CN104818254A

CN104818254A - 离子交换色谱纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法

Info

Publication number: CN104818254A
Application number: CN201510228052.9A
Authority: CN
Inventors: 张松平; 苏志国; 杨延丽; 马光辉; 李�浩; 张焱
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明涉及一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法利用离子交换色谱填料上的带电基团与口蹄疫灭活病毒抗原溶液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原和杂蛋白质、核酸分离，从而达到提纯口蹄疫灭活病毒抗原的目的。该方法操作步骤少，工艺稳定，纯化速度快，口蹄疫灭活病毒抗原收率较高，且易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

Description

离子交换色谱纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法

技术领域

本发明涉及疫苗抗原分离纯化领域，具体地，涉及一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒疫苗抗原的色谱分离方法。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth DiseaseVirus,FMDV)引起的烈性传染病，主要感染对象为牛、羊、猪等偶蹄类动物。口蹄疫传染快，传播范围广，其疫情往往会给畜牧业带来巨大损失，也一直是国际卫生界关注的焦点。

目前口蹄疫疫苗是控制口蹄疫疫情的主要途径。现在使用的口蹄疫疫苗是通过摇瓶或悬浮法大规模的培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)，之后将活的口蹄疫病毒接种到细胞中，再将病毒收获后浓缩、化学试剂灭活，与缓冲液和佐剂混合后制成口蹄疫疫苗。

随着科学技术的发展，人们对疫苗的质量要求也越来越高。目前口蹄疫苗存在主要两个问题：1.免疫保护力不稳定，免疫后检测不到抗体或产生抗体的水平低，或者免疫期较短；2.安全性差，副反应强，表现为动物在注射疫苗后出现减食，停食甚至死亡等情况。其主要原因是现有的口蹄疫疫苗制备工艺多为传统方法，纯化工艺简单，细胞培养液及宿主细胞中的多种杂质及过敏性物质并未除去，且抗原含量较低。这一现状对我国口蹄疫疫情的控制及兽用疫苗产业的发展带来极大影响。

口蹄疫灭活病毒抗原主要是146S，也就是完整的口蹄疫病毒。其纯化方法主要包括聚乙二醇沉淀，超滤除杂，双水相萃取等。这些方法难以获得高纯度的口蹄疫疫苗抗原。蔗糖密度梯度离心法能获得高纯度的口蹄疫灭活病毒，但这种方法不仅成本高，且难以应用于工业化生产。

色谱技术是一种易于工业放大，且能进行精度纯化的技术。目前色谱技术在兽用疫苗领域应用尚较少。有专利报道采用凝胶过滤的方法来纯化口蹄疫病毒抗原(内蒙古必威安泰生物科技有限公司.口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用.中国发明专利:CN 102988970 B,2014-06-18.)。凝胶过滤最大的问题就是处理量小，料液的进料量仅为凝胶过滤柱体积的1/10，而且经过凝胶过滤后抗原的浓度会进一步下降，从而导致加工时间长，材料成本高，而且抗原在长时间的加工中也容易失去免疫活性。

本发明涉及一种适合于大规模从细胞培养液中提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法通过离子交换色谱填料上的带电基团与口蹄疫灭活病毒抗原溶液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原和杂蛋白质、核酸分离，从而达到提纯口蹄疫灭活病毒抗原的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫病毒抗原146S，同时具有高抗原收率的纯化方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

1.本技术发明的主要原理是以离子交换色谱为工具，通过离子交换色谱填料上的带电基团与口蹄疫灭活病毒抗原溶液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原和杂蛋白质、核酸分离，从而达到提纯口蹄疫灭活病毒抗原的目的。

2.这种离子交换色谱的模式可以是将离子交换色谱填料加入到含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液直接加入到装有离子交换色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。

3.所采用的离子交换色谱填料表面的离子交换基团为二乙基氨基乙基(DEAE)、季铵基(Q)、二乙基氨基丙基(ANX)、羧甲基(CM)、磺酸基(SP)。

4.溶液pH和电导率决定离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原或吸附杂质。

5.当用离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原时，细胞培养液的pH须调整为7.0～9.0、电导为1～7mS/cm；当用离子交换色谱吸附杂蛋白质和核酸而不吸附口蹄疫灭活病毒抗原时，细胞培养液的pH须调整为7.0～9.0、电导为10～40mS/cm。调节pH和电导所用的盐为磷酸盐，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，硫酸铵、氯化钠、氯化铵。

6.细胞培养液中的口蹄疫灭活病毒抗原146S的浓度为2-100μg/ml。为缩短色谱操作时间，可以采用截留分子量为50～300kDa的超滤膜对原料液进行超滤浓缩，以减少细胞培养液的体积；超滤时膜表面的切向流速为10～100cm/s，操作压力在0.3MPa以下。

7.色谱操作包括离子交换色谱填料的平衡、进料、淋洗、洗脱和填料的再生。具体可以将(5)所得的口蹄疫灭活病毒抗原物料进料至预先平衡的装有二乙基氨基乙基(DEAE)、季铵基(Q)、二乙基氨基丙基(ANX)、羧甲基(CM)或磺酸基(SP)的离子交换色谱柱中。经淋洗，洗脱，再生，并在色谱过程中收集穿透峰和洗脱峰进行146S抗原及蛋白浓度的检测；或将(5)所得物料与预先平衡的离子交换色谱填料混合后再装入色谱柱中，再进行淋洗，洗脱，再生操作。

8.上述平衡，淋洗和洗脱所用的溶液，当用离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原时，所用的平衡和淋洗缓冲液的电导为1～7mS/cm，pH 7.0～9.0，洗脱液的电导为10～40mS/cm，pH 7.0～9.0；当用离子交换色谱吸附杂蛋白质和核酸而不吸附口蹄疫灭活病毒抗原时，所用的平衡和淋洗缓冲液的电导为10～30mS/cm，pH7.0～9.0，洗脱液的电导为40～100mS/cm，pH 7.0～9.0。调节pH和电导所用的盐为磷酸盐，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，硫酸铵、氯化钠、氯化铵。

9.离子交换色谱填料再生所用的溶液为0.5～1M NaOH。

本发明具有以下特点：

(1)纯化工艺操作步骤少；

(2)抗原活性回收率较高，最高可达84％；

(3)无需超速离心设备，而采用常用色谱填料，成本相对较低；

(4)易于放大到工业化规模生产。

综上所述于，本发明提供了一种易于放大的，成本较低的分离纯化获得高收率的口蹄疫病毒抗原的方法，具有较大的实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1中，离子交换色谱纯化口蹄疫病毒抗原色谱图；

图2为实施例1中的SDS-PAGE电泳图，1为细胞培养液上清，2为离子交换色谱收集的组分；

图3为实施例1中，经过纯化后的口蹄疫病毒抗原高效液相凝胶过滤色谱检测结果。

具体实施方式

本发明的方法通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

取100mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8μg/mL。

使用截留分子量为50kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到10mL左右，少量多次加入80mL 20mM pH 7.0磷酸钠缓冲液稀释，继续浓缩至10mL左右至电导率约7.0mS/cm；超滤时膜流速为10cm/s，压力控制在0.3Mpa以下。口蹄疫病毒抗原终浓度为20μg/mL左右。

将上清液进料到预先用氯化钠调至电导7mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)平衡的DEAE Sepharose FF离子交换色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别用氯化钠调至电导为20mS/cm和80mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱图谱见图1。色谱填料采用0.5M氢氧化钠溶液再生。

分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为67％，纯化倍数为7.2。

对所得纯化的样品进行SDS-PAGE检测(图2)，检测到分子量介于25～35kDa的146S的三条亚基蛋白VP1，VP2，VP3，表明表明收集到的为146S抗原组分。高效液相凝胶过滤色谱检测表明纯化所得抗原为且为完整的病毒颗粒(图3)。

为进一步得到更高纯度的146S抗原，取10mL收集的洗脱峰样品，进料到Sephacral S-400凝胶过滤柱(GE Healthcare，60cm×2.6cm I.D.)，流速为3mL/min，流动相为含有0.15M氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2。分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到纯度大于98％以上的口蹄疫病毒抗原，所得抗原相对于细胞上清液的收率为54％。

实施例2

取100mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为4.5g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为21μg/mL，用20mM Tris-HCl缓冲液，pH 9.0稀释10倍至电导率为1mS/cm，抗原浓度约2μg/mL。

将上清液与预先用氯化铵调至电导1mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)平衡的Q Sepharose FF离子交换填料混合，100～200rpm搅拌吸附30min后，加至色谱柱中(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)。经继续淋洗后，依次用氯化铵调至电导为10～40mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用1M氢氧化钠再生。

分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为84％，纯化倍数为6.5。

实施例3

取1000mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8μg/mL。

使用截留分子量为300kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到20mL左右，少量多次加入100mL 20mM pH 8.0磷酸钠缓冲液稀释，继续浓缩至10mL左右至电导率约5.0mS/cm；超滤时膜流速为100cm/s，压力控制在0.3Mpa以下。口蹄疫病毒抗原终浓度为200μg/mL左右。

将上清液进料到预先用硫酸铵调至电导7mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的ANX Sepharose FF(high sub)离子交换色谱柱(GE Healthcare，15cm×1.6cmI.D.)，进料后经继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为10～40mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20％以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用1M氢氧化钠溶液再生。

分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为65％，纯化倍数为6.8。

实施例4

将上清液中加入硫酸铵至电导为10mS/cm，用盐酸调至pH 7.0，进料到预先用硫酸铵调至电导10mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)平衡的CM Sepharose FF离子交换色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，收集穿透峰，依次用硫酸铵调至电导为40～100mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗脱吸附在色谱填料上的杂质。色谱填料采用1M氢氧化钠溶液再生。

检测穿透组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为75％，纯化倍数为3.2。

实施例5

将上清液中加入氯化钠至电导为30mS/cm，用Tris-HCl缓冲液调至pH 9.0，进料到预先用氯化钠调至电导30mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)平衡的SPSepharose FF离子交换色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，收集穿透峰，依次用硫酸铵调至电导为40～100mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)洗脱吸附在色谱填料上的杂质。色谱填料采用1M氢氧化钠溶液再生。

检测穿透组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为78％，纯化倍数为3.4。

实施例6

取200mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8μg/mL。

使用截留分子量为300kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到20mL左右，然后加入氯化钠至电导为30mS/cm，用磷酸缓冲液调至pH 8.0，进料到预先用氯化钠调至电导30mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的DEAE SepharoseFF离子交换色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，收集穿透峰，依次用硫酸铵调至电导为40～100mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 9.0)洗脱吸附在色谱填料上的杂质。色谱填料采用1M氢氧化钠溶液再生。

检测穿透组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为68％，纯化倍数为5.4。

Claims

1.一种根据离子交换原理从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法，该方法以离子交换色谱为工具，通过离子交换色谱填料上的带电基团与口蹄疫灭活病毒抗原溶液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原和杂蛋白质、核酸分离，从而达到提纯口蹄疫灭活病毒抗原的目的。

2.根据权利要求1，离子交换色谱的模式可以是将离子交换色谱填料加入到含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液直接加入到装有离子交换色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。

3.根据权利要求1和2，溶液pH和电导率决定离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原或吸附杂质。

4.根据权利要求1，当用离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原的时候，细胞培养液的pH须调整为7.0～9.0、电导为1～7mS/cm。

5.根据权利要求1，当用离子交换色谱吸附杂蛋白质和核酸而不吸附口蹄疫灭活病毒抗原时，细胞培养液的pH须调整为7.0～9.0、电导为10～30mS/cm。

6.根据权利要求1和5，调节pH和电导所用的盐为磷酸盐，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，硫酸铵、氯化钠、氯化铵。

7.根据权利要求1，离子交换色谱填料表面的离子交换基团为二乙基氨基乙基(DEAE)、季铵基(Q)、二乙基氨基丙基(ANX)、羧甲基(CM)或磺酸基(SP)。

8.根据权利要求1，细胞培养液中的口蹄疫灭活病毒抗原146S的浓度为2-100μg/ml。

9.根据权利要求4，从离子交换色谱柱上洗脱口蹄疫灭活病毒抗原所用的洗脱液为电导为10～40mS/cm的缓冲液，pH 7.0～9.0。

10.根据权利要求5，从离子交换色谱柱上洗脱杂蛋白质和核酸所用的洗脱液为电导为40～100mS/cm的缓冲液，pH 7.0～9.0。