CN104560895A - 猪圆环病毒疫苗的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪圆环病毒疫苗的纯化方法。具体地，本发明的纯化方法包括以下步骤：(a)提供待纯化的原料：所述原料为含猪圆环病毒的液态样品；(b)将所述液态样品上样于离子交换柱，使得猪圆环病毒结合于所述的离子交换柱；(c)用洗脱缓冲液对离子交换柱进行洗脱，获得猪圆环病毒抗原。本发明方法猪圆环病毒抗原回收率高，纯度好，保持了良好的抗原活性，符合猪圆环病毒灭活疫苗半成品规格要求，为进一步制备免疫原性好、保护力强、毒副作用小的猪圆环病毒灭活疫苗提供了条件。

Description

猪圆环病毒疫苗的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术和兽医领域，具体地，本发明提供了一种兽用猪圆环病毒疫苗、及其纯化方法。

背景技术

猪圆环病毒病是影响我国养猪业的主要疾病之一，有效疫苗免疫是控制猪圆环病毒感染的关键。

传统疫苗的生产方法，具有操作简单、工艺经济等特点，但得到的粗制疫苗中抗原含量较低，且含有一些杂质(包括杂蛋白)和过敏性物质，易引起动物应激反应，且效价和质量都不稳定。

因此，本领域迫切需要研制和开发一种新的制备纯化的、精制的猪圆环病毒疫苗的方法，从而获得免疫原性好、保护性强、毒副作用小的疫苗。

发明内容

本发明的一个发明目的就是提供一种经纯化的、免疫原性好、保护性强、毒副作用小的猪圆环病毒疫苗及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种对猪圆环病毒进行纯化的方法，包括以下步骤：

(a)提供待纯化的原料，所述原料为含猪圆环病毒的液态样品；

(b)将所述液态样品上样于离子交换柱，使得猪圆环病毒抗原结合于所述的离子交换柱；

(c)用洗脱缓冲液对上样后的离子交换柱进行洗脱，从而获得含猪圆环病毒抗原的洗脱液。

在另一优选例中，步骤(a)中所述的原料为细胞培养的液态猪圆环病毒抗原。

在另一优选例中，步骤(a)中的含猪圆环病毒的液态样品是经灭活处理的，较佳地，所述的灭活处理包括β-丙內酯灭活。

在另一优选例中，步骤(a)中的所述的液态样品是经微滤处理的。

在另一优选例中，所述的液态样品是经浓缩处理后获得的浓缩液。

在另一优选例中，步骤(b)中，包括选自下组的一个或多个条件：

(i)上样液总体积与介质体积比为5-50：1(较佳地为10-20：1，更佳地为约15:1)；

(ii)离子交换介质为Diamond X树脂；

(iii)平衡所用的溶液为浓度0.5-1.5M(如约0.9M)NaCl的10-50mM(如约20mM)的磷酸盐缓冲液。

在另一优选例中，所述的离子交换介质选自下组Diamond X树脂。

在另一优选例中，在步骤(c)中，上样完毕后使用含0.09-0.12M NaCl的10-50mM磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，再使用含0.8-2.0M NaCl的10-50mM磷酸盐缓冲液洗脱并收集猪圆环病毒抗原。

在另一优选例中，所述方法还包括以下步骤：

(d)将步骤(c)中获得的洗脱液，上样于凝胶色谱柱并进行层析，从而获得纯化的、含猪圆环病毒的洗脱液。

在另一优选例中，步骤(d)中凝胶色谱层析条件为：将获得的离子交换柱层析的洗脱液上样于凝胶色谱柱，上样体积与介质体积比0.5-2：1-3(较佳地为约1:1.5)，凝胶色谱柱介质为Bestdex G25，上样完毕后使用0.01M PBS缓冲液洗柱，收集猪圆环病毒抗原洗脱峰。

在另一优选例中，从凝胶色谱层析柱获得的洗脱峰含猪圆环病毒抗原，杂蛋白去除率≥90％，抗原回收率≥80％。

在另一优选例中，所述方法还包括：将纯化的猪圆环病毒与药学上可接受的载体和任选的佐剂进行混合，从而制备疫苗组合物。

在本发明的第二方面，提供了一种制备猪圆环病毒疫苗的方法，包括步骤：用本发明第一方面所述的方法制备纯化的猪圆环病毒；和

纯化的猪圆环病毒与药学上可接受的载体和任选的佐剂进行混合，从而制备疫苗组合物。

在本发明的第三方面，提供了一种纯化的猪圆环病毒，所述的猪圆环病毒是用本发明第一方面任一方法所纯化获得的。

在另一优选例中，所述的纯化的猪圆环病毒中，杂蛋白的含量≤10％，更佳地≤5％。

在本发明的第四方面，提供了一种疫苗组合物，含有本发明第三方面所述的纯化的猪圆环病毒以及药学上可接受的载体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了离子交换柱柱效测定图谱。

图2显示了离子交换柱层析图谱，A峰为未被吸附的杂蛋白峰。B峰为以1MNaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱收集的猪圆环病毒抗原蛋白峰。

图3显示了凝胶色谱柱层析图谱，以0.01M磷酸盐缓冲液洗脱收集的猪圆环病毒抗原蛋白峰(箭头指出的峰)。

图4显示了Lowry法测定蛋白含量的标准曲线。

图5显示了15％SDS-PAGE电泳检测图。其中，图5A为考马斯亮蓝R-250染色；图5B为银染。

图5A中，泳道样品分别为(从左至右)：1-Marker(116KD、66.2KD、45.0KD、35.0KD、25.0KD、18.4KD、14.4KD)、2-猪圆环病毒原样、3--离子交换柱层析洗脱液、4-凝胶色谱柱层析洗脱液、5-分子筛柱层析峰2-1、6-分子筛柱层析峰2-2、7-原样浓缩后样品、8-浓缩洗柱、9-离子交换柱层析清洗液。

图5B中，泳道样品分别为(从左至右)：1-Marker、2-离子交换柱层析洗脱液、3-猪圆环病毒原样、4-9样品同左图。

图6显示了ELISA定性检测结果。

图7显示了分子筛柱层析图谱，其中箭头所指为各收集峰，含猪圆环病毒抗原的蛋白峰为峰2。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过对生产工艺的大量摸索，本发明人意料地发现，基于特定的色谱层析介质，可极其有效地将猪圆环病毒与其他杂质分离开，从而对疫苗进行高效精制纯化。由此，本发明提供一种免疫原性好、保护性强、毒副作用小的猪圆环病毒疫苗。在此基础上完成本发明。

如本文所用，术语“本发明层析介质”指可特异性地将猪圆环病毒与其他杂质有效分离的离子交换树脂，尤其是Diamond X系列树脂。

层析介质

本发明人筛选了各种不同的分离方法及分离介质，发现，一类特定的离子交换树脂(包括Diamond X系列)，与猪圆环病毒抗原的结合能力较其他介质更强，而该介质与绝大多数的其他杂质(包括过敏原蛋白等)则几乎不结合；由于猪圆环病毒抗原在离子交换柱上使用0.09-0.12M NaCl盐洗柱，可去除大量杂蛋白，进一步当使用高浓度的洗脱盐时，即0.8-2.0MNaCl洗脱时，可获得相对较纯的猪圆环病毒抗原，这就实现了原液大量、快速、有效纯化的目的。

适用于本发明的离子交换树脂包括Diamond X系列或类似性状的树脂。这些树脂可通过已知的方法制备或可通过市场购得。

在本发明中，层析介质的用量没有特别限制，通常可根据待纯化的原料中所含的猪圆环病毒数量而定。

通常，100g或ml的层析介质可一次吸附(或分离)约500-1000mg的猪圆环病毒。因此，对于细胞培养后获得的含猪圆环病毒的原料而言，通常对于约5L原料液而言，可用约100-2000ml的层析介质，较佳地约200-1000ml。

纯化方法

本发明提供了一种基于本发明上述的特定层析介质对猪圆环病毒进行纯化的方法，主要包括以下步骤：

(a)提供待纯化的原料，所述原料为含猪圆环病毒的液态样品；

(b)将所述液态样品上样于离子交换层析柱(作为第一层析柱)，介质为Diamond X，使得猪圆环病毒抗原结合于所述的离子交换柱；

(c)用洗脱缓冲液对上样后的离子交换柱进行洗脱，从而获得猪圆环病毒抗原。清洗和平衡可用常规方法，一种优选的清洗和平衡的操作如下：用约1.5-3倍柱体积的0.5-1.5M NaOH清洗消毒，接触时间约0.5-4h，然后用2-5倍柱体积的平衡缓冲液来平衡。

在本发明的一个优选例中，平衡步骤中所用的缓冲液为缓冲液A，其组分为0.05-0.10M NaCl，10-50mM(较佳地15-30mM)磷酸盐缓冲也，pH约6.0±0.1,电导约12.4ms/cm。

在步骤(b)，可以将待纯化的含猪圆环病毒的原料(液态)上样于经清洗和平衡处理的离子交换柱，其中，上样速度没有特别限制，通常对于约500ml的层析介质而言，流速可以为10-100ml/min，较佳地为20-60ml/min。

上样后，可用性质与平衡处理中所用的缓冲液性质相近或相同的缓冲液进行清洗，从而将未结合的杂质清洗掉。经清洗后，可用洗脱缓冲液进行洗脱处理，从而使得结合的猪圆环病毒从所述层析介质上。在该步骤中，洗脱速度没有特别限制，通常对于约500ml的层析介质而言，流速可以为10-100ml/min，较佳地为20-60ml/min。

在洗脱过程中，可以监测流出液的pH和/或电导率等参数，以便更精准地收集含猪圆环病毒抗原的洗脱峰。

在本发明的一个优选例中，洗脱步骤中所用的洗脱缓冲液为缓冲液B，其组分为约0.5-5M(较佳地0.75-2.5M，更佳地0.8-2.0M)NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH约6.5±0.1,电导约81-86ms/cm。

优选地，本发明方法还包括进一步的纯化步骤，例如再次用离子交换层析柱进行纯化，或用其他方法进行纯化。

一种优选的进一步纯化可通过凝胶层析进行，例如凝胶色谱柱(可作为第二层析柱)；更佳地，所述的凝胶色谱柱的层析介质为Bestdex G25。

纯化的猪圆环病毒以及疫苗组合物

本发明还提供了用本发明方法制备的高纯度的猪圆环病毒以及含有所述猪圆环病毒的疫苗组合物。

经测定，本发明制备的猪圆环病毒的纯度高，杂蛋白去除率远大于90％，故杂蛋白的残留量远小于10％，更佳地≤5％。

本发明制备的猪圆环病毒(灭活)可作为免疫原，用于激发动物产生针对猪圆环病毒的免疫反应，从而保护动物(猪)免受猪圆环病毒的感染。

一种优选的组合物是预防性的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价的疫苗组合物。

这些疫苗包含本发明制备的高纯度猪圆环病毒，并通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。

增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)ISA720佐剂；(3)福氏佐剂等。

本发明的疫苗组合物(包括猪圆环病毒，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的猪圆环病毒，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据动物(如猪)的生理状况、免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度及其它的相关因素而定。

在本发明中，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或乳化液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。

常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明方法可制得抗原性好、保护性强、毒副作用小的猪圆环病毒疫苗。经上述纯化获得的猪圆环病毒抗原外观清澈透明，无沉淀。经Lowry法测定抗原回收率大于80％，杂蛋白去除率大于90％。

(b)节省了大量的人力物力，操作简便，操作周期短；

(c)技术设备简单，成本要求低；

(d)分离纯化结果重复性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

在实施例中，所用的分离介质为常规的市售产品。

实施例1

样品的预处理

将含猪圆环病毒的细胞培养液微滤后，经β-丙内酯灭活，共5L，进行浓缩，采用中空纤维5KD，将5L样品浓缩至500ml，4℃保存备用：步骤如下：

(1)用1M NaOH清洗中空纤维柱，低流速，清洗1h-2h，在超滤工作状态时，关闭出水口，全部开启浓缩液出口阀门，进行膜表面的清洗；

(2)用注射用水循环洗膜，清洗至中性；

(3)样品浓缩：上样开始时，中空纤维两端无压力，先用样品循环一段时间，再控制两端压力差浓缩样品。当样品浓缩至200ml左右时，把中空纤维中样品全部抽至浓缩瓶中，，继续用300ml注射用水循环冲洗中空纤维柱，回收样品600ml。

实施例2

离子交换色谱柱纯化

在本实施例中，对于实施例1中制得的浓缩样品，用特定层析介质(DiamondX)进行离子交换柱层析纯化。

一、试剂

1.层析柱：BXK50/30

2.介质：离子交换介质Diamond X

3.缓冲液A：0.09M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液。

缓冲液B：1M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液。

二、装柱以及测定柱效：

方法如下：

(1)取清洗后介质沉降胶，与纯化水混合，制成70％的胶悬液，在层析柱中自然沉降。

(2)第一步压柱：10ml/min(30cm/h)压柱80min。缓冲液：纯化水。

(3)第二步压柱：100ml/min(300cm/h)压柱10min。缓冲液：纯化水。

(4)测定柱效：缓冲液：100mM NaCl

样品：1.0M NaCl

上样量：35ml(柱体积的1％)

上样流速：10ml/min

柱效测定的结果如图1所示，其中，测得的柱效为：4082，对称因子：1.25，柱高：19.5cm。

三、纯化

上样量为离子交换柱介质的15倍。上样后，记录仪出现A峰，为未被吸附的杂蛋白峰，上样完毕后以0.09M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗柱，洗脱的仍为杂蛋白。A峰完全洗脱完毕后以1M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱收集抗原峰B峰(图2)。

实时监控流出液pH和电导，按UV峰收集样品。

四、结果

结果如图2所示，A峰为杂蛋白峰，B峰为猪圆环病毒抗原蛋白峰。共收集300ml洗脱液。

经测试，经所述离子交换柱纯化后，杂蛋白的去除率远大于95％(见测试实施例1的表2)。

实施例3

凝胶色谱柱层析纯化

一、材料

1.层析柱：BXK50/30和BXK50/20

2.介质：Bestdex G25

3.缓冲液：0.01M PBS缓冲液

二、方法

1.装柱：

(1)取清洗后介质沉降胶，与纯化水混合，制成70％的胶悬液，在层析柱中自然沉降。

(2)第一步压柱：10ml/min(30cm/h)压柱。缓冲液：纯化水。

(3)第二步压柱：50ml/min(150cm/h)压柱。缓冲液：纯化水。

2.色谱层析

用2倍柱体积的1M NaOH清洗消毒，接触时间2h，然后缓冲液平衡，流速为30ml/min。将实施例2中经离子交换柱层析所得洗脱液进行缓冲液置换，上样体积约为介质体积的0.7倍，上样流速为30ml/min，上样后用0.01MPBS缓冲液洗柱，监测UV变化，根据UV峰收集样品。

三、结果

对200ml进行缓冲液置换，结果如图3所示，洗脱后得280ml样品。

对比例1

分子筛柱层析不能有效分离猪圆环病毒

重复实施例2，不同点在于：选用分子筛柱层析，介质为Bestarose 6FF。

一、材料

1层析柱：BXK200/950

2介质：Bestarose 6FF

3缓冲液：0.01M PBS缓冲液

二、装柱：

(1)取清洗后介质沉降胶，与8.5L左右的纯化水混合，制成70％的胶悬液，在层析柱中自然沉降。

(2)第一步压柱：250ml/min(48cm/h)压柱100min。缓冲液：纯化水。

(3)第二步压柱：1L/min(190cm/h)压柱40min。缓冲液：纯化水。

(4)测定柱效：缓冲液：100mM NaCl

样品：1.0M NaCl

上样体积为分子筛柱床体积的1/100。上样后以0.01MNaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱。

分子筛柱柱效的测定结果表明，其柱效为3384，对称因子：1.21，柱高：61.7cm。

三、纯化

(1)清洗和平衡：用2倍柱体积的1M NaOH清洗消毒，接触时间2h，然后用缓冲液平衡，流速为100ml/min。

(2)上样：将实施例1中处理回收后的样品600ml，以100ml/min流速上样。

(3)清洗：0.1M PBS缓冲液清洗，以100ml/min流速清洗。

从平衡开始至清洗结束UV峰回落至基线，实时监控流出液pH和电导，按UV峰收集样品。

四、结果

如图7所示，按峰收集，每1L收集一次，经过ELISA检测(见测试实施例3.ELISA定性检测)显示目的抗原在峰2中，箭头所指即为目的峰，共收集2L。由于猪圆环病毒的峰很平坦，因此分离效果差。

该结果表明，采用分子筛柱层析时的分离效果较差。

对比例2

重复实施例2，不同点在于：用市售的离子交换介质SPFF替换实施例2中的离子交换介质Diamond X。

结果表明，采用该离子交换柱的分离效果远低于本发明，杂蛋白去除率仅为约60％。

对比例3

重复实施例2，不同点在于：用市售的离子交换介质MMA替换实施例2中的离子交换介质Diamond X。

结果表明，采用该离子交换柱的分离效果远低于本发明，杂蛋白去除率仅为55％。

测试实施例1

对分离效果的检测和评价

1.杂蛋白去除率

用常规的Lowry法测定蛋白含量，从而计算出各分离方法的杂蛋白去除率。结果如表1和表2所示。

表1 标准曲线中蛋白浓度-OD750对应关系

蛋白浓度(mg/ml)	0	0.1	0.2	0.25	0.5	0.75	1
								OD750	0	0.04	0.073	0.092	0.182	0.265	0.35

相应的标准曲线如图4所示。

表2 蛋白浓度测定结果

由上表可知，经离子交换柱纯化，杂蛋白去除率达95％以上。

另外，经离子交换柱和凝胶色谱柱纯化后，杂蛋白去除率可远高于98％。

2.SDS-PAGE电泳

对于实施例2、实施例3和对比例1的获得的样品，还用常规的15％SDS-PAGE电泳法进行检测。

结果如图5所示。左图为考马斯亮蓝R-250染色；右图为银染。左图中泳道样品分别为(从左至右)：1-Marker(116KD、66.2KD、45.0KD、35.0KD、25.0KD、18.4KD、14.4KD)、2-原样、3-离子交换柱洗脱、4-凝胶色谱柱洗脱、5-分子筛柱洗脱峰2-1(对比例1)、6-分子筛柱洗脱峰2-2(对比例1)、7-原样浓缩后样品、8-浓缩洗柱、9-离子交换柱清洗；右图中泳道样品分别为(从左至右)：1-Marker、2-离子交换柱洗脱、3-原样、4-9样品同左图。

该结果表明，层析纯化可去除大量杂蛋白。

3.ELISA定性检测

对于实施例2、实施例3和对比例1的获得的样品，经常规的ELISA法进行检测。方法如下：

将ELISA检测试剂盒中的酶标板及所用试剂放置于室温，加200ul洗涤液于酶标板中，室温浸泡5min，排除洗液，吸水纸上轻叩甩干。将待检样品加至孔中，同时设阴性对照和阳性对照，置于37℃作用1h。作用完后用洗液清洗3次，加入酶标抗体，37℃作用1h。进行底物显色。终止后在酶标仪上读值。

结果如图6所示，其中，各孔对应的样品如下表3所示：

表3 纯化收集样品在酶标板上的对应孔

如表所示，原样为A1；浓缩后为B1，透过液C1为实施例1中的中空纤维滤出弃掉的液体收集后检测；D1为浓缩后清洗中空纤维后收集的样品；峰1-峰5为对比例1中分子筛柱纯化所收集的样品；FT1-FT5及W1、W2为实施例2中离子交换柱纯化所得流穿液和清洗。其中阳性对照和阴性对照为ELISA检测试剂盒自带试剂。

图6结果表明，G1和H1孔均为阳性，因此，分子筛柱纯化获得抗原蛋白峰为峰2(见图7)。

比较显著的是，在实施例2所用的特定离子交换色谱层析方法中，样品FT1-FT5和W所对应的孔均为阴性，说明在实施例2进行的离子交换过程中无目的抗原的流失(流穿液和清洗回收液中几乎不含猪圆环病毒)。对离子交换柱纯化(实施例2)和凝胶色谱柱纯化后(实施例3)所得洗脱峰检测，其ELISA结果均为阳性，且从ELISA结果看出离子交换柱纯化效果优于分子筛柱纯化。结果见下表4所示。

4.ELISA值结果

表4 纯化最终样品ELISA结果

实施例5

大规模制备

重复实施例2和3，不同点在于，离子交换柱柱床体积为5L，凝胶色谱柱柱床体积为20L。

一、预处理

将细胞培养的猪圆环病毒原液经微滤后，4℃保存备用。

二、离子交换柱层析

1.层析柱

介质：离子交换介质(Diamond X)，体积5L。

体积：5L

上样量为离子交换柱介质的15倍。上样后，记录仪出现A峰，为未被吸附的杂蛋白峰，上样完毕后以0.09M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗柱，洗脱的仍为杂蛋白。A峰完全洗脱完毕后以1M NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱收集抗原峰B峰(图2)。

三、凝胶色谱柱层析

离子交换柱获得的猪圆环病毒抗原B峰，进一步经凝胶色谱柱纯化，介质为G25，先以0.01M PBS缓冲液平衡柱床，样品分两次上样，上样完称后继续用0.01M PBS缓冲液清洗，当记录仪上UV峰上扬时，收集抗原峰。

四、结果

纯化各步骤需留样用于检测，采用Lowry法测定各步骤中蛋白总含量，并计算杂蛋白去除率，用ELISA法测定抗原效价计算抗原收率。

表5 收集体积及实验操作情况

(A)杂蛋白去除率

结果如下：

表6 样品杂蛋白去除率结果

(B)抗原收率

方法如下：通过ELISA测定确定收率。该方法为半定量测定方法，且根据(纯化后效价×纯化后体积)/(原样体积×原样效价)由滴度确定收率存在问题，实验过程中离子交换柱浓缩倍数为5-6倍，所以洗脱液效价：原液效价约为5：1或6：1，按此方法计算收率可达90％以上，而ELISA测定时洗脱液稀释率为2560和5120是原样的4倍和8倍，计算时相应换算，离子交换柱到凝胶色谱柱的纯化应为等量纯化。

抗原收率如下表所示：

表7 样品效价及收率

注：A柱为离子交换柱，B柱为凝胶色谱柱

本实施例结果表明，采用本发明方法，杂蛋白去除率在90％以上，病毒的回收率为85％或更高。经离子交换柱和凝胶色谱柱纯化得到的样品无色透明、澄清，达到设计要求，与小试实验结果基本相符。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对猪圆环病毒进行纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)提供待纯化的原料，所述原料为含猪圆环病毒的液态样品；

(b)将所述液态样品上样于离子交换柱，使得猪圆环病毒抗原结合于所述的离子交换柱；

(c)用洗脱缓冲液对上样后的离子交换柱进行洗脱，从而获得含猪圆环病毒抗原的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的原料为细胞培养的液态猪圆环病毒抗原。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，包括选自下组的一个或多个条件：

(i)上样液总体积与介质体积比为5-50：1(较佳地为10-20：1，更佳地为约15:1)；

(ii)离子交换介质为Diamond X树脂；

(iii)平衡所用的溶液为浓度0.5-1.5M NaCl的10-50mM的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，上样完毕后使用含0.09-0.12M NaCl的10-50mM磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，再使用含0.8-2.0MNaCl的10-50mM磷酸盐缓冲液洗脱并收集猪圆环病毒抗原。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(d)将步骤(c)中获得的洗脱液，上样于凝胶色谱柱并进行层析，从而获得纯化的、含猪圆环病毒的洗脱液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，从凝胶色谱层析柱获得的洗脱峰含猪圆环病毒抗原，杂蛋白去除率≥90％，抗原回收率≥80％。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将纯化的猪圆环病毒与药学上可接受的载体和任选的佐剂进行混合，从而制备疫苗组合物。

8.一种制备猪圆环病毒疫苗的方法，其特征在于，包括步骤：用权利要求1-6中任一所述的方法制备纯化的猪圆环病毒；和

纯化的猪圆环病毒与药学上可接受的载体和任选的佐剂进行混合，从而制备疫苗组合物。

9.一种纯化的猪圆环病毒，其特征在于，所述的猪圆环病毒是用权利要求1-6中任一方法所纯化获得的。

10.一种疫苗组合物，其特征在于，含有权利要求9所述的纯化的猪圆环病毒以及药学上可接受的载体。