CN109387582B - 一种口蹄疫抗原的定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得标准抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测样品进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。本发明解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。且本发明采用添加杂蛋白的预处理，可大大缩短样品的处理时间，提高检测的准确性。

Description

一种口蹄疫抗原的定量方法
技术领域
本发明涉及口蹄疫抗原的定量分析技术领域，具体涉及一种口蹄疫抗原的定量方法。
背景技术
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。目前，疫苗免疫是口蹄疫诸多防制措施中最重要也是最成功的措施之一，其中常规灭活疫苗是当前口蹄疫免疫防控的最主要疫苗。
口蹄疫定量分析方法目前以蔗糖梯度密度为主，检测程序复杂，不适合快速检测。而开发利用高效液相层系统(HPLC)进行定量已成为口蹄疫抗原定量的趋势。专利CN104634891A中公开了一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146S测定方法，选取了分子量分离范围为2×104-1×107Da的色谱柱，在高效液相色谱仪上对被检测的样品进行色谱分离，用于口蹄疫抗原含量的鉴定。然而，该方法在实际操作时，和普遍的HPLC方法一样，当待测定样品的溶液体系(包括缓冲溶液组分、电导、pH范围)不同时，其测得的样品浓度出现明显浮动。即待测样品的溶液体系尤其是电导可明显影响HPLC的定量结果。发明人在前期进行了如下试验：分别采用浓度为5μg/mL的标准口蹄疫疫苗抗原146S样品制备成不同氯化钠浓度(电导分别为：54.6mS/cm和5mS/cm)的标准样品，采用专利CN104634891A中的方法进行定量分析，结果分别为7.9μg/ml和4.8μg/mL。其结果偏差可达33％,不能用于不同溶液条件下口蹄疫抗原含量的准确测定。在口蹄疫抗原的制备过程溶液电导会随加工流程发生变化，以及产品批次的电导也会发生偏差，由此导致在实际操作中，仍存在结果的准确性不高的问题。
且发明人前期利用三根全新的TSK-G4000SWXL色谱柱对破乳疫苗进行反复检测中，其使用寿命分别为312次，241次，449次，色谱柱使用寿命短主要是葡聚糖凝胶的耐压性差，易被破乳样品中残留的佐剂污染，难以清洗造成。
此外，在抗原样品的预处理过程中，通常采用常规的PEG沉淀法对病毒样品沉淀，但由于待测样品病毒浓度过低(通常不大于20μg/mL)，无法在较短时间内获得沉淀，通常需静置过夜才能进行后续的步骤，无法达到高效、快速、准确的要求，而常规的超滤浓缩后再PEG沉淀的方式又会造成病毒在膜上的吸附，形成的损失无法确定，影响测定结果的可靠性。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种高效、快速的口蹄疫抗原的定量方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：
A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；
B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。
优选地，步骤A中，所述关联公式为：
C＝a×PA+b
其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。
优选地，所述各标准样品和经预处理后的待测病毒溶液体系相同，包括缓冲溶液组分、电导、pH范围相同。
优选地，所述HPLC测定时，采用的色谱柱为Agilent Bio SEC系色谱柱，更优选Agilent Bio SEC-5色谱柱。
优选地，所述Agilent Bio SEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径
Figure GDA0001495496440000021
优选地，所述采用Agilent Bio SEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含高盐或者低盐的磷酸缓冲溶液，pH7.0～8.5。
更优选地，所述HPLC测定时，测定条件为：流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液，其pH值为7.2；流速为1ml/min；进样量为100μl，检测波长为259nm。
优选地，步骤B中，所述预处理的步骤包括：在待测病毒溶液中加入杂蛋白，再添加PEG后，离心获得沉淀，再将沉淀进行复溶，即可。
优选地，所述杂蛋白在待测病毒溶液中的终浓度为0.5～10mg/mL。
优选地，所述杂蛋白的分子量为10～200kD。
优选地，所述杂蛋白包括白蛋白、细胞因子、抗体分子，及重组表达的非酶类蛋白，例如牛血清白蛋白、干扰素、IgG。
优选地，所述离心的条件为：2～10℃下，3000g～10000g离心15～60分钟。
优选地，所述PEG的添加量为5％～20％；更优选PEG添加量为6％～15％。
本发明在待测样品中故意添加杂蛋白，使总蛋白浓度达到2mg/mL以上，然后再添加PEG可快速获得沉淀，复溶后病毒没有损失，并且由于杂蛋白的分子量和病毒的差距太远，也不会干扰HPLC检测，同时实现样品的均一化处理的目的。
本发明所述的定量方法不仅适用于口蹄疫抗原，还适用于其他病毒或类病毒颗粒抗原的定量，均可达到相同的效果。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本发明解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。
2)本发明采用Agilent Bio SEC系列色谱柱，是硅胶系列属于硬胶，耐压性能远高于TSK G4000SWXL以及Superdex 200。Bio SEC-5比SW4000XL能承受的流速更高，测定时间更短，可将检测时间从30分钟缩短到20分钟，使用寿命更长，TSK G4000SW XL检测破乳样品的次数在500次以内，500次以后分辨能力易丧失，而Bio SEC-5在1000次样品检测后依旧稳定，因此检测的综合成本更低。
3)本发明通过提高病毒抗原样品中蛋白的总浓度，使得加入PEG后离心可快速获得病毒沉淀，获得的沉淀复溶后即可进行检测，大大缩短了样品的处理时间，提高了检测效率。且在蛋白沉淀过程中，由于病毒抗原会优先于杂蛋白先沉淀，因此，该快速方法处理不会造成病毒抗原沉淀不完全而导致结果不准确。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：
A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；
B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。
步骤A中，所述关联公式为：
C＝a×PA+b
其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。
所述各标准样品和经预处理后的待测病毒溶液体系相同，包括缓冲溶液组分、电导、pH范围相同。
所述HPLC测定时，采用的色谱柱为Agilent Bio SEC系色谱柱，更优选AgilentBio SEC-5色谱柱。
所述Agilent Bio SEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径
Figure GDA0001495496440000041
Figure GDA0001495496440000042
所述采用Agilent Bio SEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含高盐或者低盐的磷酸缓冲溶液，pH7.0～8.5。
所述HPLC测定时，测定条件为：流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液，其pH值为7.2；流速为1ml/min；进样量为100μl，检测波长为259nm。
步骤B中，所述预处理的步骤包括：在待测病毒溶液中加入杂蛋白，再添加PEG后，离心获得沉淀，再将沉淀进行复溶，即可。
所述杂蛋白在待测病毒溶液中的终浓度为0.5～10mg/mL。
所述杂蛋白的分子量为10～200kD。
所述杂蛋白包括白蛋白、细胞因子、抗体分子，及重组表达的非酶类蛋白，例如牛血清白蛋白、干扰素、IgG。
所述离心的条件为：2～10℃下，3000g～10000g离心15～60分钟。
所述PEG的添加量为5％～20％；更优选PEG添加量为6％～15％。
实施例1口蹄疫抗原标准品制备
1.材料
(1)检测样品：O型口蹄疫灭活疫苗
(2)仪器和试剂：离心机、PEG6000、正丁醇、氯仿
2.实验步骤
(1)灭活疫苗破乳：按照苗:正丁醇＝9:1的体积比向灭活疫苗中加入正丁醇，混匀，6000g，4℃，离心8min，用注射器吸取出下层水相。
(2)氯仿处理水相：向水相中加入10％氯仿，震荡混匀，6000g，4℃，离心5分钟，取上清。
(3)PEG6000浓缩病毒：向氯仿处理后的水相中加入PEG至其终浓度为7％，混匀，4℃静置18小时，然后4℃，8000g，离心50分钟，弃上清。用PBS重悬沉淀至原体积的1/10。
(4)蔗糖密度梯度离心：将沉淀复溶溶液加至15％～45％(w/v)的均匀的线性蔗糖密度梯度，10℃，35000rpm，离心2小时30分钟，选取25％～35％蔗糖浓度区域内OD259最高的区段。
(5)蔗糖去除和溶液置换：用截留分子量为100kD的超滤浓缩管，用PBS溶液洗滤5倍以上体积并超滤浓缩病毒溶液以去除蔗糖的残留并使病毒溶液电导接近PBS的电导值。用HPLC的方式确认病毒的纯度为100％，并用分光光度法测定样品浓度为400μg/mL。
实施例2高效液相色谱检测146S的标准曲线绘制
(1)用PBS稀释实施例1制得的病毒标准样品至2μg/mL,5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL。
(2)采用Agilent公司高效液相色谱系统，Agilent Bio SEC-5色谱柱对以上标准样品进行HPLC测定。流动相含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，进样量100μl，检测波长259nm。
(3)经高效液相色谱分析146S抗原为单一吸收峰，关联抗原浓度和高效液相色谱积分面积获得标准品的关联曲线
C＝0.0542PA+0.494
其中C为146S的浓度，单位为μg/mL，PA为吸收峰的峰面积，单位为mAU×s。所得标准曲线的R2＝0.99。
实施例3样品预处理对测定的影响
(1)用PBS稀释实施例1制得的病毒标准样品至2μg/mL,10μg/mL,40μg/mL。
(2)向不同浓度标准样品中添加PEG至6％，混匀，于4℃，10000g离心15分钟。没有沉淀产生。
(3)向不同浓度标准样品中添加BSA至终浓度为2mg/mL，再添加PEG至终浓度为6％，于4℃，10000g离心15分钟，获得沉淀用PBS复溶至原体积。同时以常规PEG沉淀法处理、不添加BSA的样品作为对照样，对照样加入PEG至终浓度为6％，4℃静置18小时，6000g离心50分钟，获得沉淀用PBS复溶至原体积。
(4)采用高效液相色谱系统进行步骤(3)中沉淀复溶样品分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，色谱柱：Agilent Bio SEC-5，进样量100μl，检测波长259nm。
(5)将经步骤(4)测得的吸收峰面积代入实施例2制得的关联曲线中，计算得沉淀复溶后的样品浓度分别为1.99μg/mL,9.98μg/mL,40μg/mL。而采用常规预PEG处理的对照样的浓度分别为1.96μg/mL、9.94μg/mL、39.89μg/mL。说明采用本发明的预处理方法后，在缩短检测预处理时间的同时保持检测的准确性。
实施例4高效液相色谱检测高盐和低盐样品
(1)灭活疫苗破乳：按照苗:正丁醇＝9:1向灭活疫苗中加入正丁醇，混匀，6000g，4℃，离心8min，用注射器吸取出下层水相。
(2)破乳水相经蔗糖密度梯度离心法测定146S浓度为4.4μg/mL。
(3)将破乳水相分别添加等体积两份不同氯化钠浓度的PBS(1000mM，50mMNaCl)，形成两个含有不同电导值但病毒浓度相同(浓度为2.2μg/mL)的待测样品1和2。
(4)测定样品1和2的电导分别为54.5mS/cm和9mS/cm。将待测样品1和2都平均分为两份。
(5)各取其中一份分别添加BSA至最终浓度为5mg/mL，再添加PEG(150mM NaCl)至最终浓度为15％，于4℃，3000g离心60分钟，获得沉淀，弃去上清后，用PBS复溶沉淀。
(6)采用高效液相色谱系统进行沉淀复溶样品分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，色谱柱：Agilent Bio SEC-5，进样量100μl，检测波长259nm。
(7)测定的病毒浓度分别为2.19μg/mL和2.18μg/mL，误差仅有1％。另将两个待测样品的另一份直接采用步骤(6)的方法进行样品分析，测定的浓度分别为2.56μg/mL和2.15μg/mL，与其实际浓度2.2μg/mL相比，有16％的误差。说明本发明的预处理方法可以消除样品的差异，使检测结果更准确。
实施例5高效液相色谱检测破乳疫苗样品测定及色谱柱使用寿命
(1)灭活疫苗破乳：按照苗:正丁醇＝9:1向灭活疫苗中加入正丁醇，混匀，6000g，4℃，离心8min，用注射器吸取出下层水相。
(2)将待测样品添加BSA至最终浓度为10mg/mL，再添加PEG至最终浓度为7％，于4℃，6000g离心30分钟，获得沉淀，弃去上清后，用PBS(150mM NaCl)复溶沉淀。
(3)采用高效液相色谱系统进行破乳疫苗样品连续性1000次分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，色谱柱：Agilent Bio SEC-5，进样量100μl，检测波长259nm。
(4)在连续监测过程中，每检测100个样品后用超纯水冲洗5个柱体积，然后用含有20％的乙腈PB溶液(pH 7.0)冲洗50个柱体积，再用超纯水冲洗5个柱体积，之后用检测流动相平衡色谱柱5个柱体积。
(5)比对1000次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的Agilent Bio SEC-5色谱柱，可大大提高其使用寿命。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；
B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度；
步骤B中，所述预处理的步骤包括：在待测病毒溶液中加入杂蛋白，再添加PEG后，离心获得沉淀，再将沉淀进行复溶，即可。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，步骤A中，所述关联公式为：
C＝a×PA+b
其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述各标准样品和经预处理后的待测病毒溶液的溶液体系相同。
4.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述HPLC测定时，采用的色谱柱为Agilent Bio SEC系色谱柱。
5.根据权利要求4所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述Agilent Bio SEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径
Figure FDA0002256044400000011
6.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述杂蛋白在待测病毒溶液中的终浓度为0.5～10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述杂蛋白的分子量为10～200kD。
8.根据权利要求1、6-7任一项所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述杂蛋白包括白蛋白、细胞因子、抗体分子，及重组表达的非酶类蛋白质。
9.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述离心的条件为：2～10℃下，3000～10000g离心15～60分钟。
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