行，培养温度：33.3℃、DO：15％、pH：7.40、转数：35～50rpm。在细胞因病毒的CPE(cytopathic effect：细胞变性效果)而完全脱离微载体时，中止病毒培养，收获病毒液。收获的病毒液于-80℃冻存。
本试验中，病毒培养开始于图1所示的细胞增殖曲线中的各个最终计数日。
病毒效价的测定如下进行。将在旋转管中培养了3天的GMK-2细胞用1mL的添加了0.075％ NaHCO3、200u/mL青霉素、200μg/mL链霉素的HBSS清洗2次后，加入1mL的细胞维持液(添加0.1％牛血清白蛋白、0.225％NaHCO3、200u/mL青霉素、200μg/mL链霉素的M-199培养基)。试验病毒液用细胞维持液进行0.5log10梯度稀释，将10-7～10-8.5的病毒液每管接种0.2mL，每个稀释液接种5只管。接种后，在36℃的培养室中培养7天，以第7天的CPE观察判定为基础采用Reed & Muench法计算出感染滴度(CCID50/0.2mL)。
使用各条件下培养的Vero细胞所得到的I型脊髓灰质炎病毒的感染滴度(病毒效价)示于图2。病毒培养的结果是：在第9天细胞密度为约2.8 x 106个细胞/mL的载体5g/L的高浓度初始细胞数体系(5H)中，得到了最高的感染滴度。感染滴度的顺序为5H、5L、3L，该结果与总细胞数相一致。此外，与对照中使用绿猴肾脏细胞培养得到的病毒液相比，5H体系获得了10倍以上的感染滴度。图2所示的病毒效价(log10 CCID50/0.2mL)具体如下：3L体系为8.18、5L体系为8.51、5H体系为8.59、Ref.(对照)为7.50。
工业实用性
通过在约4g/L～约6g/L的微载体存在下培养待接种脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞，能够获得高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株。通过使用高效价的脊髓灰质炎病毒沙宾株，能够高效地制造灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株。因而，包括在约4g/L～约6g/L的微载体存在下培养将要接种沙宾株脊髓灰质炎病毒的Vero细胞的步骤的混合疫苗制造方法(本发明的制造方法)，作为含有灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株的混合疫苗的高效制造方法是有用的。此外，本发明的混合疫苗能够有效地抑制脊髓灰质炎、百日咳、白喉以及破伤风的发病，因此其作为针对脊髓灰质炎、百日咳、白喉以及破伤风的疫苗是有用的。

Claims (10)

1.混合疫苗的制备方法，所述混合疫苗含有：
(A)灭活的脊髓灰质炎病毒沙宾株、
(B)百日咳菌的保护性抗原、
(C)白喉类毒素，以及
(D)破伤风类毒素，
该方法包括下述步骤：
(a)在约4g/L～约6g/L的微载体存在下，培养待接种脊髓灰质炎病毒沙宾株的Vero细胞。
2.权利要求1所述的方法，其还包括下述步骤：
(b)使脊髓灰质炎病毒沙宾株感染所述Vero细胞的步骤，
(c)使该脊髓灰质炎病毒增殖的步骤，
(d)回收含有该脊髓灰质炎病毒的病毒液的步骤，以及
(e)灭活该脊髓灰质炎病毒的步骤。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述微载体的浓度为约5g/L。
4.权利要求1所述的方法，其中，所述微载体为葡聚糖制微载体。
5.权利要求1所述的方法，其中，培养Vero细胞的步骤(步骤(a))以约3L以上的规模进行。
6.权利要求1所述的方法，其中，培养Vero细胞的步骤(步骤(a))以约30L以上的规模进行。
7.权利要求2所述的方法，还包括
(d-2)将所述病毒液进行纯化的步骤。
8.权利要求7所述的方法，其中所述纯化步骤(步骤(d-2))包括下述步骤：
(i)将经所述步骤(d)回收的病毒液通过超离心进行沉淀化、
(ii)将该沉淀的重悬液进行超声波处理、
(iii)经柱色谱纯化。
9.权利要求8所述的方法，其中，所述(iii)经柱色谱纯化的步骤只进行1次。
10.用权利要求1所述方法制备的疫苗。
CNA2007800362477A 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗 Pending CN101522209A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510553022.5A CN105126095A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP267439/2006 2006-09-29
JP2006267439 2006-09-29

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013100910144A Division CN103223163A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗
CN201510553022.5A Division CN105126095A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101522209A true CN101522209A (zh) 2009-09-02

Family

ID=39282813

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510553022.5A Pending CN105126095A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗
CN2013100910144A Pending CN103223163A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗
CNA2007800362477A Pending CN101522209A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510553022.5A Pending CN105126095A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗
CN2013100910144A Pending CN103223163A (zh) 2006-09-29 2007-09-28 Ipv-dpt疫苗

Country Status (15)

Country Link
US (1) US8753646B2 (zh)
EP (1) EP2075005B1 (zh)
JP (2) JP4874339B2 (zh)
KR (2) KR20150080643A (zh)
CN (3) CN105126095A (zh)
AU (1) AU2007305595C1 (zh)
BR (1) BRPI0717145A2 (zh)
CA (1) CA2664799C (zh)
ES (1) ES2560452T3 (zh)
HK (1) HK1129836A1 (zh)
MX (1) MX2009002909A (zh)
NZ (1) NZ574776A (zh)
RU (1) RU2447898C2 (zh)
WO (1) WO2008044611A1 (zh)
ZA (1) ZA200902155B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102178949A (zh) * 2011-05-13 2011-09-14 中国医学科学院医学生物学研究所 吸附无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗及其制备

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL308456A (en) 2005-04-08 2024-01-01 Wyeth Llc A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
US10092640B2 (en) 2011-01-05 2018-10-09 Bharat Biotech International Limited Combination heptavalent vaccine
US10787646B2 (en) 2015-10-02 2020-09-29 Baylor College Of Medicine Cultivation of human noroviruses
CA3141460A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Soligenix, Inc. Compositions and methods of manufacturing trivalent filovirus vaccines

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4525349A (en) * 1981-12-29 1985-06-25 Societe Anonyme Dite: Institut Merueux Process for the large-scale production of a vaccine against poliomyelitis and the resulting vaccine
US6696065B1 (en) * 1995-05-04 2004-02-24 Aventis Pastuer Limited Acellular pertussis vaccines and methods of preparation thereof
TR199802783T2 (xx) 1996-07-02 1999-03-22 Connaught Laboratories Limited �ok de�erli DTP polyo a��lar.
BRPI0419023A (pt) 2004-08-27 2007-12-11 Panacea Biotec Ltd vacina contra poliomielite inativada e derivada do genero sabin de vìrus da polio
CN1297313C (zh) * 2004-09-16 2007-01-31 中国医学科学院医学生物学研究所 减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法
WO2008028957A2 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102178949A (zh) * 2011-05-13 2011-09-14 中国医学科学院医学生物学研究所 吸附无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗及其制备

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007305595A1 (en) 2008-04-17
RU2009116273A (ru) 2010-11-10
MX2009002909A (es) 2009-03-31
JP4874339B2 (ja) 2012-02-15
EP2075005B1 (en) 2015-12-02
CN103223163A (zh) 2013-07-31
KR20090057442A (ko) 2009-06-05
US8753646B2 (en) 2014-06-17
ZA200902155B (en) 2010-06-30
NZ574776A (en) 2012-03-30
KR101617464B1 (ko) 2016-05-02
CN105126095A (zh) 2015-12-09
KR20150080643A (ko) 2015-07-09
RU2447898C2 (ru) 2012-04-20
JPWO2008044611A1 (ja) 2010-02-12
BRPI0717145A2 (pt) 2013-11-12
WO2008044611A1 (en) 2008-04-17
ES2560452T3 (es) 2016-02-19
US20100021497A1 (en) 2010-01-28
HK1129836A1 (zh) 2009-12-11
CA2664799C (en) 2016-01-05
AU2007305595B2 (en) 2012-10-04
AU2007305595C1 (en) 2014-10-02
JP2011201913A (ja) 2011-10-13
CA2664799A1 (en) 2008-04-17
EP2075005A4 (en) 2010-09-01
EP2075005A1 (en) 2009-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2250078C (en) Processes for the replication of influenza viruses in cell culture, and the influenza viruses obtainable by the process
CN101522209A (zh) Ipv-dpt疫苗
CN107267466A (zh) 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法
EA010057B1 (ru) Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма сейбина вируса полиомиелита
CN103374547A (zh) 一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法
WO2023246621A1 (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其应用
CN100333793C (zh) 二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗，剂型冻干及水针
TWI227274B (en) Enhanced immunogen for inactivated vaccine for infection with Japanese encephalitis viruses and process for producing the same
Duchene et al. Production of poliovirus vaccines: past, present, and future
RU2699671C1 (ru) Вакцина для ранней защиты против ящура типа О инактивированная эмульсионная
CN102988970B (zh) 口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用
CN100467062C (zh) 制备纯化的甲型肝炎病毒体和疫苗制剂的方法
CN104208666A (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN1617923A (zh) 大规模生产甲型肝炎病毒的方法
US3769415A (en) Method of preparing a killed vaccine for oral use
CN1404874A (zh) 双价Vero细胞肾综合征出血热纯化灭活疫苗的制备方法及其应用
JP5084214B2 (ja) Ｉｐｖワクチン
Murphy The isolation of an unclassified virus from an outbreak of infantile diarrhoea

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: UNIVERSITY OSAKA RESEARCH FOUNDATION

Free format text: FORMER OWNER: JAPAN POLIOMYELITIS RES INST;TAKEDA PHARMACEUTICAL

Effective date: 20140912

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140912

Address after: Osaka Japan

Applicant after: The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University

Applicant after: Takeda Chemical Industries, Ltd.

Address before: Tokyo, Japan, Japan

Applicant before: Japan Poliomyelitis Research Institute

Applicant before: Takeda Chemical Industries, Ltd.

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20090902