CN102988970B - 口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用,本发明的制备方法首先用硫酸鱼精蛋白沉淀去除大部分宿主细胞杂蛋白和核酸;然后病毒液经浓缩系统浓缩后作为层析上样样品。层析介质选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶进行纯化洗脱,收集第一个洗脱峰,过滤除菌后灭活,加入佐剂进行乳化,分装即得口蹄疫纯化疫苗。本发明的制备方法经济高效、且成本低,工艺简单、合理,能有效去除宿主细胞和培养基中的杂质,病毒回收率大于85%,蛋白和核酸去除率大于90%,由本发明方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗安全,免疫性好、性质稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种口蹄疫疫苗及其制备方法,特别涉及一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法及由该制备方法得到的口蹄疫纯化疫苗,还涉及得到的口蹄疫疫苗在制备预防动物口蹄疫药物中的应用。属于疫苗制备领域。
背景技术
随着家畜集约化养殖水平的提高,尤其是奶牛饲养量的增大,疫苗的轻微副反应,就可带来巨大的经济损失,如怀孕牛流产、泌乳牛产奶量下降、乳品质下降等,无任何副反应的疫苗在市场上有巨大的需求空间。
现有的口蹄疫灭活疫苗主要存在以下两个问题:1.免疫保护力不稳定,主要表现在:免疫后检测不到中和抗体或者抗体水平很低,或者免疫期较短,只有2~3个月;2.免疫副反应大,主要是:下游生产工艺仍为传统方法,未经纯化处理,疫苗中存在一些培养基和宿主细胞中的杂质及过敏性物质,而且有效抗原含量低。这对口蹄疫的免疫防控工作带来极大的影响。
近些年来,国内外关于疫苗分离纯化的研究群雄并起,异军突起,成绩斐然。在人用生物制品中,通过FDA认证的疫苗已有上百种,而正在研制开发中的疫苗达数千种之多,有关疫苗研究的科学论文和专利几乎都涉及到分离纯化技术,近年来这类文献呈现指数增长态势。但分离纯化技术仍未在兽用疫苗的生产中得到应用。随着我国畜牧业的发展,人们对兽用疫苗纯度和安全性等提出更高要求。
疫苗的分离纯化主要是去除培养基和宿主细胞中的杂蛋白、肽、核酸及污染菌和它产生的内毒素,传统的蔗糖密度梯度离心法、沉淀和过滤技术在疫苗的抗原纯化中仍被普遍采用,但绝大部分是简单分离得到的粗制疫苗,其中抗原含量较低,且可能含有一些杂质和过敏性物质,这些传统疫苗的处理方法一般均存在纯度、活力以及安全性偏低,不适合应用于规模化生产等缺点,满足不了新疫苗的研制和生产的需要。
疫苗的纯化以层析法提纯最为可靠,目前应用的领域仅限于人用生物制品,如乙肝、狂犬、出血热、流感、小儿麻痹疫苗等少数一些病毒性疫苗的研究和生产中。国内外尚未有用层析技术进行兽用疫苗纯化的报道。
本项目发明技术的突破,不仅提高我国动物疫苗生产工艺水平和疫苗质量,推动我国兽用疫苗行业的发展,而且将促使我国从疫苗生产大国向疫苗生产强国发展,合乎世界生物制药发展趋势,具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种制备口蹄疫纯化疫苗的方法,本发明的一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法,其特征在于包括:将经过细胞悬浮培养的口蹄疫病毒液中的细胞碎片去除后,浓缩至适当倍数,用硫酸鱼精蛋白沉淀去除大部分宿主细胞杂蛋白和核酸,离心,上清液通过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析进行洗脱,收集第一个洗脱峰,过滤除菌后灭活,加入佐剂进行乳化,分装即得。
本发明所述的制备方法,其特征在于具体的包括以下步骤:
(1)将口蹄疫病毒种毒接种悬浮培养的BHK21细胞,继续悬浮培养15~28小时;
(2)收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒,通过微孔过滤系统去除细胞碎片,得到微滤液;
(3)微滤液浓缩至微滤液原体积的1/10-1/100,得到微滤液的浓缩液;
(4)向步骤(3)得到的浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白,使硫酸鱼精蛋白的终浓度达到1.0mg/ml~2.5mg/ml的,室温(25℃)搅拌0.5h~2.0h,静置作用0.5h~2.0h后,5000rpm~10000rpm离心15min~60min,弃沉淀,取离心上清,得到浓缩口蹄疫病毒上清液;
(5)将聚丙烯酰胺葡凝胶装入层析柱,用1~2倍柱体积的PH7.4~8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡该层析柱,将步骤(4)离心获得的浓缩口蹄疫病毒上清液加于该聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶上面,待病毒液全部进入凝胶之后,再用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱;
(6)收集第一个洗脱峰,过滤除菌后用1mM~3mM的BEI 30℃灭活28小时,灭活液经2~10倍稀释后(用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液稀释,具体实施例中有记载),按1∶1重量比加矿物油佐剂乳化,分装得口蹄疫纯化疫苗。
在本发明中,所述的口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。这是因为本发明的口蹄疫病毒的柱层析纯化方法的根据是完整口蹄疫病毒粒子大小,而口蹄疫病毒各型毒株的完整口蹄疫病毒粒子大小是一样的,因而口蹄疫病毒各种血清型疫苗毒株均可采用本发明的方法进行纯化疫苗的制备。
在本发明的具体实施例中,所述的口蹄疫病毒毒株为O型口蹄疫毒种ONXC/92株(口蹄疫病毒O型-Asia I型二价灭活疫苗毒种种子批的建立(I),徐春河等,中国畜牧兽医学会口蹄疫学分会第十一次学术研讨会会议论文)、亚洲I型毒种Asia1/JSL/GSZY/06株(口蹄疫O型、Asia I型二价灭活疫苗的研制与应用,黄炯,兽医导刊,2009年06期)、O型口蹄疫毒种OR/80株(猪口蹄疫O型灭活疫苗PD(50)效检攻毒方式探索,郎洪武等,《中国兽药杂志》2004年03期)或O型口蹄疫毒种O/ZK/93-08株(猪口蹄疫O型灭活疫苗OZK/93株与OZK/93株+OS/99株免疫效果对比试验,徐新红等,饲料与畜牧·规模养猪2010,(9))。所述的毒种——O型口蹄疫毒种ONXC/92株、亚洲I型毒种Asia1/JSL/GSZY/06株、O型口蹄疫毒种OR/80株或O型口蹄疫毒种O/ZK/93-08株购买自兰州兽医研究所。
在本发明的具体实施例中,所述的微孔过滤系统优选孔径为5微米,1微米和0.45微米的滤芯一起联合使用,或者5微米,1微米和0.45微米的振动筛一起联合使用,或者5微米,1微米和0.45微米中空纤维柱一起联合使用。
在本发明的具体实施例中,步骤(3)中所述的浓缩为使用PEG6000进行病毒沉淀浓缩或者使用截留分子量为6kd-20kd的中空纤维柱或者截留分子量为6kd-20kd的膜包进行浓缩。
在本发明的具体实施例中,所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶为组分收集范围为1.0×104~1.0×108球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。更优选为组分收集范围为1.0×104~1.5×106球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶包括但不限于sephacryl S-300、sephacryl S-400或sephacryl S-500。更优选为sephacryl S-300。
硫酸鱼精蛋白(货号p4380),BEI,均为sigma公司产品;206佐剂购自法国Seppic公司;PEG6000购自AMRESCO公司。空柱XK26;凝胶介质填料:sephacryl S-300,sephacryl S-400及sephacryl S-500均为GE公司产品。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供由以上所述的制备方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供有本发明方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗在制备预防动物口蹄疫疾病药物中的应用。
本发明的口蹄疫纯化疫苗的制备方法,通过将口蹄疫病毒接种悬浮培养的BHK21细胞,收获后去除细胞碎片,适当浓缩后,用硫酸鱼精蛋白沉淀去除大部分宿主细胞杂蛋白和核酸,离心,取离心上清作为层析上样样品,层析介质聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶经济高效、处理量大,化学稳定性高,耐受性好,非常适合工业化使用,且成本低,工艺简单、合理,可有效去除宿主细胞和培养基中的杂质,杂蛋白和核酸去除率大于90%,病毒回收率大于85%,由本发明方法制备得到的口蹄疫纯化灭活疫苗安全,免疫性好、性质稳定。
附图说明
图1为使用Sepharose 4FF得到的层析图谱;
图2为使用Sepharose 6FF得到的层析图谱;
图3为使用DEAE Sepharose得到的层析图谱;
图4为使用Sephacryl S-500得到的层析图谱;
图5为使用Sephacryl S-400得到的层析图谱;
图6为使用Sephacryl S-300得到的层析图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗(ONXC株+JSL株)的制备
1材料
1.1疫苗毒株:制造本品用O型口蹄疫灭活疫苗生产用毒种为ONXC/92株以及亚洲I型口蹄疫灭活疫苗生产用毒种为Asia1/JSL/GSZY/06株购买自兰州兽医研究所。
1.2化学试剂:BHK21细胞为本实验按照现有常规方法制备,保藏;硫酸鱼精蛋白(货号p4380),BEA,均为sigma公司产品;206佐剂购自法国Seppic公司。
1.3层析柱与凝胶介质:凝胶介质填料sephacryl S-300、空柱XK26均为GE公司产品;
1.4微孔过滤系统:孔径为5微米,1微米和0.45微米的滤芯一起联合使用,上海金科过滤器材有限公司产品。
1.5浓缩系统:截留分子量为10kd的膜包,德国赛多利斯公司制造。
2方法
(1)将口蹄疫病毒种毒ONXC/92株、Asia1/JSL/GSZY/06株分别接种悬浮培养的BHK21细胞,继续培养20小时。
(2)分别收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒ONXC/92、Asia1/JSL/GSZY/06,分别通过孔径为5微米,1微米和0.45微米的滤芯去除细胞碎片,得到口蹄疫病毒ONXC/92、Asia1/JSL/GSZY/06的微滤液。
(3)步骤(2)得到的微滤液分别用膜包超滤浓缩系统浓缩至原体积的1/40。
(4)分别向步骤(3)得到的微滤液的超滤浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白,使硫酸鱼精蛋白的终浓度为1.0mg/ml,室温搅拌0.5h,静置作用1h后,7000rpm离心30min,弃沉淀,取离心上清。
(5)将sephacryl S-300凝胶装入层析柱,用2倍柱体积的PH7.4~8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡层析柱,将离心获得的该两种浓缩口蹄疫病毒液分别各自加于sephacryl S-300凝胶上面,待病毒液全部进入凝胶之后,再用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱。
(6)分别收集第一个洗脱峰,过滤除菌后分别用3mM的BEI(BEA加0.2N的氢氧化钠的作用下环化生成BEI。)30℃灭活28小时,灭活ONXC/92株和Asia1/JSL/GSZY/06株抗原液按1∶1体积比混合,用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行4倍稀释后,再按1∶1重量比加206佐剂乳化,分装得牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗。
实施例2猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗(OR/80株+O/ZK/93-08株)的制备
1材料
1.1疫苗毒株:制造本品用口蹄疫毒种为O型口蹄疫灭活疫苗生产用毒种OR/80株和O型口蹄疫灭活疫苗生产用毒种O/ZK/93-08株购买自兰州兽医研究所。
1.2化学试剂:BHK21细胞为本实验按照现有常规方法制备,保藏;硫酸鱼精蛋白(货号p4380),BEA,均为sigma公司产品;206佐剂购自法国Seppic公司。
1.3层析柱与凝胶介质:空柱XK26;凝胶介质填料:sephacryl S-300均为GE公司产品;
1.4微孔过滤系统:孔径为5微米,1微米和0.45微米的中空纤维柱一起联合使用,天津爱生膜过滤技术有限公司产品。
1.5浓缩系统:截留分子量为6-10kd的中空纤维柱,天津爱生膜过滤技术有限公司产品。
2方法
(1)将口蹄疫病毒种毒OR/80株和O/ZK/93-08株分别接种悬浮培养的BHK21细胞,继续培养25小时。
(2)分别收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒,通过孔径为5微米、1微米和0.45微米的中空纤维柱去除细胞碎片,分别得到口蹄疫病毒种毒OR/80和O/ZK/93-08的微滤液。
(3)步骤(2)得到的微滤液分别用中空纤维柱超滤浓缩系统浓缩至原体积的1/60。
(4)分别向步骤(3)得到的微滤液的超滤浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白,使硫酸鱼精蛋白的终浓度为2.0mg/ml,室温搅拌1.5h,静置作用0.5h后,10000rpm离心15min,弃沉淀,取离心上清。
(5)将sephacryl S-300装入层析柱,用2倍柱体积的PH7.4~8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡层析柱,将离心获得的浓缩口蹄疫病毒离心上清液分别各自加于凝胶上面,待病毒液全部进入凝胶之后,再用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱。
(6)分别收集第一个洗脱峰,过滤除菌后分别用2.0mM的BEI(BEA加0.2N的氢氧化钠的作用下环化生成BEI。)30℃灭活28小时,灭活OR/80株和O/ZK/93-08株抗原按1∶1体积比混合,用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行5倍稀释后,再按1∶1重量比加206佐剂乳化,分装得猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗。
实施例3猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗(OR/80株+O/ZK/93-08株)的制备
1材料
1.1疫苗毒株:制造本品用口蹄疫毒种为O型口蹄疫灭活疫苗生产用毒种OR/80株和O型口蹄疫灭活疫苗生产用毒种O/ZK/93-08株购买自兰州兽医研究所。
1.2化学试剂:BHK21细胞为本实验按照现有常规方法制备,保藏;硫酸鱼精蛋白(货号p4380),BEA,均为sigma公司产品;206佐剂购自法国Seppic公司;PEG6000购自AMRESCO公司。
1.3层析柱与凝胶介质:空柱XK26;凝胶介质填料:sephacryl S-300均为GE公司产品;
1.4微孔过滤系统:孔径为5微米,1微米和0.45微米的中空纤维柱一起联合使用,天津爱生膜过滤技术有限公司产品。
2方法
(1)将口蹄疫病毒种毒OR/80株和O/ZK/93-08株分别接种悬浮培养的BHK21细胞,继续培养28小时。
(2)分别收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒,通过孔径为5微米、1微米和0.45微米的中空纤维柱去除细胞碎片,分别得到口蹄疫病毒种毒OR/80和O/ZK/93-08的微滤液。
(3)按质量体积百分比(g/ml)计,分别向步骤(2)得到的微滤液中加入NaCl,使得NaCl的终浓度为4%(即每100ml微滤液中所加入的NaCl质量为4g),充分溶解后加入PEG6000,使得PEG6000终浓度为8%(即每100ml微滤液中所加入的PEG6000的质量为8g),4℃下搅拌混合16h,7000rpm高速离心1.5h,获得口蹄疫病毒沉淀,使用TEN缓冲液(0.01M Tris,0.01M EDTA,0.1M NaCl,PH为7.6-8.0)重悬病毒沉淀,得到浓缩至原体积的1/80的病毒浓缩液;
(4)分别向步骤(3)得到的微滤液的超滤浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白,使硫酸鱼精蛋白的终浓度为1.5mg/ml,室温搅拌1h,静置作用0.5h后,7000rpm离心45min,弃沉淀,取离心上清。
(5)将sephacryl S-300装入层析柱,用2倍柱体积的PH7.4~8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡层析柱,将离心获得的浓缩口蹄疫病毒离心上清液分别各自加于凝胶上面,待病毒液全部进入凝胶之后,再用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱。
(6)分别收集第一个洗脱峰,过滤除菌后分别用2.0mM的BEI(BEA加0.2N的氢氧化钠的作用下环化生成BEI。)30℃灭活28小时,灭活OR/80株和O/ZK/93-08株抗原按1∶1体积比混合,用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行7倍稀释后,再按1∶1重量比加206佐剂乳化,分装得猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗。
实施例4疫苗检测
将实施例1制备得到的牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗(ONXC株+JSL株)(内部批号:2011RD001)用于以下检测:
攻击用毒种:为O型口蹄疫毒种ONXC/92株,亚洲I型毒种Asia1/JSL/GSZY/06株的同源鼠毒毒株购买自兰州兽医研究所。
对照疫苗:口蹄疫O型、亚洲I型二价灭活疫苗(ONXC株+JSL株),生产批号:20110202,生产日期:20110322,为内蒙古必威安泰生物科技有限公司产品。
以对照疫苗为参照,在按照现有农业部组织拟定的《口蹄疫O型、亚洲I型二价灭活疫苗制造及检验试行规程》进行物理性状、无菌检验、安全检验、效力检验的基础上,效力检验按照每头份1ml免疫,同时增加了对奶牛泌乳量的影响的试验。
1物理性状:
牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗物理性状检验结果见表1。
表1物理性状检验结果
2无菌检验:
牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗无菌检验结果见表2。
表2无菌检验结果
3安全性检验
牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗安全性检验结果见表3,对奶牛泌乳量的检测结果见表4。
表3安全性检验结果
表4奶牛泌乳量的检测结果.
4效力检验牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗效力检验结果见表5、表6。
表5Asia I/JSL/GSZY/06毒株效力检验结果
表6ONXC/92毒株效力检验结果
5、牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗的146s含量、总蛋白含量、DNA残留量检验
除此之外我们还利用本公司已经建立好的146s定量法对牛口蹄疫二价灭活纯化疫苗进行了146s含量检测,以及按照现行《中国药典》第三部附录的lowry法进行蛋白含量检测,用紫外分光光度法进行DNA含量检测。结果如表7所示。
表7146s含量、总蛋白含量、DNA残留量检验结果
疫苗批号 | 146s含量 | 总蛋白含量 | DNA残留量 |
2011RD001 | 14.83μg/ml | 0.447mg/ml | 1.03μg/ml |
20110202 | 4.69μg/ml | 4.82mg/ml | 26.8μg/ml |
纯化苗与对照苗比 | 提高3.16倍 | 降低90.73% | 降低96.16% |
小结:
采用该生产工艺制备的口蹄疫病毒二价灭活纯化苗,物理性状检验、无菌检验、安全性检验、效力检验均符合农业部拟定《规程》要求。该纯化苗与现有普通对照苗相比,抗原含量提高3.16倍;杂蛋白去除90.73%;核酸DNA去除96.16%,其优势体现在效力检验结果上:在免疫剂量缩减至1ml每头份的条件下,该纯化苗效力均在10个PD50以上,比业部拟定《规程》规定的3个PD50高至少3倍。
实施例5疫苗检验
将实施例2制备得到的猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗(OR/80株+O/ZK/93-08株)(内部批号:2011RD004)用于以下检测:
攻击用毒种:分别为猪O型口蹄疫毒OR/80株和O/ZK/93-08株的同源鼠毒毒株购买自兰州兽医研究所。
对照疫苗:猪口蹄疫O型灭活疫苗(O/ZK/93-08株+OR/80株),生产批号:20110104,生产日期:20110513。为内蒙古必威安泰生物科技有限公司产品。
以对照疫苗为参照,在按照现有农业部组织拟定的《猪口蹄疫O型灭活疫苗(O/ZK/93-08株+OR/80株或OS/99株)制造及检验试行规程》进行物理性状、无菌检验、安全检验、效力检验的基础上,效力检验按照每头份1ml免疫。
1物理性状:猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗物理性状检验结果见表8。
表8.物理性状检验结果
2无菌检验:
猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗无菌检验结果见表9。
表9无菌检验结果
3安全检验:猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗安全性检验结果见表10。
表10安全性检验结果
4效力检验
猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗效力检验结果见表11、表12。
表11OR/80毒株效力检验结果
表12O/ZK/93-08毒株效力检验结果
5猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗的146s含量、总蛋白含量、DNA残留量检验
除此之外我们还利用本公司已经建立好的146s定量法进行146s含量检测,以及按照按现行《中国药典》第三部附录的lowry法进行蛋白含量检测、用紫外分光光度法进行DNA含量检测。结果见表13。
表13.146s含量、总蛋白含量、DNA残留量检验结果
疫苗批号 | 146s含量 | 总蛋白含量 | DNA残留量 |
2011RD004 | 16.94μg/ml | 0.426mg/ml | 0.972μg/ml |
20110104 | 5.03μg/ml | 5.43mg/ml | 24.86μg/ml |
纯化苗与对照苗比 | 提高3.37倍 | 降低92.15% | 降低96.09% |
小结:
采用该生产工艺制备的猪口蹄疫灭活纯化苗,物理检验、无菌检验、安全性检验、效力检验均完全符合农业部拟定《规程》要求。
该纯化苗与现有猪口蹄疫O型灭活对照苗相比,该纯化疫苗抗原含量提高3.37倍;杂蛋白去除92.15%;核酸DNA去除96.09%,其最大优势体现在效力检验结果上:在免疫剂量缩减至1ml每头份的条件下,该纯化苗效力均在10个PD50以上,比业部拟定《规程》规定的3个PD50高至少3倍。
实施例6疫苗检验
将实施例3制备得到的猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗(OR/80株+O/ZK/93-08株)(内部批号:2011RD002)用于以下检测:
检验用毒种:分别为猪O型口蹄疫毒OR/80株和O/ZK/93-08株的同源毒株购买自兰州兽医研究所。
对照疫苗:猪口蹄疫O型灭活疫苗(O/ZK/93-08株+OR/80株),生产批号:20110104,生产日期:20110513。为内蒙古必威安泰生物科技有限公司产品。
以对照疫苗为参照,在按照现有农业部组织拟定的《猪口蹄疫O型灭活疫苗(O/ZK/93-08株+OR/80株或OS/99株)制造及检验试行规程》进行物理性状、无菌检验、安全检验、效力检验的基础上,效力检验按照每头份1ml免疫。
1物理性状:猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗物理性状检验结果见表14。
表14物理性状检验结果
2无菌检验:
猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗无菌检验结果见表15。
表15无菌检验结果
3安全检验:猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗安全性检验结果见表16。
表16安全性检验结果
4效力检验
猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗效力检验结果见表17、表18。
表17OR/80毒株效力检验结果
表18O/ZK/93-08毒株效力检验结果
5猪口蹄疫O型灭活纯化疫苗的146s含量、总蛋白含量、DNA残留量检验
除此之外我们还利用本公司已经建立好的146s定量法进行146s含量检测,以及按照按现行《中国药典》第三部附录的lowry法进行蛋白含量检测、用紫外分光光度法进行DNA含量检测。结果见表19。
表19.146s含量、总蛋白含量、DNA残留量检验结果
疫苗批号 | 146s含量 | 总蛋白含量 | DNA残留量 |
2011RD002 | 17.15μg/ml | 0.414mg/ml | 0.966μg/ml |
20110104 | 5.02μg/ml | 5.426mg/ml | 24.858μg/ml |
纯化苗与对照苗比 | 提高3.42倍 | 降低92.37% | 降低96.11% |
小结:
采用该生产工艺制备的猪口蹄疫灭活纯化苗,物理检验、无菌检验、安全性检验、效力检验均完全符合农业部拟定《规程》要求。
该纯化苗与现有猪口蹄疫O型灭活对照苗相比,该纯化疫苗抗原含量提高3.42倍;杂蛋白去除92.37%;核酸DNA去除96.11%,其最大优势体现在效力检验结果上:在免疫剂量缩减至1ml每头份的条件下,该纯化苗效力均在10个PD50以上,比业部拟定《规程》规定的3个PD50高至少3倍。
实施例7口蹄疫纯化疫苗制备方法的条件优化
1材料
1.1疫苗毒株:亚洲I型毒Asia1/JSL/GSZY/06株购买自兰州兽医研究所。
1.2化学试剂:硫酸鱼精蛋白,为sigma公司产品;
1.3层析柱与凝胶介质:均为GE公司产品。
2方法
根据文献资料和预实验的结果,选取影响口蹄疫纯化疫苗制备方法的四个主要因素,分别是硫酸鱼精蛋白使用浓度、硫酸鱼精蛋白作用温度和时间、层析介质的选择,进行优化条件的确定。
2.1硫酸鱼精蛋白使用浓度优化
取经过BHK21细胞悬浮培养的Asia1病毒,微滤除碎后浓缩50倍,加入硫酸鱼精蛋白至不同终浓度,依次为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml及2.5mg/ml五个浓度梯度,4℃作用1.5小时后,8000rpm离心,取上清,检测上清的总蛋白含量,DNA含量。
2.2硫酸鱼精蛋白作用温度和时间的优化
取经过BHK21细胞悬浮培养的Asia1病毒,微滤除碎后浓缩50倍,加入1mg/ml工作浓度的硫酸鱼精蛋白,分别在4℃和室温条件下作用1.0h,1.5h,2.0h,3.0h,4.0h离心,取上清;检测上清的总蛋白含量,DNA含量以及TCID50。
2.3层析介质的选择
分别用凝胶介质Sepharose4FF,Sepharose6FF,DEAE Sepharose,SephacrylS-500,Sephacryl S-400,Sephacryl S-300装填XK26的柱子,根据不同凝胶的特性进行平衡、上样、洗脱,收集不同洗脱峰,检测TCID50,蛋白含量、DNA含量,计算抗原回收率、蛋白去除率和DNA去除率。
3结果
3.1硫酸鱼精蛋白使用浓度优化
取经过BHK21细胞悬浮培养的Asia1病毒,,微滤除碎后浓缩50倍,加入硫酸鱼精蛋白至不同终浓度,依次为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml及2.5mg/ml五个浓度梯度,4℃作用1.5小时后,8000rpm离心,取上清,检测上清的总蛋白含量,DNA含量,计算蛋白去除率和DNA去除率。结果如表20所示。
表20硫酸鱼精蛋白使用浓度优化
根据表20的结果,在综合硫酸鱼精蛋白去除宿主细胞杂蛋白和核酸的效果以及生产成本等因素后,确定硫酸鱼精蛋白的最佳使用浓度为1mg/ml。
3.2硫酸鱼精蛋白作用温度和时间的优化
取经过BHK21细胞悬浮培养的Asia1病毒,微滤除碎后浓缩50倍,加入1mg/ml的硫酸鱼精蛋白,分别在4℃和室温条件下作用1.0h,1.5h,2.0h,3.0h,4.0h,此时间包括搅拌和静置的时间,离心,取上清;检测上清的总蛋白含量,DNA含量以及TCID50。结果如表21所示。
表21硫酸鱼精蛋白作用温度和时间的优化
根据表21的结果,在综合硫酸鱼精蛋白去除宿主细胞杂蛋白和核酸的效果、对病毒滴度的影响以及生产工艺的简化等因素后,确定硫酸鱼精蛋白的最佳作用温度和时间是室温(25℃)作用1.5h。
3.3层析介质的选择
分别用凝胶介质Sepharose4FF,Sepharose6FF,DEAE Sepharose,SephacrylS-500,Sephacryl S-400Sephacryl S-300装填XK26的柱子,根据不同凝胶的特性进行平衡、上样、洗脱,收集洗脱峰,检测收集洗脱液的TCID50,蛋白含量、DNA残留量,计算抗原回收率、蛋白去除率和DNA去除率。结果如表22所示。凝胶介质Sepharose4FF,Sepharose6FF,DEAE Sepharose,Sephacryl S-500,Sephacryl S-400Sephacryl S-300所对应的层析图谱依次如图1-图6所示
表22层析介质的选择
根据表22以及说明书附图的结果,Sepharose 4FF、Sepharose 6FF和DEAESepharose层析中,口蹄疫病毒富集区域不在单独的图谱收集峰上,这使得口蹄疫病毒抗原回收率、蛋白去除率、DNA去除率较低,达不到层析纯化的目的。Sephacryl凝胶层析时,口蹄疫病毒富集区域基本上在第一个图谱收集峰上,Sephacryl S-500、Sephacryl S-400、Sephacryl S-300三个系列的纯化均获得了抗原回收率均大于50%,蛋白去除率均大于80%,DNA去除率均大于90%的效果;但使用Sephacryl S-300层析时口蹄疫病毒抗原回收率、蛋白去除率以及DNA去除率均获得最高值,实现了层析纯化的最理想效果。综合以上因素,确定柱层析最佳凝胶填料为SephacrylS-300。
Claims (5)
1.一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将口蹄疫病毒种毒接种悬浮培养的BHK21细胞,继续悬浮培养15~28小时;
(2)收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒,通过微孔过滤系统去除细胞碎片,得到微滤液;
所述的微孔过滤系统为孔径为5微米,1微米和0.45微米的滤芯一起联合使用或者孔径为5微米,1微米和0.45微米的振动筛一起联合使用,或者孔径为5微米,1微米和0.45微米中空纤维柱一起联合使用;
(3)微滤液浓缩至微滤液原体积的1/10~1/100,得到微滤液的浓缩液;
所述的浓缩为使用PEG6000进行病毒沉淀浓缩或者使用截留分子量为6kd-20kd的中空纤维柱或者截留分子量为6kd-20kd的膜包进行浓缩;
(4)向步骤(3)得到的浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白,使硫酸鱼精蛋白的终浓度达到1.0mg/ml~2.5mg/ml,室温搅拌0.5h~2.0h,静置作用0.5h~2.0h后,5000rpm~10000rpm离心15min~60min,弃沉淀,取离心上清,得到浓缩口蹄疫病毒上清液;
(5)将聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶装入层析柱,用1~2倍柱体积的PH7.4~8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡层析柱,将步骤(4)离心获得的浓缩口蹄疫病毒上清液加于聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶上面,待病毒液全部进入凝胶之后,再用PH7.4~8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱;所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶为组分收集范围为1.0×104~1.0×108球蛋白分子量的高分辨率聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶;
(6)收集第一个洗脱峰,过滤除菌后用1mM~3mM的BEI30℃灭活28小时,灭活液经2-10倍稀释后,按1:1重量比加矿物油佐剂乳化,分装得口蹄疫灭活疫苗。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶组分收集范围为1.0×104~1.5×106球蛋白分子量。
4.由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。
5.权利要求4所述的口蹄疫纯化疫苗在制备预防动物口蹄疫疾病药物中的应用。
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