CN109387581B - 一种口蹄疫抗原的定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，包括以下步骤：配置不同电导、不同抗原浓度的口蹄疫抗原标准溶液样品，测定各标准溶液样品的HPLC吸收峰面积，获得口蹄疫抗原浓度与HPLC吸收峰面积及电导之间的关联公式；对待测口蹄疫抗原样品的电导进行测定和HPLC吸收峰面积进行测定；根据关联公式，通过测定的电导和HPLC吸收峰面积对口蹄疫抗原浓度进行计算，即得口蹄疫抗原浓度。本发明解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。
Description
技术领域
本发明涉及口蹄疫抗原的定量分析技术领域，具体涉及一种口蹄疫抗原的定量方法。
背景技术
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。目前，疫苗免疫是口蹄疫诸多防制措施中最重要也是最成功的措施之一，其中常规灭活疫苗是当前口蹄疫免疫防控的最主要疫苗。
口蹄疫抗原146S定量分析方法目前以蔗糖梯度密度为主，检测程序复杂，不适合快速检测。而开发利用高效液相层系统(HPLC)进行定量已成为口蹄疫抗原定量的趋势。专利CN104634891A中公开了一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146S测定方法，选取了分子量分离范围为2×104-1×107Da的色谱柱，在高效液相色谱仪上对被检测的样品进行色谱分离，用于口蹄疫抗原含量的鉴定。然而，该方法在实际操作时，和普遍的HPLC方法一样，当待测定样品的电导不同时，其测得的样品浓度出现明显浮动。即待测样品的电导可明显影响HPLC的定量结果。发明人在前期进行了如下试验：分别采用浓度为5μg/mL的标准口蹄疫疫苗抗原146S样品制备成不同氯化钠浓度(电导分别为：5mS/cm和54.6mS/cm)的标准样品，采用专利CN104634891A中的方法进行定量分析，结果分别为4.8μg/ml和7.9μg/mL。其结果偏差可达33％,不能用于口蹄疫抗原含量的准确测定。在口蹄疫抗原的制备过程溶液电导会随加工流程发生变化，以及产品批次的电导也会发生偏差，由此导致在实际操作中，仍存在结果的准确性不高的问题。且发明人前期利用三根全新的TSK-G4000SWXL色谱柱对破乳疫苗进行反复检测中，其使用寿命分别为312次，241次，449次，色谱柱使用寿命短主要是葡聚糖凝胶的耐压性差，易被破乳样品中残留的佐剂污染，难以清洗造成。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：
A、配置不同电导、不同抗原浓度的口蹄疫抗原标准溶液样品，测定各标准溶液样品的HPLC吸收峰面积，获得口蹄疫抗原浓度与HPLC吸收峰面积及电导之间的关联公式；
B、对待测口蹄疫抗原样品的电导进行测定；
C、对待测口蹄疫抗原样品的HPLC吸收峰面积进行测定；
D、根据步骤A的关联公式，通过步骤B和C测定的电导和HPLC吸收峰面积对口蹄疫抗原浓度进行计算，即得口蹄疫抗原浓度。
优选地，步骤A中，所述配置的标准溶液样品数量不少于9个。确保结果的准确性。
优选地，步骤A中，所述关联公式为：
C＝(a×I+b)×PA+c×I+d
其中，C为抗原浓度，单位为μg/ml，I为样品电导，单位为mS/cm，PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a,b,c,d为常数，分别为a＝-1.71×10-5；b＝0.0567；c＝1.57×10-4；d＝0.517。
优选地，步骤C中，所述测定HPLC吸收峰峰面积时，采用的色谱柱为Agilent BioSEC系色谱柱。更优选为Agilent Bio SEC-5色谱柱。
优选地，所述Agilent Bio SEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径
优选地，所述采用Agilent Bio SEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含高盐或者低盐的磷酸缓冲溶液，pH7.0～8.5。
更优选地，所述采用Agilent Bio SEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液，其pH为7.2；流速为1ml/min；进样量为100μl；检测波长259nm。
本发明所述的定量方法不仅适用于口蹄疫抗原，还适用于其他病毒或亚病毒抗原的定量，均可达到相同的效果。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。
本发明采用Agilent Bio SEC系色谱柱，是硅胶系列属于硬胶，耐压性能远高于TSK G4000SWXL以及Superdex 200。Bio SEC-5比G4000SWXL的测定时间更短，可将检测时间从30分钟缩短到20分钟，使用寿命更长，TSK G4000SWXL检测破乳样品的次数在500次以内，500次以后完全失去分辨能力，而Bio SEC-5在1000次样品检测后依旧稳定，因此检测的综合成本更低。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中的口蹄疫抗原146S标准品HPLC检测图谱；
图2为实施例3中两个不同电导病毒样品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：
A、配置不同电导、不同抗原浓度的口蹄疫抗原标准溶液样品，测定各标准溶液样品的HPLC吸收峰面积，获得口蹄疫抗原浓度与HPLC吸收峰面积及电导之间的关联公式；
B、对待测口蹄疫抗原样品的电导进行测定；
C、对待测口蹄疫抗原样品的HPLC吸收峰面积进行测定；
D、根据步骤A的关联公式，通过步骤B和C测定的电导和HPLC吸收峰面积对口蹄疫抗原浓度进行计算，即得口蹄疫抗原浓度。
步骤A中，所述配置的标准溶液样品数量不少于9个。确保结果的准确性。
步骤A中，所述关联公式为：
C＝(a×I+b)×PA+c×I+d
其中，C为抗原浓度，单位为μg/ml，I为样品电导，单位为mS/cm，PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a,b,c,d为常数，分别为a＝-1.71×10-5；b＝0.0567；c＝1.57×10-4；d＝0.517。
步骤C中，所述测定HPLC吸收峰峰面积时，采用的色谱柱为Agilent Bio SEC系色谱柱。更优选为Agilent Bio SEC-5色谱柱。
所述Agilent Bio SEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径
所述采用Agilent Bio SEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含高盐或者低盐的磷酸缓冲溶液，pH7.0～8.5。
所述采用Agilent Bio SEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液，其pH为7.2；流速为1ml/min；进样量为100μl；检测波长259nm。
实施例1口蹄疫抗原标准品制备
1.材料
(1)检测样品：O型口蹄疫灭活疫苗
(2)仪器和试剂：离心机、PEG6000、正丁醇、氯仿
2.实验步骤
(1)灭活疫苗破乳：按照苗:正丁醇＝9:1向灭活疫苗中加入正丁醇，混匀，6000g，4℃，离心8min，用注射器吸取出下层水相。
(2)氯仿处理水相：向水相中加入10％氯仿，震荡混匀，6000g，4℃，离心5min，取上清。
(3)PEG6000浓缩病毒：向氯仿处理后的水相中加入PEG至其终浓度为7％，4℃静置18小时，然后4℃，8000g，离心50min，弃上清。用PBS重悬沉淀至原体积的1/10。
(4)蔗糖密度梯度离心：将沉淀复溶溶液加至15％～45％(w/v)的均匀的线性蔗糖密度梯度，10℃，35000rpm，离心2小时30分钟，选取25％～35％蔗糖浓度区域内OD259最高的区段。
(5)蔗糖的去除和溶液的置换：用截留分子量为100kD的超滤浓缩管，用PBS溶液(150mM NaCl)洗滤纯化和超滤浓缩蔗糖病毒溶液以去除蔗糖的残留并使病毒溶液电导接近PBS的电导值。用HPLC的方式确认病毒的纯度为100％(图1)，并用分光光度法测定样品浓度为400μg/mL，并通过体积换算氯仿处理后的破乳水相的样品浓度为4.4μg/mL。
实施例2高效液相色谱检测146S的标准曲线绘制
(1)用不同NaCl浓度的PBS(1000mM，750mM，500mM，250mM，150mM，50mM)按9:1的比例分别稀释实施例1制得的病毒标准样品至2μg/mL,5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL，获得不同浓度下不同电导(87.2mS/cm，72.9mS/cm，49.9mS/cm，26.0mS/cm，15.0mS/cm，4.7mS/cm)的一系列病毒标准样品。
(2)采用Agilent公司高效液相色谱系统，Agilent Bio SEC-5色谱柱对以上标准样品进行测定。流动相含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，进样量100μl，检测波长259nm。
(3)经高效液相色谱分析146S抗原为单一吸收峰，关联抗原浓度和不同电导率下的高效液相色谱积分面积获得标准品的关联曲线
C＝(-1.71×10-5I+0.0567)PA-1.57×10-4I+0.517
其中C为146S的浓度，单位为μg/ml，I为样品电导，单位为mS/cm，PA为吸收峰的峰面积，单位为mAU×s。所得标准曲线的R2＝0.99。
实施例3高效液相色谱检测高盐和低盐样品
(1)灭活疫苗破乳：按照苗:正丁醇＝9:1向灭活疫苗中加入正丁醇，混匀，6000g，4℃，离心8min，用注射器吸取出下层水相。
(2)氯仿处理水相：向水相中加入10％氯仿，震荡混匀，6000g，4℃，离心5min，取上清。
(3)蔗糖密度梯度离心法测定氯仿处理后的破乳水相的样品浓度为4.4μg/mL。将步骤(2)制得的氯仿处理水相分别添加等体积不同NaCl浓度的PBS缓冲液稀释至病毒浓度为2.2μg/mL，获得混合液1(NaCl浓度500mM)和混合液2(NaCl浓度50mM)。
(4)测定步骤(2)制得的混合液1和2的电导分别为54.5mS/cm和9.0mS/cm。
(5)采用高效液相色谱系统进行样品分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，色谱柱：Agilent Bio SEC-5，进样量100μl，检测波长259nm。测得混合液1和混合液2的峰面积如图2所示，分别为38.3mAU×s和30.7mAU×s。
(6)利用实施例2中的标曲公式得到混合液1和混合液2的抗原浓度分别为2.22μg/mL和2.19μg/mL，与稀释后的病毒原液2.2μg/mL相比误差小于1％。而采用单一电导(150mMNaCl)标准曲线(C＝0.0542PA+0.494)所换算得到的浓度分别为：2.57μg/mL和2.16μg/mL。与稀释后的病毒原液2.2μg/mL相比误差接近17％。
本实施例的结果说明，盐浓度(即电导)对HPLC法进行的样品浓度对应的特异性峰面积测定具有一定的影响，随盐浓度不同影响也会发生变化；只有对这一影响进行矫正才可使HPLC的测定变得更加准确。
实施例4高效液相色谱检测破乳疫苗样品及使用寿命
(1)灭活疫苗破乳：按照苗:正丁醇＝9:1向灭活疫苗中加入正丁醇，混匀，6000g，4℃，离心8min，用注射器吸取出下层水相。
(2)将破乳疫苗样品(即步骤1获得的水相)PBS缓冲液稀释后进行电导测定。
(3)采用高效液相色谱系统进行稀释后破乳疫苗样品的HPLC吸收峰面积测定。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：1ml/min，色谱柱：Agilent Bio SEC-5，进样量100μl，检测波长259nm。
(4)采用所述的高效液相色谱系统对该破乳疫苗样品进行连续性1000次分析，比对1000次结果，CV值小于5％。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A、配置不同电导、不同抗原浓度的口蹄疫抗原标准溶液样品，测定各标准溶液样品的HPLC吸收峰面积，获得口蹄疫抗原浓度与HPLC吸收峰面积及电导之间的关联公式；
B、对待测口蹄疫抗原样品的电导进行测定；
C、对待测口蹄疫抗原样品的HPLC吸收峰面积进行测定；
D、根据步骤A的关联公式，通过步骤B和C测定的电导和HPLC吸收峰面积对口蹄疫抗原浓度进行计算，即得口蹄疫抗原浓度；
步骤A中，所述关联公式为：
C＝(a×I+b)×PA+c×I+d
其中，C为抗原浓度，单位为μg/ml，I为样品电导，单位为mS/cm，PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a,b,c,d为常数。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，步骤A中，所述配置的标准溶液样品数量不少于9个。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述a,b,c,d分别为a＝-1.71×10-5；b＝0.0567；c＝1.57×10-4；d＝0.517。
4.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，步骤C中，所述测定HPLC吸收峰峰面积时，采用的色谱柱为Agilent Bio SEC系色谱柱。
5.根据权利要求4所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述色谱柱为AgilentBio SEC-5。
6.根据权利要求4或5所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述Agilent BioSEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径
7.根据权利要求4所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述采用Agilent BioSEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液，其pH为7.2；流速为1ml/min；进样量为100μl；检测波长259nm。
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