JP2021516971A - 上流生産プロセスでの段階的な分画による生体高分子の生産方法、生産モジュール、および生産における使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、上流生産プロセスでの段階的な分画による生体高分子の生産方法、この方法と併用される生産モジュール、並びにポリペプチド、融合タンパク質および免疫グロブリン分子の工業化生産におけるこの方法／モジュールの使用を提供する。本発明の方法によれば、大規模の組換えタンパク質の上流プロセスの効率、収量および純度の向上が効果的に実現される。【選択図】 図１

Description

本発明は、生物学的製品生産分野に属し、具体的には、生体高分子の工業化生産、特にポリペプチド、融合タンパク質または免疫グロブリンの上流製造プロセスに関する。

現在、バイオ医薬品分野では、生体高分子、特に融合タンパク質および免疫グロブリン分子は注目されており、その生産には、主に細胞培養による上流製造プロセス、細胞培養液から取得、純化、精製、濃縮する下流製造プロセス、および抗体分子を人体に適する製剤溶液に配合する製剤製造プロセスの３つのプロセスがある。

上流プロセスにおいて、組換えタンパク質を生産するための発現系は、主に哺乳動物細胞培養系において構築され、一般的には、ワーキングセルバンクの単一の保存チューブでの細胞活性化から、順に三角フラスコ、２Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、５００Ｌの細胞リアクタを用いて生産される。細胞培養に用いる培地には７０−８０種の成分があり、かつ細胞培養過程において細胞反応中で分泌されるプロテアーゼ、小さな細胞破片および宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ分子などの様々な物質が累積される可能性があり、不完全な抗体分子または酸化還元反応による電荷分布が異なる抗体分子も存在するので、下流プロセスにおいて、遠心分離法および深層濾過により細胞を除去した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を取得する必要がある。この工程による製品の収率は９５％を超えるが、Ｆｃ断片を有する完全抗体分子だけでなく、不完全な抗体分子など製品の性質に関連する不純物も混在するため、後の純化および精製工程の操作が難しくなる。このような場合において、製品の高品質または異なる生産バッチの類似性を保証するために、下流プロセスの純化および精製工程において収率を犠牲にせざるをえない。

従来の生体高分子の大規模工業生産における上流細胞培養段階では、通常、灌流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）または流加回分培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）と異なる細胞分画プロセスとの組み合わせを使用することにより、高密度の細胞培養を実現するとともに、細胞培養液中の不純物の濾別を達成する。ＡＴＦ技術（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，交互接線流濾過）は、最も先進的な分画プロセスであり、細胞に対する剪断力が低く、濾過面積が大きく、かつ目詰まり防止能力が高い濾過システムであり、高密度の細胞濾過培養を実現することができる。しかしながら、実際の操作過程において、細胞が継続的に増殖するため、細胞の大規模培養過程中で発現タンパク質以外の性質が異なる代謝生成物または製品に関する不純物が累積的に生成する。例えば、細胞培養の初期に主に培地において細胞代謝生成物が累積し、細胞が大量に増殖する初期の培養条件下で、培地において少量の抗体生成物が生成し、この部分の抗体生成物は、比較的高い初期培養温度などの条件の影響を受け、脱アミノ化または分解などの変化が発生し、製品関連物質または不純物になりやすい。これらの代謝生成物および製品関連不純物は、細胞および所望タンパク質の濃度の増加に伴い、最終的なタンパク質生成物の収量および純度に影響を与え、タンパク質生成物の天然構造にも影響を与え、高濃度タンパク質の相互凝集を引き起こす恐れがある。その結果、後処理にかかるコストは大幅に高くなる。

そのため、従来の生体高分子の上流生産プロセスの制限により、企業は、短時間内でスケジュール通りに高品質、高速度および高収率の製品化を実現することが困難である。そこで、上流生産段階の細胞培養過程における代謝生成物および製品関連不純物の生産に対する影響を克服できる生産方法を開発する必要がある。

本発明は、上流生産プロセスにおいて段階的に分画することにより生体高分子を生産する方法、この方法と組み合わせて用いる生産モジュール、並びにポリペプチド、融合タンパク質および免疫グロブリン分子の工業化生産におけるこの方法／モジュールの使用を提供する。この方法により、組換えタンパク質の大規模生産における上流プロセスでの効率、収量および純度の向上が達成される。

本発明の第１態様では、バイオリアクタと分画システムとを併用する生産方式を含む上流生産プロセスでの段階的な分画による生体高分子の生産方法であって、第１生産段階と第２生産段階を含み、前記第１生産段階において、第１濾過モジュールを含む分画システムを使用し、前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．０５μｍ〜１μｍである濾過部材を含み、
前記第２生産段階において、第２濾過モジュールを含む分画システムを使用し、前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／１５〜２／３である濾過部材を含む方法が提供される。

好ましい実施例において、前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．１μｍ−０．５μｍ、好ましくは０．２μｍ−０．３μｍである濾過部材を含む。

好ましい実施例において、前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の２／１５〜７／１５、好ましくは１／５〜１／３の濾過部材を含む。

好ましい実施例において、前記生成物の分子量は５０〜３００ＫＤ、好ましくは１００〜２５０ＫＤ、より好ましくは、１５０〜２００ＫＤである。

前記第１生産段階は、細胞の初期増殖段階であり、生成物合成最適化段階と呼ばれてもよい。初期環境における培養温度が比較的高い（３７^ｏＣ）ため、細胞は高速増殖段階にあり、大量の細胞代謝廃棄物、乳酸生成物および少量の脱アミノ化または分解した抗体不純物は累積しやすい。前記第２生産段階は、生成物合成および収集段階である。本発明者は、第１生産段階で生成した代謝生成物および不純物を除去しておくことが、第２生産段階での高品質生成物の合成および収集に有利であることを予想外に発見した。そこで、後期生成物の品質および収率を向上させるために、段階的な分画システムを創造的に導入した。

好ましい実施例において、第１生産段階において、前記分画システムは、主に細胞を分画し、代謝生成物および不純物を除去し、第２生産段階において、前記分画システムは、主に細胞を分画し、タンパク質生成物をエンリッチさせ、小分子代謝生成物を除去する。

一実施例において、生体高分子の上流生産において、第１生産段階は、細胞がバイオリアクタに接種された後、直ちに開始させることができる。

他の実施例において、生体高分子の上流生産において、細胞培養密度が６±１．５×１０^６細胞数／ｍｌに達するときに第１生産段階を開始させる。

他の実施例において、生体高分子の上流生産において、細胞培養密度が１０±５×１０^６細胞数／ｍｌに達するときに、第１生産段階を開始させる。

一実施例において、前記第２生産段階の細胞培養密度は、１５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上であり、好ましくは、前記第２生産段階の細胞密度は、３５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である。

他の好適実施例において、前記「培養密度は１５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である」ということは、培養密度が１０×１０^６〜３０×１０^６細胞数／ｍｌであることをいう。

他の好適実施例において、前記「培養密度は３５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である」ということは、培養密度が３０×１０^６〜５０×１０^６細胞数／ｍｌであることをいう。

他の好適実施例において、前記「培養密度は１５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である」ということは、培養密度が１０×１０^６〜３００×１０^６細胞数／ｍｌであることをいう。培養細胞の生存率が５０％に下がったときに、細胞発酵液を収集し、第２生産段階を完成させる。好ましくは、培養細胞の生存率が７０％に下がったときに、細胞発酵液を収集する。より好ましくは、培養細胞の生存率が８０％に下がったときに、細胞発酵液を収集する。最も好ましくは、培養細胞の生存率が９０％に下がったときに、細胞発酵液を収集する。

他の好適実施例において、前記「培養密度は３５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である」ということは、培養密度が３０×１０^６〜１００×１０^６細胞数／ｍｌであることをいう。

一実施例において、前記第２生産段階での細胞培養密度は、比較的安定した傾向にあり、その変動範囲は１０×１０^６細胞数／ｍｌ以下である。

他の実施例において、前記第２生産段階での細胞培養密度は、増加傾向にあり、その変動範囲は１０×１０^６細胞数／ｍｌを超える。

他の実施例において、前記「変動範囲は１０×１０^６細胞数／ｍｌを超える」ということは、変動範囲が１０×１０^６〜２９０×１０^６細胞数／ｍｌであることをいう。

他の好適実施例において、前記「変動範囲高于１０×１０^６細胞数／ｍｌ」ということは、変動範囲が１０×１０^６〜９０×１０^６細胞数／ｍｌであることをいう。

一実施例において、前記分画システムは、交互接線流システム、接線流濾過システム、回転濾過システム、深層濾過システム、遠心分離システムまたは沈降システムを含むが、これらに限定されない。

一実施例において、前記バイオリアクタは、エアリフト型バイオリアクタ、機械的撹拌型バイオリアクタ、気泡塔型バイオリアクタ、メンブレンバイオリアクタを含むが、これらに限定されない。

他の実施例において、前記バイオリアクタは、インキュベーションシェーカー、マイクロバイオリアクタ、卓上型バイオリアクタ、ステンレス鋼バイオリアクタ、ガラスバイオリアクタ、使い捨てバイオリアクタ、揺動型バイオリアクタまたは複数の並列タンクを含むが、これらに限定されない。

一実施例において、前記培養細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞および微生物細胞などの産業化発酵培養に適用される発現系を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞などを含むが、これらに限定されない。

一実施例において、前記生産プロセスは、灌流培養、濃縮灌流培養、流加回分培養および濃縮流加回分培養を含むが、これらに限定されない。

一実施例において、細胞上流生産過程は、Ｓ１からＳ４を含む。

Ｓ１において、拡大すべき細胞を活性化し、所定仕様のバイオリアクタ中で段階的に拡大培養する。

Ｓ２において、第１濾過モジュールを含む分画システムとバイオリアクタを併用して細胞に対して第１生産段階の培養生産を行う。

Ｓ３において、細胞密度が１５±５×１０^６細胞数／ｍｌに達したときに、第２濾過モジュールを含む分画システムに交換し、第２生産段階の培養生産を行う。

好ましい実施例において、細胞密度が３５±５×１０^６細胞数／ｍｌに達したときに、第２濾過モジュールを含む分画システムに交換し、第２生産段階の培養生産を行う。

他の好適実施例において、細胞密度が５５±５×１０^６細胞数／ｍｌに達したときに、第２濾過モジュールを含む分画システムに交換し、第２生産段階の培養生産を行う。

Ｓ４において、細胞の生存率をリアルタイムに監視し、培養細胞の生存率が５０％に下がったときに、細胞発酵液を収集し、下流生産プロセスに入る。好ましくは、培養細胞の生存率が７０％に下がったときに、細胞発酵液を収集する。より好ましくは、培養細胞の生存率が８０％に下がったときに、細胞発酵液を収集する。最も好ましくは、培養細胞の生存率が９０％に下がったときに、細胞発酵液を収集する。

下流生産純化プロセスは、異なる生体分子生成物の特性に応じて設計されるため、本発明の好適実施例において、ハーセプチンの生物学的類似体の生産を例として段階的な分画システムによる生産の収率および製品品質上の利点を説明する。

本発明の他の好適実施例において、アバスチンの生物学的類似体の生産を例として段階的な分画システムによる生産の収率および製品品質上の利点を説明する。

本発明の第２態様では、上流生産プロセスでの生体高分子の段階的分画用の生産モジュールが提供される。前記生産モジュールは、分画システムに取り付け、バイオリアクタと併用することができ、少なくとも２つの濾過モジュールを含む。第１濾過モジュールは、濾過孔径が０．０５μｍ−１μｍである濾過部材を含み、細胞培養液中の代謝生成物および製品不純物を除去する。前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／１５〜２／３である濾過部材を含み、生体高分子生成物を収集してエンリッチさせる。

好ましい実施例において、前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．１μｍ−０．５μｍ、好ましくは０．２μｍ−０．３μｍである濾過部材を含む。前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の２／１５〜７／１５、好ましくは１／５〜１／３である濾過部材を含む。

一実施例において、前記不純物濾過モジュールの濾過孔径は、２０−５０ＫＤ分子の直径、より好ましくは、５０ＫＤ分子の直径である。

前記濾過部材は、形態的には、中空繊維状、管状、ロール状、平板状などが含まれるが、これらに限定されない。

前記濾過部材の材料は、セルロースエステル類または非セルロースエステル類である。前記セルロースエステル類材料は、酢酸セルロース、ニトロセルロース、エチルセルロースなどを含むが、これらに限定されない。前記非セルロースエステル類は、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）およびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などの材料を含むが、これらに限定されない。

前記バイオリアクタは、エアリフト型バイオリアクタ、機械的撹拌型リアクタ、気泡塔型バイオリアクタ、メンブレンバイオリアクタなどを含むが、これらに限定されない。

他の実施例において、前記バイオリアクタは、インキュベーションシェーカー、マイクロバイオリアクタ、卓上型バイオリアクタ、ステンレス鋼バイオリアクタ、ガラスバイオリアクタ、使い捨てバイオリアクタ、揺動型バイオリアクタまたは複数の並列タンクを含むが、これらに限定されない。

一実施例において、前記分画システムは、交互接線流システム、接線流濾過システム、回転濾過システム、深層濾過システム、遠心分離システムまたは沈降システムを含むが、これらに限定されない。

前記培養細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、微生物細胞、昆虫細胞などの大規模発酵培養に適用される発現系を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞などを含むが、これらに限定されない。

本発明の第３態様では、上流生産プロセスでの生体高分子段階的濾過用の生産モジュール／生産方法の使用が提供される。前記生体高分子段階的濾過用の生産モジュール／生産方法は、生体高分子の工業化生産に適用される。

前記生体高分子は、ポリペプチド又は組換えタンパク質を含むが、これらに限定されない。

好ましくは、前記組換えタンパク質は、免疫グロブリンまたは遺伝子組換え抗体であり、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、シングルドメイン抗体、二重／多重特異性抗体などを含むが、これらに限定されない。

他の好適実施例において、前記組換えタンパク質は、生物学的活性を有する機能性タンパク質およびＦｃ融合タンパク質である。

前記使用は、微生物培養、培地、クローンまたは発現ベクターのスクリーニング、小規模タンパク質供給、プロセス開発、最適化および特性同定、種子拡張、生産などの各段階に適用される。

細胞の上流第１生産段階の模式図である。 細胞の上流第２生産段階の模式図である。

従来技術における生体高分子の上流生産プロセスでの効率が低く、収量が低く、純度が低い問題に対して、本発明者は多くの研究により、上流生産過程において段階的な分画プロセスを使用することにより、下流生産での発現タンパク質の品質が大幅に最適化され、高品質タンパク質の収率が大幅に向上することを予想外に発見した。

本発明の理解を容易にするために、本発明の重要なパラメータを定義する。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
製品純度を測定する方法の一つであり、面積正規化法により計算し、モノマー、ポリマー（高分子量群）および断片（低分子量群）に分けられる。モノマーの百分率が大きいほど、製品の純度が高いことを示す。

ＣＥＸ−ＨＰＬＣ：陽イオン交換クロマトグラフィー
製品電荷純度を測定する方法の一つであり、製品の均一性問題を反映し、製品の電荷状況に応じて酸性ピーク、メインピークおよび塩基性ピークに分けられる。酸性ピークまたは塩基性ピークの比率が高いほど、製品の電荷不均一性の程度が高く、製品の均一性が悪いことを示す。

ｒＣＥ−ＳＤＳ：還元キャピラリーゲル電気泳動法
還元キャピラリーゲル電気泳動を使用し、高電圧電界を駆動力とし、製品を還元した後、分子量によってキャピラリー内での移動速度が異なることにより分離する。重鎖＋軽鎖の合計の比率が高いほど、製品の純度が高いことを示す。

ｎｒＣＥ−ＳＤＳ：非還元キャピラリーゲル電気泳動法
非還元キャピラリーゲル電気泳動を使用し、高電圧電界を駆動力とし、分子量によってキャピラリー内での移動速度が異なることにより製品を分離する。モノマーの比率が高いほど、製品の純度が高いことを示す。

細胞生存率：単位体積あたりの細胞の総数に対する生細胞の比率。

抗体が発酵過程において培養温度、培養時間、撹拌速度、ｐＨなどの条件の影響により脱アミノ化、酸化、糖化、Ｎ−端ピログルタミン酸環化などの様々な翻訳後修飾の変化が発生しやすい。これらの変化は、抗体の電荷分布に影響を与える。これらの翻訳後修飾は、発生する位置が主要であるか否か（ＣＤＲ領域で発生して機能に影響を与えるか、ＦｃＲｎ結合部位で発生してＰＫに影響を与えるかなど）に基づいて主要な品質属性であるか否かを判断する。また、電荷分布／電荷純度は、非常に敏感な品質属性であり、プロセスの一貫性を評価するための非常に良い指標として使用することができる。電荷の不均一性の制御は、常に抗体医薬品製造の焦点で困難である。本発明の優位性は、製品の比較的高い電荷純度を保持し（電荷に影響を与える可能性がある翻訳後修飾または分解を減少させ）ながら、多バッチ大規模生産での生成物の電荷分布の類似性を保証することである。また、細胞拡大段階で生成する物質、例えば、アンモニウムイオン、プロテアーゼ、他の宿主タンパク質、ＤＮＡなどは、細胞増殖および製品品質特性に影響を与える可能性がある（例えば、製品の分解を引き起こす酵素がある）。さらに、大量の不純物が製品収集液に入ることにより、下流純化の収率に大きい影響を与え、これらの不純物を完全に除去できず、製品の収量および品質に影響を与える可能性がある。

また、本発明のシステムおよび方法により、従来の流加培養システムに存在する製品品質および均一性の問題がさらに解決される。大規模の抗体生産分野において、回分流加モードで製品の不純物の制御が不安定であるため、灌流培養に切り替える場合が多い。これによって、プロセスがより複雑になる。本発明によれば、回分流加モードでの不安定、製品関連不純物の高含有量の問題が解決され、プロセスを切り替えずに高品質の生成物が得られ、大規模抗体生産分野における主要な革新と進歩である。

以上より、本発明の従来技術に比べ、細胞培養過程において、不純物および細胞代謝生成物の排出に適用される第１濾過部材並びに製品収集およびエンリッチに適用される第２濾過部材を順に使用することにより、製品が分画段階において、比較的安定した細胞世代、密度、生存率の条件下で、短い時間範囲内で、抗体製品を大規模、高収率で生産し、製品を収集することが保証される。本発明は、以下の有益な効果を有する。
１）製品の均一性を向上させ、抗体生産中の電荷不均一性の問題を解決できる。
２）細胞拡大段階で生成した代謝物、特に、高分子量のプロテアソームなどを除去し、これらの代謝物の分画段階での製品に対する影響を低減させ、製品の純度および品質を向上させる。
３）細胞拡大の初期段階において比較的高い温度の培養条件による少量の抗体生成物を除去することができる。これらの初期生成物は、比較的高い温度の条件下で分解しやすく、製品関連不純物として製品に入る。本発明は、製品関連不純物の減少に有利であり、最終製品の高収量および高純度を保証することができる。
４）生産周期を短縮させ、下流生産プロセスを簡単化させ、コストを削減することができる。

以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。以下の実施例における条件が明記されていない実験方法は、通常の条件、「分子クローニング試験ガイド」第３版に記載の基本試験方法、または製造業者に推奨される条件で行われる。

実施例１：段階的な分画に基づく２００Ｌバイオリアクタの培養
抗体
本実施例では、市販の治療性抗体ハーセプチンに対して開発された類似バイオ医薬品の生産プロセスを使用し、発現細胞系は、中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であり、モノクローナル抗体はＩｇＧ１／ｋａｐｐａタイプであり、そのアミノ酸配列は、一次薬であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））と同じ（ＩＮＮ：ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ＩＭＧＴ番号：７６３７）、その分子量は１４５ｋＤａであった。

細胞上流第１生産段階のフローチャートは図１、細胞上流第２生産段階のフローチャートは図２に示される。

細胞回復
細胞凍結保存チューブを取り出し、そのまま手で持って３７℃恒温水浴に浸漬し、振って溶解させた。３７℃水浴から凍結保存チューブを取り出し、７５％アルコールで表面を消毒した後、在スーパークリーンベンチにおいて凍結保存チューブを開き、滅菌ピペットで細胞懸濁液を吸い出し、１ｍＬのプレインキュベートされたＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ^ＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ基礎培地が入った１５ｍＬ遠心分離管に置き、均一に混合し、３０〜６０秒後、２ｍＬのプレインキュベートされた基礎培地を追加し、均一に混合し、さらに３０〜６０秒後、４ｍＬのプレインキュベートされた基礎培地を追加し、均一に混合し、３０〜６０秒後、遠心分離管を７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、２ｍＬのプレインキュベートされた基礎培地を遠心分離管に移し、細胞を溶解して沈殿させ、さらに８ｍｌ基礎培地が入った細胞培養フラスコに移し、均一に混合した。

拡大培養
２日ごとにサンプリングしてカウントし、１回の拡大培養を行った。培地はＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を使用した。拡大した後、初期細胞密度を６〜１０ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに回復させた。体積が１０Ｌリアクタの接種要求を満たすまで拡大した。細胞密度は２．５〜４．５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９０％以上であった。具体的な制御パラメータを表１に示す。

１０ＬのＷＡＶＥバイオリアクタに接種した後、毎日サンプリングした。具体的な制御パラメータを表２に示す。

３日培養した後、バイオリアクタの容積を５０Ｌに拡大し、具体的な制御パラメータを表３に示す。

ＡＴＦと２００Ｌバイオリアクタとの組み合わせによる灌流培養
本実施例において、Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙの２００Ｌ−交互接線流システムを使用した。まず、ＡＴＦ装置における中空繊維カラムおよび台座頂端の隔膜を組み立てた後、さらに、真空ポンプおよびコントローラに接続し、０．２ｕｍおよび５０ＫＤ分画分子量の中空繊維膜をＡＴＦシステムに組み立て、２５％エタノールで１０分間洗い流した後、脱イオン水で繰り返して洗浄し、残留エタノールを除去した後、高温湿熱滅菌キャビネットに入れて４５分間滅菌し、使用まで保存した。

０．２ｕｍ濾過部材を含むＡＴＦシステムを２００Ｌのバイオリアクタに取り付け、細胞を５０Ｌのバイオリアクタ中で３日培養した後、２００Ｌのバイオリアクタに接種した。初期の細胞密度は１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。具体的な制御パラメータを表４に示す。

細胞密度が１０ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後、ＡＴＦシステムと接続し、ＡＴＦ装置中のコントローラおよび真空ポンプを起動し、細胞増殖量および細胞増殖速度に基づいて毎日の培地交換体積を計算し、新鮮培地の導入速度および培養廃液の排出速度を調整した。細胞密度が４０〜５０ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後、０．２μｍ濾過部材を含むＡＴＦシステムを５０ＫＤ分画分子量の濾過部材を含むＡＴＦシステムに変更し、引き続きＡＴＦ装置中のコントローラおよび真空ポンプを起動し、第２生産段階に入った。好ましい実施例において、細胞密度が４０〜５０ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達する前、バイオリアクタの培養温度を３４℃に調節し、ｐＨ値を６．９に調節し、５０％の溶存酸素を保持し、培養回転速度を１２５ｒｐｍに調節した（結果を表６に示す）。別の好ましい実施例において、バイオリアクタ温度および培養条件の調節は、５０ＫＤ分画分子量の濾過部材を含むＡＴＦシステムへの変更と同時に行うことができる。細胞増殖密度が約１００ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後、上清を収集した。

細胞浄化
細胞培養液の浄化は、遠心分離またはマイクロ濾過と深層濾過との組み合わせにより培養液中の細胞および細胞破片を除去することにより行う場合が多い。本実施例において、２００Ｌバイオリアクタから細胞懸濁液を４^ｏＣの低温、６０００ｇで１５分間遠心分離した後、細胞を除去し、細胞発酵液を保留した。さらに、細胞培養液の浄化で一般的に使用される深層濾過方式を使用した。ここで、緩い多孔質セルロース骨格構造を使用し、珪藻土成分が充填され、注入端の表面孔径は漏斗状である。このような構造は、従来のマイクロ濾過の表面分画構造が目詰まりを引き起こしやすく、濾過効率が低いとの欠点を克服するとともに、遠心分離機が有さない小体積細胞破片を分画可能な利点を有し、珪藻土の吸着作用によりＤＮＡおよびＨＣＰを分画することができる。本実施例において、密理博社のＭＸ０ＨＣ１０ＦＳ１深層濾過器を使用し、遠心分離液を蠕動ポンプ（流速需要を満たせばよい）に連通した後、超純水で深層濾過膜を洗い流した。洗い流し体積は１０ＣＶであった。その後、深層濾過緩衝液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４±０．２）で深層濾過膜を洗い流し体積１ＣＶ、洗い流し速度１００−３００ＬＭＨで洗い流した。細胞培養液を濾過した直後、濾液を収集した。濾過速度は１００−３００ＬＭＨであった。注入終了後、深層濾過緩衝液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４±０．２）で濾過膜を洗浄して濾液を収集した。洗い流し体積は２ＣＶであり、この過程において膜前圧力を２ｂａｒ以下に制御した。

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーは、抗体純化における捕獲ステップとして、宿主タンパク質、エンドトキシン、ＤＮＡのいずれに対しても除去効果を有する。本実施例において、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの充填剤はＭａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ製）であった。深層濾過して得られた上清液を注入し、流速３００ｃｍ／ｈ、カラム負荷量が３５ｍｇ／ｍｌ充填剤より少なかった。サンプル注入終了後、洗浄液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて３００ｃｍ／ｈの流速でカラム５ＣＶを洗浄した。その後、溶出操作を行った。溶出液は１００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．６±０．２、導電率０．９±０．２ｍＳ／ｃｍ）、流速は３００ｃｍ／ｈであった。ＵＶ２８０により検出し、ＵＶ２８０の数値が０．１ＡＵに上がった時から溶出ピークを収集し、０．５ＡＵ値に下がった時に収集を停止させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーを３回行った。

ウイルス不活化と不活化後の深層濾過
本実施例のウイルス不活化では、アフィニティークロマトグラフィー後の溶出ピークを低ｐＨでインキュベートし、レトロウイルスおよびエンベロープを有するウイルスを不活化した。１０％の酢酸でアフィニティークロマトグラフィーの溶出液をｐＨ３．６−３．８に調整し、６０−１２０分間不活化した。

ウイルス不活化後のサンプルを密理博社のＭＸ０ＨＣ１０ＦＳ１深層濾過器により深層濾過した。使用前に超純水で１０ＣＶの深層濾過膜を洗浄し、緩衝液５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（Ｐｈ５．２）で１ＣＶの深層濾過膜を洗浄した後、管路を接続し、流速：１００−３００ＬＭＨ、濾過圧力：２ｂａｒ未満でサンプルを濾過し、サンプルを注入した後、緩衝液５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（Ｐｈ５．２）で１ＣＶを洗浄し、引き続き深層濾過膜２ＣＶを洗浄し、洗浄濾液を回収した。

陽イオン交換クロマトグラフィー
製品中の不純物およびＤＮＡ、エンドトキシンをさらに除去するために、本実施例において、ウイルス不活化および深層濾過では、陽イオン交換クロマトグラフィーを３回循環させた。陽イオン交換クロマトグラフィーはＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ−（Ｍ）（メルク製）を使用した。平衡液（５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２）でカラム３ＣＶを平衡化させ、サンプルを注入し、流速１２０ｃｍ／ｈ、カラム負荷量を４５ｍｇ／ｍｌ未満に保証した。サンプル注入後に平衡液（１８０ｃｍ／ｈ流速）でカラム５ＣＶを洗浄した。その後、溶出操作を行った。溶出液は５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．２）であった。平衡液および溶出液０−１００％で１０ＣＶを段階的に溶出し、流速は１８０ｃｍ／ｈであり、溶出過程において溶出サンプルを収集した。

陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーにより、サンプル中の微量の不純物、例えば、様々なウイルス、ＤＮＡ、エンドトキシンなどを効果的に除去した。モノクローナル抗体の高等電点により、陰イオン交換クロマトグラフィーは、フロースルーモードを採用することにより、不純物が充填剤に結合し、目的タンパク質がカラムを通過して結合しない。本実施例の陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ Ｑ（ＧＥ製）、予備平衡液（５０ＭｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ＭのＮａＣｌ，Ｐｈ８．０）でカラム２ＣＶを平衡化させ、その後、平衡液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｐｈ８．０）でカラム３ＣＶを平衡化させ、サンプルを注入し（流速１８０ｃｍ／ｈ）、ＵＶ２８０数値が０．１ＡＵに達した時から溶出ピークを収集し、カラム負荷量を４０ｍｇ／ｍｌ充填剤未満に制御した。サンプル注入後、平衡液（１８０ｃｍ／ｈ流速）でカラム３ＣＶを洗浄し、ＵＶ２８０が０．１ＡＵに下がった時にサンプルの収集を停止させた。

ウイルス濾過
ウイルス濾過によりエンベロープがないウイルスを除去することができる。生産過程において１．０２ｍ^２／バッチのウイルス濾過膜により濾過した。圧力タンクを使用し、０．５Ｍ ＮａＯＨで処理し、注射用水で洗浄した後、圧縮空気を導入して濾過した。本実施例において、ＶＰＭＧ２０１ＮＢ１（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）により深層濾過を行い、使用前に超純水で１０ＣＶを洗浄し、緩衝液５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（Ｐｈ５．２）で２ＣＶの深層濾過膜を洗浄し、洗浄終了後、管路を接続してサンプル濾過を行い（流速１００−３００ＬＭＨ、濾過圧力１．９−２．０ｂａｒ）、サンプル注入後、緩衝液５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（Ｐｈ５．２）で１ＣＶを洗浄し、引き続き深層濾過膜２ＣＶを洗浄し、洗浄濾液を回収した。

限外濾過と液交換
型番Ｐ２Ｃ０３０Ｃ２５（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）の孔径が３０ＫＤの限外濾過膜を洗浄し、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液で膜後端ｐＨ６．０まで洗浄した。蠕動ポンプで限外濾過膜に導入し、入口端の流速を２００ＬＭＨ、膜差圧を０．３５ｂａｒに制御し、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液で液交換を行い、抗体生成物を取得した。

比較例１：単一分画法に基づく２００Ｌバイオリアクタ培養
基本的には実施例１と同様であるが、細胞密度が１０ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した時に、ＡＴＦシステムに接続し、ＡＴＦ装置中のコントローラおよび真空ポンプを起動したことで相違する。用いたＡＴＦシステムは、５０ＫＤ分画分子量の中空繊維膜部材を含み、細胞増殖密度が約１００ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した時に発酵ステップが完成した。次の純化ステップは実施例１と同様であった。

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー終了後、それぞれ実施例１および比較例１で得られたサンプルをに対して陽イオンＨＰＬＣ分析を行い、電荷異性体の含有量を調べた。酸性ピークと塩基性ピークの分布結果を表５に示す。

表５から分かるように、段階的な分画法で得られた抗体生成物は、単一分画法の抗体生成物よりも優れた電荷純度を有し、中性ピークの含有量がより高く、酸性ピークの含有量がより低い。

製品を純化した後、この２種の上流生産プロセスの最終製品を比較した結果、単一分画法で生産された最終生成物の酸性ピークの比率はある程度改善されたが、改善程度が高くなく、生物学的活性では、段階的な分画法は、単一分画法の生物学的活性よりも明らかに優れているとともに、段階的な分画法で得られた良品の収量は高いのに対し、単一分画法で得られた良品の収率は顕著に低いことを発見した。詳細を表６に示す。

実施例２：段階的な分画に基づく２Ｌバイオリアクタ培養
抗体
本実施例において、生産用の抗体は、組換え抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ヒト化モノクローナル抗体であり、インビトロ哺乳動物細胞中で発酵、発現することにより得られた。動物細胞は中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であり、モノクローナル抗体はＩｇＧ１／ｋａｐｐａタイプであり、そのアミノ酸配列は一次薬アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））と同じ（ＩＮＮ：ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，ＩＭＧＴ番号：８０１７，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｍＡｂ−ＤＢ／）、その分子量は１４９ｋＤａであった。

細胞回復と２ＬバイオリアクタＡＴＦ灌流培養
細胞回復の手順は実施例１と同様であった。

通常の細胞培養プロセスにより種細胞を培養した。細胞密度が４．０〜６．５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達し、生存率が９０％以上である場合、接種要求を満たし、種細胞をＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ^ＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ基礎培地を含む２Ｌバイオリアクタ中に滅菌接種して培養した。接種後の細胞密度は１．０ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、生存率は９０％以上であった。初期細胞培養条件は、培養温度３７℃、撹拌回転速度９５ｒｐｍ、ｐＨ７．２０±０．０５、溶存酸素５０％であった。

Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ製のＡＴＦシステムを用い、まずＡＴＦ装置中の中空繊維カラムおよび底座頂端の隔膜を組み立てた後、さらに真空ポンプおよびコントローラに接続し、孔径が０．２μｍの中空繊維カラムの頂端のリアクタと接続する管路を接続し、細胞がバイオリアクタ中で細胞密度４．５〜５．５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬまで培養されたときに、ＡＴＦ装置中のコントローラおよび真空ポンプを起動し、細胞増殖量および細胞増殖速度に基づいて毎日の培地交換体積を計算し、新鮮培地の導入速度および培養廃液の排出速度を調整した。毎日灌流体積が所定値に達する場合において、葡萄糖が足りない場合、３０％の葡萄糖溶液を適宜に補充した。細胞密度が６５±５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達したときに、培養温度を３２℃に下げ、ｐＨを７．００±０．０５に下げた。細胞密度がさらに９５±５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに上がったときに、処理された滅菌５０ＫＤ中空繊維膜で元の０．２μｍの中空繊維膜を交換し、第２生産段階に入った。細胞密度を１０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内に維持し、細胞生存率が９０％に下がったときに、バイオリアクタ培養を停止させ、細胞培養液を収集した。

一実施例において、細胞培養液を収集するタイミングを細胞生存率が８０％に下がった時点に制御する。他の実施例において、細胞培養液を収集するタイミングを細胞生存率が７０％に下がった時点に制御する。他の実施例において、細胞培養液を収集するタイミングを細胞生存率が５０％に下がった時点に制御する。

細胞澄清
本実施例では、深層濾過膜（Ｄ０ＨＣ（ＭＤ０ＨＣ１０ＦＳ１，メルク）を蠕動ポンプ（流速需要を満たせばよい）に連通した後、超純水で深層濾過膜を洗い流した。洗い流し体積は１０ＣＶであった。その後、深層濾過緩衝液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４±０．２）で深層濾過膜を洗い流し体積１ＣＶ、洗い流し速度１００−３００ＬＭＨで洗い流した。細胞培養液を濾過した直後、濾液を収集した。濾過速度は１００−３００ＬＭＨであった。注入終了後、深層濾過緩衝液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４±０．２）で濾過膜を洗浄して濾液を収集した。洗い流し体積は２ＣＶであり、この過程において膜前圧力を２ｂａｒ以下に制御した。

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの充填剤はＪＷＴ２０３（ＪＳＲ製）であった。深層濾過して得られた上清液を注入し、流速３００ｃｍ／ｈ、カラム負荷量が３５ｍｇ／ｍｌ充填剤より少なかった。サンプル注入終了後、洗浄液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて３００ｃｍ／ｈの流速でカラム５ＣＶを洗浄した。その後、溶出操作を行った。溶出液は１００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．６±０．２、導電率０．９±０．２ｍＳ／ｃｍ）、流速は３００ｃｍ／ｈであった。ＵＶ２８０により検出し、ＵＶ２８０の数値が０．５ＡＵに上がった時から溶出ピークを収集し、０．５ＡＵ値に下がった時に収集を停止させた。室温でサンプルのｐＨ値を３．５−３．７に調整し、低ｐＨウイルス不活化工程を１−２時間行った。

陰イオン交換クロマトグラフィー
一次精製された後のサンプルを用いて精製クロマトグラフィーにより原液を製造した。陰イオン交換クロマトグラフィーはＣａｐｔｏ Ｑ充填剤を使用した（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）。予備平衡液（５０ＭｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ＭのＮａＣｌ，Ｐｈ８．０）でカラム２ＣＶを平衡化させ、その後、平衡液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｐｈ８．０）でカラム３ＣＶを平衡化させ、サンプルを注入し（流速２４０ｃｍ／ｈ）、ＵＶ２８０数値が０．１ＡＵに達した時から溶出ピークを収集し、カラム負荷量を４０ｍｇ／ｍｌ充填剤未満に制御した。サンプル注入後、平衡液（２４０ｃｍ／ｈ流速）でカラム３ＣＶを洗浄し、ＵＶ２８０が０．１ＡＵに下がった時にサンプルの収集を停止させた。

陽イオン交換クロマトグラフィー
サンプルを収集し、次の陽イオン交換クロマトグラフィーに入った。陽イオン交換クロマトグラフィーはＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ−（Ｍ）（メルク製）を使用した。平衡液（５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２）でカラム３ＣＶを平衡化させ、ＧＢ２２２サンプルを注入し、流速１８０ｃｍ／ｈ、カラム負荷量を４５ｍｇ／ｍｌ未満に保証した。サンプル注入後に平衡液（１８０ｃｍ／ｈ流速）でカラム５ＣＶを洗浄した。その後、溶出操作を行った。溶出液は５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．２）であった。平衡液および溶出液０−１００％で１０ＣＶを段階的に溶出し、流速は１８０ｃｍ／ｈであり、溶出過程において溶出サンプルを収集した。

限外濾過と液交換
生成された後のサンプルを限外濾過により液交換した。手順は以下の通りである。型番Ｐ３Ｃ０３０Ｃ０５の孔径が３０ＫＤの限外濾過膜（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を洗浄し、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液で膜後端ｐＨ６．０まで洗浄した。陽イオンクロマトグラフィーサンプルを蠕動ポンプにより限外濾過膜に導入し、限外濾過濃縮を行い、入口端の流速を３００ＬＭＨ、膜差圧を０．３〜０．７ｂａｒに制御し、約２０ｍｇ／ｍｌまで初回濃縮した後、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液で１０倍の等体積液交換を行い、終了後に限外濾過膜によりタンパク質を原液として回収した。

比較例２：単一分画法に基づく２Ｌ−ＡＴＦシステムの抗体生産
同様にＲｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ製のＡＴＦシステムを使用した。まず、ＡＴＦ装置における中空繊維カラムおよび台座頂端の隔膜を組み立てた後、さらに、真空ポンプおよびコントローラに接続し、孔径５０ＫＤの中空繊維カラムの頂端とリアクタに接続される管路を取り付け、２５％のエタノールに入れ、実施例１の方法に従って滅菌消毒を行った。

基本的には実施例２と同様であるが、細胞密度が４．５〜７．５ ｘ １０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した時に、ＡＴＦシステムに接続し、ＡＴＦ装置中のコントローラおよび真空ポンプを起動したことで相違する。用いたＡＴＦシステムは、５０ＫＤ分画分子量の中空繊維膜部材を含み、細胞活性が９０％に下がったときに反応を停止させた。次の純化ステップは実施例２と同様であった。

単一分画法による細胞培養の１０日目に細胞培養液を取り分析した結果、その酸性ピークの含有量は約２６％であった一方、段階的な分画法による培養の１０日目の酸性ピークはわずか約１０％であった。次の純化ステップを完成させたときにおける段階的な分画法の生産プロセスにより得られた最終生成物の酸性ピークの含有量も単一分画法よりも低かった。限外濾過により液交換した後、ＳＥＣ−ＨＰＬＣに対して抗体モノマーの純度が９５％以上であることが要求されているが、３つの単一分画法の生産批次において、検出された抗体モノマーの数値は９３％、９２．８％および９３％であり、実施例２で用いた段階的な分画法の収率よりも大幅に低かった。従って、収率上の利点に加えて、段階的な分画プロセスで生産されたサンプルは、電荷純度および分子サイズ純度においても単一分画法の生成物よりも著しく優れている。サンプルのパラメタをさらに分析した結果を以下の表７に示す。

実施例３：異なる細胞増殖密度で段階的な分画を実行する上流生産
さらなる研究により、段階的な分画プロセスに適用できる細胞密度は１５±５×１０^６細胞数／ｍｌと低く、低密度細胞培養の条件下で細胞密度が１５±５×１０^６細胞数／ｍｌに達したときに第２生産段階に入ることができ、細胞密度が３５±５×１０^６細胞数／ｍｌに達したときに効果はより高いことが発見された。前記細胞密度下で第２生産段階に入った場合においても、最終製品の収量および製品電荷の純度は、従来の単一分画プロセスよりも著しく高かった。実施例２の抗体を例とすると、細胞密度が１５±５×１０^６細胞数／ｍｌ、その変動範囲が１０×１０^６細胞数／ｍｌ〜２０×１０^６細胞数／ｍｌである場合、または細胞密度が３５±５×１０^６細胞数／ｍｌ、その変動範囲が３０×１０^６細胞数／ｍｌ〜４０×１０^６細胞数／ｍｌである場合の単一分画法と段階的な分画法との比較結果を表８に示す。

実施例４：異なる分子量の生成物の適用性
本発明の段階的な分画的生産プロセスは、異なる分子量のタンパク質製品の生産にも適用され得る。遺伝子組換え抗体を例とすると、抗体Ｆａｂ領域は、平均分子量が約５０ＫＤであり、二重／多重特異性抗体は、分子量が約３００ＫＤに達することができ、いずれも段階的な分画プロセスに良好に適用できる。特に二重／多重特異性抗体は、構造が複雑で、常に特別に設計される変異を伴い、製品関連不純物が出る可能性が非常に高いため、段階的な分画の上流生産プロセスにより、第１生産段階において関連する不純物を比較的大きい濾過孔を排除し、後期の純化と開発により有利である。タンパク質製品お分子量の差が大きいため、本発明において、本発明者は生産段階で用いた濾過部材の濾過孔の範囲を検討した。第１生産段階では、０．０５μｍ−１μｍ範囲内の濾過部材であれば、小分子代謝生成物および大分子製品関連不純物を除去することができる。好ましい実施例において、０．１μｍ−０．５μｍの濾過部材を使用することにより、除去効率および製品収率をより効果的に向上させることができる。第２生産段階では、本発明者は、生成物の分子量を参照として、分画孔径が生成物分子量の１／１５〜２／３である濾過部材を使用する場合、良好な生成物エンリッチ効果を実現することができ、分画孔径が生成物分子量の２／１５〜７／１５である場合、収率はより高く、分画孔径が生成物分子量の１／５〜１／３である場合、エンリッチ抗体の収率は最も高かった。

本実施例において、発明者は単一分画法および段階的な分画法によりそれぞれ実施例１のハーセプチン抗体配列のＦａｂ領域（〜５０ＫＤ）タンパク質断片を発現して純化した。段階的な分画法において、Ｒｅｆｉｎｅ ＴｅｃｈｏｌｏｇｙのＡＴＦ−２Ｌシステムを用い、まず孔径０．１μｍの中空繊維カラムを取り付けて第１段階の培養を実現し、細胞密度が１０〜１５×１０^６に達したときに、処理された滅菌１０ＫＤ中空繊維膜で元の０．１μｍの中空繊維膜を交換し、第２生産段階に入った。単一分画法において、最初からＡＴＦシステムに１０ＫＤの中空繊維膜が取り付けられた。この２つの培養方法は、同じ培養条件下で使用され、単一分画法に比べ、段階的な分画法は、ハーセプチン抗体配列のＦａｂ領域収量を４％向上させ、純度を２％向上させた。本発明者は、分子量が５０ＫＤの他のタンパク質断片を用いて比較した結果、段階的な分画法は、従来の単一分画法に比べ、５０ＫＤのタンパク質断片の製造において、効果的に収量を２−４％、純度を１−２％向上できることを発見した。

本実施例において、本発明者は、単一分画法および段階的な分画法により二重特異性抗体の発現および純化を行った。即ち、実施例１におけるハーセプチン抗体配列のＦａｂ領域（〜５０ＫＤ）のＣ端を直接実施例２の一次薬アバスチン抗体の可変領域のＮ端に結合して対称構造を有する分子量が約２５０ＫＤである二重特異性抗体を形成した。段階的な分画法において、Ｒｅｆｉｎｅ ＴｅｃｈｏｌｏｇｙのＡＴＦ−２Ｌシステムを用い、まず孔径が０．５μｍの中空繊維カラムを取り付け、第１段階の培養を達成し、細胞密度が３０〜４０×１０^６に達した後、処理された滅菌された５０ＫＤ中空繊維膜で元の０．５μｍの中空繊維膜を交換し、第２生産段階に入った。単一分画法では、最初からＡＴＦシステムに５０ＫＤの中空繊維膜が取り付けられた。この２つの培養方法は、同じ培養件下で使用され、単一分画法に比べ、二重抗体分子の複雑性により、第１生産段階では、細胞培養の初期で代謝生成物、ポリポリマー、および初期の品質がよくない抗体分子を除去できるため、段階的な分画法は、二重特異性抗体配列の収量を１０％、純度を５％効果的に向上できる。本発明者は、分子量が２５０ＫＤの他のタンパク質断片を用いて比較した結果、段階的な分画法は、従来の単一分画法に比べ、大分子量の二重特異性または三重特異性抗体の製造において、効果的に収量を５−１０％、純度を３−５％向上できることを発見した。

以上、本発明の好ましい生産形態に基づいて、実施例により本発明を無制限に説明した。本発明に記載の段階的な分画の上流生産プロセスは、異なる形態のバイオリアクタの培養と併用することができ、または従来の様々な分画システム（例えば、接線流濾過システム（ＴＦＦ，ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、回転濾過システム、深層濾過システム、遠心分離システムまたは沈降システムなど）に適用することができる。添付する特許請求の範囲内であれば、全ての変化および／または変形は、いずれも本発明の保護範囲内に含まれる。

Claims (18)

1. バイオリアクタと分画システムとを併用する生産方式を含む上流生産プロセスでの段階的な分画による生体高分子の生産方法であって、
   第１生産段階と第２生産段階を含み、
   前記第１生産段階において、第１濾過モジュールを含む分画システムを使用し、前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．０５μｍ〜１μｍである濾過部材を含み、
   前記第２生産段階において、第２濾過モジュールを含む分画システムを使用し、前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／１５〜２／３である濾過部材を含む、ことを特徴とする方法。
2. 前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．１μｍ〜０．５μｍである濾過部材を含み、および／または
   前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の２／１５〜７／１５である濾過部材を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．２μｍ〜０．３μｍである濾過部材を含み、および／または
   前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／５〜１／３である濾過部材を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記生成物の分子量は、５０〜３００ＫＤである、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記生成物の分子量は、１００〜２５０ＫＤまたは１５０〜２００ＫＤである、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記第２生産段階での細胞培養密度は、１５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記第２生産段階での細胞密度は、３５±５×１０^６細胞数／ｍｌ以上である、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 前記第２生産段階での細胞培養密度の変動範囲は、１０×１０^６細胞数／ｍｌ以下であり、または
   前記第２生産段階での細胞培養密度は、増加傾向にあり、その変動範囲が１０×１０^６細胞数／ｍｌよりも高い、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
9. 前記分画システムは、交互接線流システム、接線流濾過システム、回転濾過システム、深層濾過システム、遠心分離システムまたは沈降システムを含み、および／または
   前記バイオリアクタは、エアリフト型バイオリアクタ、機械的撹拌型バイオリアクタ、気泡塔型バイオリアクタ、メンブレンバイオリアクタを含み、および／または
   前記培養細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞及び微生物細胞を含み、好ましくは、哺乳動物細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 生体高分子の上流生産プロセスは、灌流培養、濃縮灌流培養、流加回分培養および濃縮流加回分培養を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記生体高分子は、ポリペプチドまたは組換えタンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記組換えタンパク質は、遺伝子組換え抗体、生物学的活性を有する機能性タンパク質またはＦｃ融合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 分画システムに取り付けられ、バイオリアクタと併用可能な請求項１に記載の方法に用いる生産モジュールであって、
    第１濾過モジュールと第２濾過モジュールを含み、
    前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．０５μｍ〜１μｍである濾過部材を含み、
    前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／１５〜２／３である濾過部材を含み、
    前記第１濾過モジュールおよび第２濾過モジュールは、それぞれ２つの分画システムに取り付けられるか、または同一の分画システムに互いに交換可能に取り付けられる、ことを特徴とする生産モジュール。
14. 前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．２μｍ〜０．３μｍである濾過部材を含み、および／または
    前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／５〜１／３である濾過部材を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載の生産モジュール。
15. 前記第１濾過モジュールは、濾過孔が０．２μｍ〜０．３μｍである濾過部材を含み、および／または
    前記第２濾過モジュールは、濾過孔の分画分子量が生成物分子量の１／５〜１／３である濾過部材を含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の生産モジュール。
16. 請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法または請求項１３から１５のいずれか１項に記載の生産モジュールの使用であって、
    前記方法またはモジュールは、生体高分子の上流生産プロセスに使用可能であり、
    前記生体高分子は、タンパク質生成物である、ことを特徴とする使用。
17. 前記生体高分子は、ポリペプチドまたは組換えタンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の使用。
18. 前記組換えタンパク質は、遺伝子組換え抗体、生物学的活性を有する機能性タンパク質またはＦｃ融合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１７に記載の使用。

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