CN106279376A - 一种猪圆环病毒抗原纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒抗原纯化方法，该技术方案主要先通过菲托滤板对病毒原液进行澄清处理，较之于常规的离心澄清方式抗原流失率更低，澄清效果更好。在此基础上本发明基于实验方法选择以孔径为100～300KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，相对于膜包浓缩而言回收率较高同时杂蛋白的残留量较低。最后，本发明选用Sepharose 4FF对浓缩病毒液进行纯化，并匹配了适宜的操作条件。本发明通过改进PCV2病毒液下游纯化工艺，杂蛋白去除率高达99.35％，有效抗原含量高达79.31％，将引起疫苗副反应的杂质水平降至更低，提高了安全性的同时保持了疫苗良好的免疫原性。

Description

一种猪圆环病毒抗原纯化方法
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒抗原纯化方法。
背景技术
目前，以常规生产工艺流程制备的圆环病毒灭活疫苗临床应用有一定的副反应，主要认为与病毒抗原中所含的抗原外成分有关。这些成分包括：病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留；防腐剂(如硫柳汞)等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的效力。
以灭活全病毒作为抗原的纯化工艺主要以高速离心澄清、纱布过滤和膜包浓缩工艺为主，由于抗原的培养效价较低，经过膜包浓缩后，抗原的有效浓度提升，同时有害物质残留量浓度也升高，从而导致疫苗产品存在安全性隐患。因此，对灭活疫苗而言，尽可能提高抗原纯度，对于制品的安全性有非常重要的意义。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪圆环病毒抗原纯化方法，已接近现有技术中猪圆环病毒抗原的纯化方法纯度较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是因现有技术的猪圆环病毒抗原的纯化方法难以保证产物纯度，因此会导致疫苗安全性风险。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种猪圆环病毒抗原纯化方法，包括以下步骤：
1)取猪圆环病毒培养液，利用孔径为0.5～6μm的菲托滤板过滤；
2)将步骤1)所得产物利用孔径为100～300KD的中空纤维柱超滤浓缩，即得到病毒浓缩液；
3)向步骤2)所得的病毒浓缩液中加入终浓度为0.1％(v/v)的BPL，在4℃条件下灭活48h，再在37℃条件下水浴2h，即得到猪圆环病毒灭活浓缩液；
4)取步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液过琼脂糖凝胶层析柱，而后洗脱猪圆环病毒抗原蛋白。
作为优选，所述利用孔径为0.5～6μm的菲托滤板过滤具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对菲托滤板进行浸泡处理5min，而后用无菌1mol/L PBS溶液对菲托滤板进行冲洗，直至pH为6.8～7.2，而后将猪圆环病毒培养液通过菲托滤板过滤。
作为优选，步骤2)具体包括以下操作：组装中空纤维柱，用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对中空纤维柱浸泡15min，而后从中空纤维柱冲洗直至pH为6.8～7.2，而后利用100～300kD中空纤维膜将步骤1)所得产物浓缩2～10倍。
作为优选，步骤4)所述的琼脂糖凝胶层析柱型号为Sepharose 4FF。
作为优选，步骤4)所述洗脱猪圆环病毒抗原蛋白，是收集OD280波长处的第一洗脱峰。
作为优选，步骤4)具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗20～30min，而后琼脂糖凝胶层析柱琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗直至pH为6.8～7.2；将层析柱进液管连接至蠕动泵、出液管连接至紫外蛋白检测仪，开启蠕动泵设置流速v＝1.56πr2ml/min，用1mol/L PBS进行柱平衡直至紫外检测OD280基线平稳，暂停蠕动泵；将蠕动泵进液管插入步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液中启动蠕动泵开始上样，控制上样量在5％柱床体积；上样结束后暂停蠕动泵，将其进液管移入无菌1mol/L PBS中启动蠕动泵进行洗脱；紫外检测OD280值增加时开始收集第一洗脱峰，OD280值降至最低时停止收集；继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体。
作为优选，还包括步骤5)：对步骤4)所得产物分别通过BCA法检测蛋白含量，通过双抗体夹心法抗原浓度。
在以上技术方案中，所述BPL是β-丙内酯；所述流速公式v＝1.56πr2ml/min中，r表示层析柱半径。
本发明提供了一种猪圆环病毒抗原纯化方法，该技术方案主要先通过菲托滤板对病毒原液进行澄清处理，较之于常规的离心澄清方式抗原流失率更低，澄清效果更好。在此基础上本发明基于实验方法选择以孔径为100～300KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，相对于膜包浓缩而言回收率较高同时杂蛋白的残留量较低。最后，本发明选用Sepharose 4FF对浓缩病毒液进行纯化，并匹配了适宜的操作条件，实验结果显示当采用5％上样量的情况下抗原回收率可达99.46％，蛋白去除率可达97.04％。本发明以创新性的技术改进实现了良好的技术效果，同时操作简便、成本较低，具有良好的推广前景。
本发明通过改进PCV2病毒液下游纯化工艺，杂蛋白去除率高达99.35％，有效抗原含量高达79.31％，将引起疫苗副反应的杂质水平降至更低，提高了安全性的同时保持了疫苗良好的免疫原性。由于PCV2病毒疫苗接种对象为猪群，高质量的产品必将大大降低接种猪群的副反应程度和概率，成为养殖户和科研人员所欢迎的产品，能产生较高的社会效益和经济效益。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1(PCV2抗原的澄清工艺)
一、离心澄清工艺
取微载体培养病毒液，反复冻融3次。将收获到的细胞毒8000～10000r/min离心30min，弃去细胞碎片等沉淀；上清保留作为澄清抗原。
二、滤板澄清工艺
1系统预处理
将滤板模块CH70(P)(1.5-3μm)装入简易装置中，组装完毕后用无菌0.5mol/LNaOH溶液对系统进行浸泡处理5min。用无菌1mol/L PBS溶液对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。
2澄清过程
毒液通过CH70(P)(1.5-3μm)滤板进行澄清处理得到澄清液。
三、PCV2抗原澄清效果评价
通过蛋白含量检测(BCA法)、有效抗原浓度检测(双抗体夹心法)评价PCV2抗原澄清效果。见表一。
表一离心处理、滤板澄清效果比较
由上表可知，澄清液的蛋白浓度总体低于病毒原液，说明澄清处理起到了一定的杂蛋白去除效果；但与滤板澄清液几乎无有效抗原损失相比，离心处理的澄清液有效抗原回收率为89％，说明传统的澄清方式存在的有效抗原流失的问题很大，所以滤板整体澄清效果更好。随着滤板孔径大小的变化，孔径越小，杂蛋白去除率越高，成梯度上升。说明孔径越小，杂蛋白去除效果越佳。但孔径越小，越容易堵膜，耗费时间长，澄清效率降低。结合过滤效率、杂蛋白除去率，有效抗原的留存效果，我们选定用滤板70#[CH70(P)(1.5-3μm)]来开展将来的微载体培养病毒液的澄清工艺。
实施例2(PCV2抗原的浓缩工艺)
一、超滤膜包浓缩工艺
1超滤膜包浓缩工艺研究
1.1系统预处理
按超滤膜包装说明书的要求安装膜包，组装完毕后用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行循环冲洗20min。用无菌1mol/L PBS溶液对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。
1.2浓缩过程
将进液管和回流管连接到病毒液罐，透过管连接到废液罐。打开回流和透过口的阀门。把泵速调到最低。将滤板处理病毒液加入到浓缩瓶中。启动泵，缓慢提高泵速，增加进口压力。浓缩期间调节泵速，维持进口压力1kg/cm2(15psi)。将病毒液浓缩至原液体积的1/2、1/5、1/10，分别取1/2、1/5、1/10浓缩液留样。收集浓缩后病毒液置-20℃保存。用无菌1mol/L PBS清洗膜堆，收集清洗液，准备检测。
二、中空纤维浓缩工艺研究
1中空纤维膜浓缩工艺研究
1.1系统预处理
用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行浸泡处理至少15min。用灭菌1mol/L PBS对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。
1.2浓缩过程
取滤板过滤液，通过100kD中空纤维膜进行纯化处理，将毒液分别浓缩2、5、10倍，分别留存浓缩液及透过液，准备检测。
三、PCV2抗原浓缩效果评价
通过蛋白含量检测(BCA法)、有效抗原浓度检测(双抗体夹心法)评价PCV2抗原浓缩效果。以中空纤维和膜包100KD为例，见表二。
表二中空纤维柱与超滤膜堆浓缩效果比较
结果显示，在浓缩相同倍数的情况下，中空纤维的有效抗原回收率整体高于超滤膜包，杂蛋白去除率相对较低，但相差不多，在保证目的抗原有效回收的前提下，优选中空纤维作为病毒的浓缩工艺。随着浓缩倍数的增高，有效抗原回收率越低，而杂蛋白去除率则越高。结合中空纤维100KD不同浓缩倍数的浓缩时长，综合考虑，中空纤维100KD浓缩5倍时杂蛋白去除率效果较好且有效抗原回收率有明显优势，浓缩效率更高，耗时较短，对未来的扩大生产更有优势，故优选中空纤维100KD浓缩5倍时是最佳的毒液浓缩方案。
实施例3(PCV2抗原的精细纯化工艺)
一、系统预处理
用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行循环冲洗20～30min。用灭菌1mol/LPBS对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。
二、精细纯化过程
将层析柱进液管连接至蠕动泵，出液管连接至紫外蛋白检测仪(可连接电脑采集数据或记录仪进行记录)。开启蠕动泵设置流速v＝1.56πr2ml/min(r表示层析柱半径)，用1mol/L PBS进行柱平衡直至紫外检测OD280基线平稳，暂停蠕动泵。将蠕动泵进液管插入灭活后的抗原浓缩液中启动蠕动泵开始上样，控制上样量在5％柱床体积。上样结束后暂停蠕动泵，将其进液管移入无菌1mol/L PBS中启动蠕动泵进行洗脱。紫外检测OD280值增加时开始收集第一洗脱峰，OD280值降至最低时停止收集。继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体，进行下一次上样。
从收集液中取出1.0～2.0ml样品，留作各项检测用。
三、PCV2抗原精细纯化效果评价
通过蛋白含量检测(BCA法)、有效抗原浓度检测(双抗体夹心法)评价PCV2抗原精细纯化效果。见表三。
表三5％柱体积上样通过Sepharose 4FF填料的精纯效果
由上表可知，使用4FF作为层析介质时，5％上样量的抗原回收率是99.46％，蛋白去除率为97.04％，结果证明Sepharose 4FF分子筛层析的杂蛋白去除率很高，但上样量越大，有效抗原回收率降低明显，加上上样量越大耗时越长，精纯效率越低。故确定5％柱体积上样为最佳分子筛4FF纯化上柱体积。
实施例4(PCV2抗原小试纯化工艺研究)
根据实施例1～3确定的最优纯化工艺，具体工艺流程如下：
1.澄清：微载体培养病毒液经过70#滤板[CH70(P)(1.5-3μm)]处理。
2.浓缩：病毒培养原液经过膜孔径为100KD的中空纤维柱浓缩5倍得到病毒浓缩液。
3.灭活：病毒浓缩液加入1/1000终浓度的BPL,置于4℃经过48小时灭活,再经37℃水浴2小时进行水解得到病毒灭活浓缩液。
4.凝胶过滤层析：将病毒灭活浓缩液，按照5％柱体积上样层析柱，收获活性组分得到PCV2病毒纯化抗原。
5.检测：分部收集，进行相应指标测定。
据此工艺进行3批样品的重复验证试验，收集并比较数据。见表四。
表四3批次样品的重复验证试验和比较数据
结果显示，用本工艺制备的三批纯化后抗原制备的疫苗免疫保护效果达到规程的要求，经过纯化后病毒原液中的细胞碎片、杂蛋白等去除率达到99％以上，有效抗原回收率达到74％以上。纯化工艺稳定，除杂效果较好且最大程度保证了有效抗原的回收。
实施例5
一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取猪圆环病毒培养液，利用孔径为0.5μm的菲托滤板过滤；
2)将步骤1)所得产物利用孔径为100KD的中空纤维柱超滤浓缩，即得到病毒浓缩液；
3)向步骤2)所得的病毒浓缩液中加入终浓度为0.1％(v/v)的BPL，在4℃条件下灭活48h，再在37℃条件下水浴2h，即得到猪圆环病毒灭活浓缩液；
4)取步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液过琼脂糖凝胶层析柱，而后洗脱猪圆环病毒抗原蛋白。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述利用孔径为0.5μm的菲托滤板过滤具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对菲托滤板进行浸泡处理5min，而后用无菌1mol/L PBS溶液对菲托滤板进行冲洗，直至pH为6.8，而后将猪圆环病毒培养液通过菲托滤板过滤。
步骤2)具体包括以下操作：组装中空纤维柱，用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对中空纤维柱浸泡15min，而后从中空纤维柱冲洗直至pH为6.8，而后利用100kD中空纤维膜将步骤1)所得产物浓缩2倍。
步骤4)所述的琼脂糖凝胶层析柱型号为Sepharose 4FF。
步骤4)所述洗脱猪圆环病毒抗原蛋白，是收集OD280波长处的第一洗脱峰。
步骤4)具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗20min，而后琼脂糖凝胶层析柱琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗直至pH为6.8；将层析柱进液管连接至蠕动泵、出液管连接至紫外蛋白检测仪，开启蠕动泵设置流速v＝1.56πr2ml/min，用1mol/L PBS进行柱平衡直至紫外检测OD280基线平稳，暂停蠕动泵；将蠕动泵进液管插入步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液中启动蠕动泵开始上样，控制上样量在5％柱床体积；上样结束后暂停蠕动泵，将其进液管移入无菌1mol/L PBS中启动蠕动泵进行洗脱；紫外检测OD280值增加时开始收集第一洗脱峰，OD280值降至最低时停止收集；继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体。
还包括步骤5)：对步骤4)所得产物分别通过BCA法检测蛋白含量，通过双抗体夹心法抗原浓度。
实施例6
一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取猪圆环病毒培养液，利用孔径为6μm的菲托滤板过滤；
2)将步骤1)所得产物利用孔径为300KD的中空纤维柱超滤浓缩，即得到病毒浓缩液；
3)向步骤2)所得的病毒浓缩液中加入终浓度为0.1％(v/v)的BPL，在4℃条件下灭活48h，再在37℃条件下水浴2h，即得到猪圆环病毒灭活浓缩液；
4)取步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液过琼脂糖凝胶层析柱，而后洗脱猪圆环病毒抗原蛋白。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述利用孔径为6μm的菲托滤板过滤具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对菲托滤板进行浸泡处理5min，而后用无菌1mol/L PBS溶液对菲托滤板进行冲洗，直至pH为7.2，而后将猪圆环病毒培养液通过菲托滤板过滤。
步骤2)具体包括以下操作：组装中空纤维柱，用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对中空纤维柱浸泡15min，而后从中空纤维柱冲洗直至pH为7.2，而后利用300kD中空纤维膜将步骤1)所得产物浓缩2～10倍。
步骤4)具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗30min，而后琼脂糖凝胶层析柱琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗直至pH为7.2；将层析柱进液管连接至蠕动泵、出液管连接至紫外蛋白检测仪，开启蠕动泵设置流速v＝1.56πr2ml/min，用1mol/L PBS进行柱平衡直至紫外检测OD280基线平稳，暂停蠕动泵；将蠕动泵进液管插入步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液中启动蠕动泵开始上样，控制上样量在5％柱床体积；上样结束后暂停蠕动泵，将其进液管移入无菌1mol/L PBS中启动蠕动泵进行洗脱；紫外检测OD280值增加时开始收集第一洗脱峰，OD280值降至最低时停止收集；继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体。
实施例7
一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取猪圆环病毒培养液，利用孔径为3.5μm的菲托滤板过滤；
2)将步骤1)所得产物利用孔径为200KD的中空纤维柱超滤浓缩，即得到病毒浓缩液；
3)向步骤2)所得的病毒浓缩液中加入终浓度为0.1％(v/v)的BPL，在4℃条件下灭活48h，再在37℃条件下水浴2h，即得到猪圆环病毒灭活浓缩液；
4)取步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液过琼脂糖凝胶层析柱，而后洗脱猪圆环病毒抗原蛋白。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取猪圆环病毒培养液，利用孔径为0.5～6μm的菲托滤板过滤；
2)将步骤1)所得产物利用孔径为100～300KD的中空纤维柱超滤浓缩，即得到病毒浓缩液；
3)向步骤2)所得的病毒浓缩液中加入终浓度为0.1％(v/v)的BPL，在4℃条件下灭活48h，再在37℃条件下水浴2h，即得到猪圆环病毒灭活浓缩液；
4)取步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液过琼脂糖凝胶层析柱，而后洗脱猪圆环病毒抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于所述利用孔径为0.5～6μm的菲托滤板过滤具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对菲托滤板进行浸泡处理5min，而后用无菌1mol/L PBS溶液对菲托滤板进行冲洗，直至pH为6.8～7.2，而后将猪圆环病毒培养液通过菲托滤板过滤。
3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于步骤2)具体包括以下操作：组装中空纤维柱，用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对中空纤维柱浸泡15min，而后从中空纤维柱冲洗直至pH为6.8～7.2，而后利用100～300kD中空纤维膜将步骤1)所得产物浓缩2～10倍。
4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于步骤4)所述的琼脂糖凝胶层析柱型号为Sepharose 4FF。
5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于步骤4)所述洗脱猪圆环病毒抗原蛋白，是收集OD280波长处的第一洗脱峰。
6.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于步骤4)具体包括以下操作：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗20～30min，而后琼脂糖凝胶层析柱琼脂糖凝胶层析柱循环冲洗直至pH为6.8～7.2；将层析柱进液管连接至蠕动泵、出液管连接至紫外蛋白检测仪，开启蠕动泵设置流速v＝1.56πr2ml/min，用1mol/LPBS进行柱平衡直至紫外检测OD280基线平稳，暂停蠕动泵；将蠕动泵进液管插入步骤3)所得的猪圆环病毒灭活浓缩液中启动蠕动泵开始上样，控制上样量在5％柱床体积；上样结束后暂停蠕动泵，将其进液管移入无菌1mol/L PBS中启动蠕动泵进行洗脱；紫外检测OD280值增加时开始收集第一洗脱峰，OD280值降至最低时停止收集；继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体。
7.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒抗原纯化方法，其特征在于还包括步骤5)：对步骤4)所得产物分别通过BCA法检测蛋白含量，通过双抗体夹心法抗原浓度。
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