CN103480276B - 一种封闭式超滤管道系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种封闭式超滤管道系统，包括缓冲液容器、待浓缩液容器、最终收集液容器、浓缩液容器和超滤设备，容器顶盖上均设置有孔，有管道穿过孔从容器中引出；缓冲液容器引出的管道与待浓缩液容器引出的管道分别连接三通两个接口，三通的第三个接口通过泵和管道与另一三通连接；最终收集液容器和浓缩液容器引出的管道分别连接三通的两个接口，其第三个接口与三通的另一个接口连接；所述三通的第三个接口与连接超滤设备的回流管路连接。本发明提出的系统可简化生产步骤，使生产效率提高，其可拆卸清洁和组合后高压的超滤封闭式组合管道，便于清洁、高压，且保障了专管专用，可多次重复使用，降低了生产的成本，增加了疫苗无菌生产的可控性。

Description

一种封闭式超滤管道系统及其应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种病毒载体的纯化系统及其应用。

背景技术

在疫苗生产的工序中，需要对所收获的病毒液进行纯化以去除非抗原类的杂分子物质，获得较纯的抗原用来制备疫苗终产品。在病毒纯化的工艺中，超滤浓缩和透析为常用的方法。在病毒的浓缩和提纯工艺中，需要向病毒液中加入外源性的物质，比如沉淀工艺中引入的PEG6000，抽提工艺中引入的三氯甲烷，层析过程中引入的吐温-80等。上述外源物质的残留影响产品质量，为获得纯化后病毒液，在对病毒进行浓缩的同时需要去除引入的杂质分子。纯化阶段常常采用超滤浓缩和多次透析相结合的方法去除上一工序所引进的外源物质，如PEG6000、三氯甲烷、吐温-80等。

在疫苗的生产工艺中，采用PEG6000沉淀后离心的方式将病毒液按工艺所需倍数进行浓缩，以等体积或多倍体积的方式加入磷酸盐缓冲液（0.01mol/L PBS溶液）稀释，将稀释后的病毒液再次进行浓缩，如此反复进行以达到去除病毒液中杂质分子的作用，称此步骤为透析。经多次透析后即可获得符合生产所要求标准的疫苗病毒液。

疫苗生产工艺中无菌的控制非常必要，直接影响终产品的质量，特别是非灭活类的疫苗，主要依靠疫苗生产过程中的无菌控制。在现有的疫苗生产工艺技术中，多数企业采用的病毒超滤步骤多为分步进行，即对超滤系统分别进行冲碱清洁后冲注射用水，再用缓冲液平衡超滤系统，最后浓缩和透析病毒液，且使用硅胶管道分别连接超滤系统的进液、回流与滤过端，在操作过程中分别将与超滤系统的进液、回流与滤过端连接的硅胶管直接伸入桶内，在操作环境中属于敞口生产，采用的这种管道为非闭合式分类管道。在无菌生产过程中这类管道较分散，在物品准备的清洁过程及生产操作过程中需要多次重复的拆装和组合，工作量大且管道易混淆，不能保证专管专用，增加交叉污染的风险。总之，这类非闭合式分类管道不仅在操作过程中步骤繁琐、耗时耗力，而且整个过程很难保证无菌，操作过程中带来的污染风险程度较高。

发明内容

介于上述现有技术的不足和疫苗生产的需要，本申请提出一种可拆卸清洁和组合后再灭菌使用的封闭式超滤组合管道系统，不仅有效地保证了疫苗生产工艺中的无菌生产，而且操作简便，适合大规模的生产。

本发明的另一目的是提出所述系统的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种封闭式超滤管道系统，包括缓冲液容器1、待浓缩液容器2、最终收集液容器3、浓缩液容器4和超滤设备5；

所述缓冲液容器1、待浓缩液容器2、最终收集液容器3和浓缩液容器4的均设置有顶盖，顶盖上设置有孔，有管道穿过所述孔从容器中引出；

所述缓冲液容器1引出的管道6与待浓缩液容器2引出的管道7分别连接三通11的两个接口，所述三通11的第三个接口通过泵16和管道与三通12的一个接口连接；所述最终收集液容器3和浓缩液容器4引出的管道10、8分别连接三通13的两个接口，所述三通13的第三个接口与三通12的另一个接口通过管道9连接；所述三通12的第三个接口与连接超滤设备5的回流管路14连接；所述浓缩液容器4还通过泵17、进液管路15与超滤设备5连接。

其中，所述缓冲液容器1引出的管道6与待浓缩液容器2引出的管道7均通过所述孔插入容器底部，所述管道6、7与容器底部接触的部分为不锈钢材质或可高压灭菌的塑料材质的直管，所述管道6、7其余部分为硅胶材质，优选铂金硫化硅胶。

其中，所述进液管路15和/或管道8与浓缩液容器4底部接触部分管道为不锈钢材质或可高压灭菌的塑料材质的直管；其余部分为硅胶材质，优选铂金硫化硅胶。

其中，所述最终收集液容器3和浓缩液容器4引出的管道10、回流管路14、进液管路15均为硅胶材质，优选为铂金硫化硅胶。

其中，所述三通11为T三通，所述三通12、13为Y三通，所述T三通与Y三通的材质为可高压的塑料材质，如聚丙烯PP。

其中，所述超滤设备5还连接有用于排出废液的滤过管路16。

本发明所述的封闭式超滤管道系统的应用，其特征在于，包括步骤：

1）浓缩：将病毒液接入待浓缩液容器2，封闭管道6、回流管道14和管道10，用泵16将病毒液泵入浓缩液容器4；

然后打开回流管道14，开启泵17，启动超滤设备5运行，超滤设备5产生的浓缩液通过回流管道14进入浓缩液容器4；

当待浓缩液容器2内的病毒液被完全泵入浓缩液容器4内，关闭泵16和管道7，将浓缩液容器4内病毒液浓缩至工艺要求倍数时，关闭泵17和回流管道14；所述工艺要求的浓缩倍数视病毒液而定，例如为2-15倍。

2）透析：所述缓冲液容器1内装缓冲液，封闭管道7和回流管道14，通过管道6和泵16将缓冲液泵入浓缩液容器4，然后封闭管道6和关闭泵16，打开回流管道14、开启泵17，启动超滤设备5以去除非抗原性成分；

3）收集：封闭管道8、滤过管路16，打开管路10，启动泵17将浓缩液容器4内的溶液经超滤设备5处理后进入最终收集液容器3。

其中，用止血钳或弹簧夹夹住管道，实现对管道的封闭。

其中，所述步骤1）中的病毒液是细胞培养制得的病毒收获液，或者指收获后加入非抗原性成分，所述非抗原性成分选自PEG6000、三氯甲烷或吐温-80中的一种或其它用在病毒浓缩、透析工艺中添加的外源物质；

所述步骤2）中的缓冲液为磷酸缓冲液。

其中，所述步骤2）重复进行2-10次。

本发明提出的超滤封闭式组合管道，取代了现有方法用分类管道进行疫苗的超滤生产工作，主要可实现以下的有益技术效果：

1）简化生产步骤，减短了生产时间，使生产的效率提高。

2）这是一种可拆卸清洁和组合后高压的超滤封闭式组合管道，便于清洁、高压，且保障了专管专用，可多次重复使用，降低了生产的成本。

3）减少了用于生产疫苗的病毒液在外部环境暴露的时间及次数，增加了疫苗无菌生产的可控性。

4）避免了疫苗生产的中间产品过长时间的放置于室温中，提高了疫苗的品质质量。

附图说明

图1为封闭式超滤管道系统结构图。

图中，1为缓冲液容器，2为待浓缩液容器，3为最终收集液容器，4为浓缩液容器，5为超滤设备，6、7、8、9、10为管道，11为T三通，12、13为Y三通，14为回流管路，15为进液管路，16、17为泵，18为滤过管路。

具体实施方式

现以以下最佳实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：封闭式超滤管道系统

封闭式超滤管道系统，包括缓冲液容器1、待浓缩液容器2、最终收集液容器3、浓缩液容器4和超滤设备5；

所述缓冲液容器1、待浓缩液容器2、最终收集液容器3和浓缩液容器4的顶盖上均设置有孔，有管道穿过所述孔从容器中引出；

缓冲液容器1引出的管道6与待浓缩液容器2引出的管道7分别连接T三通11的两个接口，T三通11的第三个接口通过泵16（蠕动泵）和管道与Y三通12的一个接口连接；最终收集液容器3和浓缩液容器4引出的管道10、8分别连接Y三通13的两个接口，Y三通13的第三个接口与Y三通12的另一个接口通过管道9连接；Y三通12的第三个接口与连接超滤设备5的回流管路14连接；所述浓缩液容器4还通过泵17（蠕动泵）、进液管路15与超滤设备5连接。

管道6、管道7均通过顶盖上的孔插入容器底部，管道6、7与容器底部接触的部分为不锈钢材质的直管，其余部分为铂金硫化硅胶材质。管道8、9、10、回流管路14、进液管路15均为铂金硫化硅胶材质。

进液管路15与浓缩液容器4桶底接触部分管道为不锈钢材质的直管或可高压灭菌的塑料材质（如聚丙烯PP）的直管。超滤设备5还连接有用于排出废液的滤过管路18。本实施例的系统还配有若干止血钳。

实施例2

PEG沉淀甲肝病毒收获液使用实施例1的封闭式超滤管道系统生产初纯甲肝病毒Ⅰ（超滤膜包型号：OS050F05\OS050T06；截留分子量：50-100KD）。

1）、经细胞工厂培养人二倍体细胞，接种甲型肝炎病毒培养后，加入细胞裂解液收获甲肝病毒液。

2）、向甲肝病毒收获液中加入PEG6000溶液，过夜沉淀。经离心后，可收集PEG沉淀甲肝病毒上清液。

3）、对PEG沉淀甲肝病毒上清液进行超滤，生产初纯甲肝病毒Ⅰ：

3-1）、超滤系统经碱清洁、注水平衡及缓冲液平衡后，连接组合管道。

3-2）、浓缩：将收获的PEG沉淀病毒液，接入管道7处的待浓缩液容器2，同时用止血钳将图1中位点①、④、⑤管道处夹死，使管道6、管道14和管道10封闭；用蠕动泵16将PEG沉淀甲肝病毒液泵入连接管道8处的浓缩容器4内。打开超滤设备5的回流管路14，即打开图1中位点④处止血钳并开启蠕动泵17，使整个超滤系统运转，实现边加待浓缩病毒液边浓缩的操作。待待浓缩液容器2内的PEG沉淀甲肝病毒液被完全浓缩在浓缩容器4内，关闭蠕动泵16，用止血钳夹死图1中位点②处的管道7。将浓缩容器4内病毒液浓缩至3-6倍时，关闭蠕动泵17，用止血钳夹死超滤系统回流管路14，即附图中位点④。

3-3）、透析：打开图1中位点①处的管道6的止血钳，开启蠕动泵16，向管道8处的浓缩容器4内等体积加入装在缓冲液容器1里的0.01mol/LPBS（pH7.2，）缓冲液，关闭蠕动泵16，用止血钳夹死图1中位点①处的管道6，打开超滤系统回流管路14，即图1中位点④处止血钳，开启蠕动泵17进行透析去除PEG6000等非抗原性成分。等体积加入0.01mol/LPBS（pH7.2）缓冲液进行透析的反复操作3-6次，完成透析，关闭蠕动泵17。

3-4）、收集：用止血钳夹死图1中位点⑥处管道8，关闭超滤系统的滤过端，即关闭滤过管路18上的阀门，打开附图中位点⑤处管道10上的止血钳，开启蠕动泵17将管道8处的浓缩容器4内的透析后病毒液经超滤系统后打入管道10处的最终收集液容器，此时收获的病毒液为超滤后病毒液。

实施例3

氯仿抽提甲肝病毒液使用实施例1的封闭式超滤管道系统生产初纯甲肝病毒Ⅱ（超滤膜包型号：3051446801E-SG\3051446801E-SW；截留分子量：50-100KD）。

1）、经细胞工厂培养人二倍体细胞，接种甲型肝炎病毒毒种培养后，加入细胞裂解液收获甲肝病毒液。

2）、向甲肝病毒收获液中加入PEG6000溶液，过夜沉淀。经离心后，可收集PEG沉淀甲肝病毒上清液。

3）、对PEG沉淀甲肝病毒上清液进行超滤，浓缩3-6倍，透析3-6次，生产初纯甲肝病毒Ⅰ。

4）、氯仿抽提生产初纯甲肝病毒Ⅰ:加入一定量氯仿，抽提一段时间后离心，收集氯仿抽提甲肝病毒液。

5）、对氯仿抽提甲肝病毒液进行超滤，浓缩8-12倍，透析3-6次，生产初纯甲肝病毒Ⅱ：

5-1）、超滤系统经碱清洁、注水平衡及缓冲液平衡后，连接组合管道。

5-2）、氯仿抽提甲肝病毒液浓缩：将收获的氯仿抽提甲肝病毒液，接入管道7处的待浓缩液容器2，同时将图1中位点①、④、⑤管道处用止血钳夹死，用蠕动泵16将氯仿抽提甲肝病毒液泵入管道8处的浓缩容器4内。打开超滤系统的回流管路14，即附图中位点④处止血钳并开启蠕动泵17，使整个超滤系统运转，实现边加待浓缩病毒液边浓缩。待待浓缩液容器2内的氯仿抽提甲肝病毒液被完全浓缩在管道8处的浓缩容器4内，关闭蠕动泵16，用止血钳夹死附图中位点②处管道7。将浓缩容器4内病毒液浓缩至工艺要求8-12倍时，关闭蠕动泵17，用止血钳夹死超滤系统回流管路14，即附图中位点④。

5-3）、透析：打开图中位点①处的管道6的止血钳，开启蠕动泵16，向管道8处的浓缩容器4内等体积加入0.01mol/LPBS（pH7.2）缓冲液，关闭蠕动泵16，用止血钳夹死附图中位点①处的管道6，打开超滤系统回流管路14，即附图中位点④处止血钳，开启蠕动泵17进行透析去除氯仿等非抗原性成分。等体积加入0.01mol/LPBS（pH7.2）缓冲液进行透析需反复操作3-6次，即完成透析，关闭蠕动泵17。

5-4）、收集：用止血钳夹死附图中位点⑥处管道8，关闭超滤系统的滤过管路18的阀门，打开图中位点⑤处管道10上的止血钳，开启蠕动泵17将管道8处的浓缩容器4内的透析后病毒液经超滤系统后打入管道10处的最终收集液容器3，此时收获的病毒液为初纯甲肝病毒Ⅱ。

实施例4

精纯甲肝病毒Ⅰ使用实施例1的封闭式超滤管道系统生产精纯甲肝病毒Ⅱ（超滤膜包型号：OS050C10/OS050T12；截留分子量：50-100KD）

1）、经细胞工厂培养人二倍体细胞，接种TZ84甲型肝炎病毒毒种培养后，加入细胞裂解液收获甲肝病毒液。

2）、向甲肝病毒收获液中加入PEG6000溶液，过夜沉淀。经离心后，可收集PEG沉淀甲肝病毒上清液。

3）、对PEG沉淀甲肝病毒上清液进行超滤，浓缩3-6倍，透析3-6次，生产初纯甲肝病毒Ⅰ。

4）、氯仿抽提生产初纯甲肝病毒Ⅰ:加入一定量氯仿，抽提一段时间后离心，收集氯仿抽提甲肝病毒液。

5）、对氯仿抽提甲肝病毒液进行超滤，浓缩8-12倍，透析3-6次，生产初纯甲肝病毒Ⅱ。

6）、层析凝胶过滤：初纯甲肝病毒Ⅱ经上样用缓冲液为0.01mol/LT80(pH7.2)洗脱，生产精纯甲肝病毒Ⅰ。

7）、对精纯甲肝病毒Ⅰ进行超滤，浓缩3-6倍，透析3-6次，生产精纯甲肝病毒Ⅱ：

7-1）、超滤系统经碱清洁、注水平衡及缓冲液平衡后，连接组合管道。

7-2）、精纯甲肝病毒Ⅰ浓缩：将收获的精纯甲肝病毒Ⅰ，接入管道7处的待浓缩液容器2，同时将附图中位点①、④、⑤管道处用止血钳夹死，用蠕动泵16将精纯甲肝病毒Ⅰ泵入管道8处的浓缩容器4内。打开超滤设备5的回流管路14即图中位点④处的止血钳并开启蠕动泵17，使整个超滤系统运转，实现边加待浓缩病毒液边浓缩。待管道7处容器内的精纯甲肝病毒Ⅰ被完全浓缩在管道8处的浓缩容器4内，关闭蠕动泵16，用止血钳夹死附图中位点②处管道7。将浓缩容器4内病毒液浓缩至工艺要求3-6倍时，关闭蠕动泵17，用止血钳夹死超滤系统回流管路14，即图中位点④。

7-3）、透析：打开图中位点①处的管道6的止血钳，开启蠕动泵1，向管道8处的浓缩容器4内等体积加入0.01mol/LPBS（pH7.2）缓冲液，关闭蠕动泵16，用止血钳夹死附图中位点①处的管道6，打开超滤设备5的回流管路14，即图中位点④处止血钳，开启蠕动泵17进行透析去除吐温-80等非抗原性成分。等体积加入0.01mol/LPBS（pH7.2）缓冲液进行透析需反复操作3-6次，即完成透析，关闭蠕动泵2。

7-4）、收集：用止血钳夹死附图中位点⑥处管道8，关闭超滤系统的滤过管路18，打开图中位点⑤处管道10上的止血钳，开启蠕动泵17将管道8处的浓缩容器4内的透析后病毒液经超滤系统后打入管道10处的最终收集液容器3，此时收获的病毒液为精纯甲肝病毒Ⅱ。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种超滤方法，其特征在于，使用如下的封闭式超滤管道系统：所述封闭式超滤管道系统由缓冲液容器(1)、待浓缩液容器(2)、最终收集液容器(3)、浓缩液容器(4)、超滤设备(5)和若干个三通组成；

所述缓冲液容器(1)、待浓缩液容器(2)、最终收集液容器(3)和浓缩液容器(4)均设置有顶盖，顶盖上设置有孔，有管道穿过所述孔从容器中引出；

所述缓冲液容器(1)引出的第一管道(6)与待浓缩液容器(2)引出的第二管道(7)分别连接第一三通(11)的两个接口，所述第一三通(11)的第三个接口通过第一泵(16)和管道与第二三通(12)的一个接口连接；所述最终收集液容器(3)和浓缩液容器(4)引出的第五管道和第三管道(10；8)分别连接第三三通(13)的两个接口，所述第三三通(13)的第三个接口与第二三通(12)的另一个接口通过第四管道(9)连接；所述第二三通(12)的第三个接口与连接超滤设备(5)的回流管路(14)连接；所述浓缩液容器(4)还通过第二泵(17)、进液管路(15)与超滤设备(5)连接，超滤设备(5)连接有用于排出废液的滤过管路(18)；

其中，所述缓冲液容器(1)引出的第一管道(6)与待浓缩液容器(2)引出的第二管道(7)均通过所述孔插入容器底部，所述第一管道和第二管道(6；7)与容器底部接触的部分为不锈钢材质或可高压灭菌的塑料材质的直管，所述第一管道和第二管道(6；7)其余部分为铂金硫化硅胶材质；所述进液管路(15)和/或第三管道(8)与浓缩液容器(4)底部接触部分管道为不锈钢材质或可高压灭菌的塑料材质的直管；其余部分为硅胶材质；

所述方法包括步骤：

1)浓缩：将病毒液接入待浓缩液容器(2)，封闭第一管道(6)、回流管路(14)和第五管道(10)，用第一泵(16)将病毒液泵入浓缩液容器(4)；

然后打开回流管路(14)，开启第二泵(17)，启动超滤设备(5)运行，超滤设备(5)产生的浓缩液通过回流管路(14)进入浓缩液容器(4)；

当待浓缩液容器(2)内的病毒液被完全泵入浓缩液容器(4)内，关闭第一泵(16)和第二管道(7)，将浓缩液容器(4)内病毒液浓缩至工艺要求倍数时，关闭第二泵(17)和回流管路(14)；其中，所述病毒液是细胞培养制得的病毒收获液，或收获后加入非抗原性成分进行浓缩后的病毒液；

2)透析：所述缓冲液容器(1)内装缓冲液，封闭第二管道(7)和回流管路(14)，通过第一管道(6)和第一泵(16)将缓冲液泵入浓缩液容器(4)，然后封闭第一管道(6)和关闭第一泵(16)，打开回流管路(14)、开启第二泵(17)，启动超滤设备(5)；所述缓冲液为磷酸缓冲液；

3)收集：封闭第三管道(8)、滤过管路(18)，打开第五管道(10)，启动第二泵(17)将浓缩液容器(4)内的溶液经超滤设备(5)处理后进入最终收集液容器(3)；

其中，用止血钳或弹簧夹夹住管道，实现对管道的封闭。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述最终收集液容器(3)和浓缩液容器(4)引出的第五管道(10)、所述回流管路(14)、进液管路(15)均为硅胶材质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一三通(11)为T三通，所述第二三通和第三三通(12；13)为Y三通。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)重复进行2-10次。