CN104126001A - 用于阻留和回流细胞的单向分离器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有薄板组件的倾斜通道类型的固体材料分离器中的单层或多层塑料网板的用途。

Description

用于阻留和回流细胞的单向分离器

本发明涉及含有堆叠板的倾斜通道固体分离器中的单层或多层塑料网板用于阻留来自反应器混合物中的固体的用途。

动物和植物细胞的培养在生产生物活性物质和药物活性产品中非常重要。特别需要通常在生长培养基的游离悬液中进行细胞培养，因为细胞与微生物不同，细胞对于机械剪应力和营养供应不足高度敏感。

动物和植物细胞系通常分批培养。这种方法的缺点是由于不断改变的底物、产物和生物质的浓度，因此很难达到细胞的最佳营养。另外，在发酵结束时，积累了副产物，例如死细胞的组分，它们通常需要在后续处理过程中付出很大努力才能被去除。因此，特别是当生产不稳定的产品(例如，可被蛋白水解攻击而破坏的产品)时，需要使用连续运转的生物反应器。

连续的生物反应器使得有可能当满足以下要求时，达到高细胞密度和相关的高生产率：

·为细胞充足且低剪切地供应底物，尤其是溶解氧，

·充分去除呼吸作用过程中产生的二氧化碳，

·用于建立高细胞浓度的有效、低剪切、防阻塞的细胞留滞系统，

·长期稳定(无菌、流体动力学)的生物反应器和留滞系统。

除了连续运行模式之外，也可能使用具有有效的细胞留滞系统的生物反应器，例如甚至用于培养具有特别高的细胞密度的预培养物。在这种情况下，细胞留滞系统以重复分批的模式不连续地使用，以去除实际上不含有生物质的细胞培养物上清液。然后，将所述预培养物反应器用新鲜的生长培养基重新填满，从而使培养物具有比简单分批操作的情况下更高的细胞密度。

有效的细胞留滞是需要的，这样在连续运行的生物反应器中可达到高的细胞密度(>每毫升2千万活细胞)。在这种情况下，所要求的留滞程度取决于细胞的生长速率和灌注速率q/V(培养基通过量q/生物反应器容积V)。

过去提出了不同的用于连续运行的生物反应器的细胞留滞系统，这些细胞留滞系统在大多数情况下被布置在生物反应器外。这样做的原因是容易接近所述细胞留滞系统以达到维护和清洁的目的。

为了使细胞损伤最小化，尤其是由于在生物反应器外的不充分的氧气供应和二氧化碳去除所造成的细胞损伤，需要有具有小工作容积和相关的短细胞滞留时间的细胞留滞系统。

除了膜过滤器之外，在具体的离心和重力分离器的现有技术中，还使用根据交叉流过滤原理起作用的具有固定膜和可移动膜的设备。

在使用膜过滤器的细胞留滞的情况下，观察到沉积物或污染，这能够妨碍可靠且不需要维护的长期运行。当有足够快速的流体穿过膜表面时，可以减少沉积物。这可以在静止的或振荡的运行过程中实现。振荡流体穿过其中的膜系统的实例为来自Refine Technologies Inc.的Alternating Tangential Flow(ATF)System。但是，流体快速穿过膜表面与低剪切细胞培养的基本前提相反。

用于在离心力场中分离出细胞的低剪切离心机在不需要维护的情况下仅能运行数个星期，并且需要更换离心元件。这增加了污染风险。

主要用于细胞培养的重力分离器为沉降容器和倾斜通道分离器。与简单的沉降容器相比，大规模使用的倾斜通道分离器具有的优势在于与分离表面面积有关的相当小的容积。一篇出版物(Henzler,H.-J.,Chemie-Technik,1,1992,3)描述了在倾斜通道分离器中进行的细胞留滞，其能够以逆流、交叉流、顺流方式运行。流体穿过的通道横截面可以设置有板或管。WO1994026384 A1要求保护倾斜通道分离器用于在逆流分离器中阻留细胞的用途。WO2003020919 A2除了别的以外，描述了用于细胞留滞的逆流和交叉流分离器，以及还有它们与各种预分离器(例如水力旋流器)的组合。这些已知的倾斜通道分离器由不锈钢制成，并且其元件被切割、用力磨平、镜面抛光并且焊接在一起。

倾斜通道分离器经外部回路连接至生物反应器。为此，需要软管管路和泵。

为了降低重力分离器中的细胞的代谢活性和粘附性，建议在细胞培养肉汤被送至重力分离器的过程中冷却所述细胞培养肉汤。在细胞长期处于生物反应器外的情况下，低温下降低的代谢活性一定是有利的。

WO2009152990(A2)描述了用于在流体穿过的容器中阻留和回流细胞的细胞留滞系统，所述系统包含相互邻近排列的多个通道，所述通道形成直立的中空圆筒，并且相对于所述中空圆筒的纵轴线倾斜10°-60°的角度β。流体穿过的容器可以是用于细胞留滞和回流的生物反应器或生物反应器连接的容器。通道在下端有开口。在上端，通道通向具有至少一条管线的普通环形空间，收获流可经该环形空间从容器运出。细胞和细胞培养液的分离发生在通道中。作为所述收获流从生物反应器中被连续去除的结果，细胞培养液和细胞被吸入通道中。如同在典型的倾斜通道分离器中一样，细胞在倾斜的通道中沉淀并滑下，以相对于流入的收获流逆流的方向再次流出通道，从而保留在容器中。与细胞分离的细胞培养液通过通道运输到通道上方的环形空间中，最终从容器中运出。

在严格管理的药物生产中，提供净化且灭菌的生物反应器和生物反应器元件例如细胞留滞系统是非常耗费时间、技术上复杂并且耗费人力。为了安全地避免多功能单元中的产品更换过程中或两个产品批次之间发生交叉污染，除了清洁之外还需要非常复杂的清洁确认，在工序改变的情况下可能需要重复该清洁确认。对于由不锈钢制成的常规分批发酵罐、馈入分批发酵罐或灌注发酵罐的清洁和灭菌，通常在所谓的永久固件单元中使用与就地蒸汽处理(SIP)技术相结合的就地清洁(CIP)技术。为了在连续处理控制的情况下确保足够长时间的无菌，也使用高压灭菌技术，但是高压灭菌技术需要非常不便地将反应器或反应器元件运送到高压灭菌器中，并且只适用于比较小的反应器尺寸。在使用老化的消耗性部件(例如密封搅拌器轴)、不恰当的灭菌或装置运输、高压灭菌后将连接线投入运行或与连接线连接、以及常规取样的情况下，污染风险特别高。

在分批或馈入分批模式中使用CIP/SIP单元的情况下，由准备过程导致的反应器停工期可以明显影响反应器可用性，尤其是在由于短时间使用而频繁改变产品的情况下。

一次性反应器的概念在市场上得到了越来越多的关注，用以满足快速且灵活的生产单元重新装载的要求，同时确保最大程度的清洁和无菌。

从现有技术出发，本发明的目的是提供有效的用于在连续或分批运行过程中阻留和回流动物(特别是人)和植物细胞的方法，所述方法考虑细胞对机械剪应力和为所述细胞供应充足营养的敏感性，所述方法可以扩大到非常大的规模，所述方法满足了制药工业的维护、清洁和灭菌方面的要求，所述方法的用途降低了复杂度和差错风险，并且所述方法允许使用最少的资源而经济地且环境上最优地使用(生产和处置)一次性系统。

通过使用含有堆叠板的倾斜通道固体分离器中的单层或多层塑料网板用于阻留来自反应器混合物中的固体而实现上述目的。

对于细胞特别是来自生物反应器混合物的细胞的留滞，本发明的倾斜通道固体分离器包含以下元件：

-固体分离器的上部区域，具有用于从收获流收集区(56)去除与细胞分离的收获流(70)(＝收获物)的一个或多个馈入装置(feed-through)/适配件(fitting)(80)，连接至

-由单层或多层塑料网板组成的堆叠板(1)形成的分离区，所述堆叠板在运行过程中相对于水平面倾斜30°-80°，连接至

-所述固体分离器的下段，其具有用于所述反应器混合物(74)的流分布的一个或多个馈入装置或适配件(84)，下方是

-固体收集区(57)，其向下渐缩，特别是以圆锥或棱锥的方式，用于通过重力收集细胞。

优选地，向下渐缩(特别是以圆锥或棱锥的方式)的固体收集区(57)相对于垂直面的角度(58,59)为10°-60°。可以单独选择角度58和59。

为了允许回流，固体收集区(57)具有一个或多个用于去除细胞的馈入装置(89)或可能的适配件(88)。适配件的一个实例是中央吸入口。

单层或多层塑料网板形成通道，堆叠板1优选由相互邻近排列的多个通道组成。

通道在下端和上端开口。在下端，所述通道通往常用的固体收集区57，所述固体收集区以圆锥的方式向下渐缩。在上端，所述通道通往常用的收获流收集区56，所述收获流收集区具有至少一个馈入装置80，所述收获流可从容器中被运输通过该馈入装置。

在本发明的倾斜通道固体分离器的通道中，细胞和细胞培养液被分离。由于连续地从生物反应器中除去收获流，细胞培养液和细胞被吸入到通道中。细胞在倾斜的通道中沉积，并且如同在典型的倾斜通道分离器中一样，以相对于流入的收获流逆流的方向再次从通道滑出，并在圆锥形渐缩的固体收集区57中被收集。通常，固体收集区57具有一个或多个与生物反应器相连的馈入装置/适配件88/89，用于吸出收集的细胞并使其回流到生物反应器中。

堆叠板1的通道可具有角形的、椭圆形的、圆形的或半圆形的横截面(图4)。

在每种情况下，通道的尺寸(数目、直径、长度)取决于待阻留的细胞的性质、生物反应器的大小和通过量。

为了防止通道堵塞，通道宽度d优选为d≥3mm。在优选的实施方案中，使用具有通道宽度为3mm-100mm，优选4mm-20mm，特别优选3-7mm的通道，以首先安全地避免阻塞状态，并且其次使分离器空间和生物反应器空间之间的空间-时间产率降低的容积比最小化。

所需的分离表面面积A_erf按照eq.1由沉淀速度ws、灌注速度q/V(培养基通过量q/生物反应器容积V)和生物反应器容积确定。系数η考虑了倾斜通道分离器相对于垂直分离器的性能降低(eq.2)。

根据文献(H.-J.Binder,Sedimentation aus Ein-undMehrkornsuspensionen instehenden,laminarKreis-und Rechteckrohren[Sedimentation from single grain andmultigrain suspensions in inclined,laminar-flow circular andrectangular pipes],Dissertation Berlin,1980)中公布的方法，可从eq.3和eq.4近似确定矩形和圆柱形截面情况下的理论分离表面面积A_th：

$A_{\mathrm{erf}}=\frac{\mathrm{Perfusionsrate}\·V}{\mathrm{ws}}---(\mathrm{Eq}.1)$

$A_{\mathrm{th}}=\frac{A_{\mathrm{erf}}}{\mathrm{\η}}---(\mathrm{Eq}.2)$

矩形：A_th≈Z·sin(β)·d·L   (Eq.3)

圆柱形：

此处，Z为通道的数目，β为通道相对于重力方向倾斜的角度，d为内径，L为通道长度，π为数值pi(π＝3.14159...)。

通道长度的尺寸确定需要遵循待考虑的层流条件(雷诺数Re<2300)。

就此而论，收获流去除位置(＝馈入装置/适配件80)的动态压力应至少为通道内压降的1/5-1/10，以排除使效率降低的分布不均现象。在通道长度大于0.1m，优选通道长度为0.2m-5m，特别优选通道长度为0.4m-2m的情况下，可以认为在技术上可实现足够的压降。

由于压降减小，短通道长度L可引起分布问题，并且尤其当从上部收获流收集区56去除收获流时，可能需要一个分布装置用于降低去除速度。因此，可选地，馈入装置/适配件80具有流体反向器(inverter)81，用于从收获流收集区56均质化去除与细胞分离的收获流70(＝收获物)。

通常，本发明的倾斜通道固体分离器可包含1至106个通道，优选10至100000个，尤其优选10至10000个。如果需要，通道分布穿过堆叠板1中的一个或多个网板，以进行空间需求优化。根据规模，优选地，堆叠板1包含1至400个网板，特别优选1至50个网板。

可以调整由包含支承板的单层或多层网板组成的堆叠板1的高宽比。优选使用横截面为正方形、圆柱形、矩形或椭圆形，高宽比H/D为0.005≤H/D≤1.5，优选0.02≤H/D≤1.2，特别优选0.1≤H/D≤1.0的堆叠板1。

优选地，分离区包括相互堆叠起来并形成基体的多个塑料网板。

或者，堆叠板1可由型板(profiled plate)340或320形成(见图4)。型板优选具有一个光滑侧面和一个具有一系列以固定间隔排列的支柱和凹槽的侧面。通道通过在例如支承板30上，以一层或多层堆叠所述板而形成。这样，位于开放侧面的凹槽在每种情况下都被相邻层的光滑侧面或被固定片的壁封闭。还可以将堆叠板或子堆叠板挤压成单层或多层的方式，以及将这些堆叠板或子堆叠板结合在一起形成堆叠板1。

网板优选通过粘合剂接合或焊接被结合。堆叠板应主要由于结合而在空间上被固定。另一目的是最小化所谓的死区(网板的外表面周围不用于分离的空间)。然而，在这种情况下，完全避免所述死区不是绝对必需的。合适的粘合剂是本领域技术人员已知的并且与通道的材料和表面性质相适合的粘合剂组分。更具体地，优选使用市场上可得的具有所要求的FDA质量等级的粘合剂。为了进行焊接，可使用热结合技术例如加热、激光和超声。特别优选的结合技术是激光焊接，所述激光焊接还可以特殊地在适用于如下目的的装置中与将堆叠板切割成一定尺寸的步骤相结合。焊接技术的优势在于在制药过程中引入的塑料的数量不会因该结合技术而有所增加。

通道的几何形状由支柱高度hs与通道宽度d的比率限定。根据特征(展性、弹性、深拉能力)，技术上可实现的hs/d比率在0.01≤hs/d≤5的范围内。这里应当注意，两个尺寸hs和d都应该大于或等于3mm，或者优选大于或等于5mm。优选的hs/d比率为0.5-5。支柱宽度bs由薄膜材料的机械稳定性确定。支柱宽度bs应该最小化以允许高的分离表面面积/分离器容积。同时，支柱宽度也不应该选择得太低，以能够允许与下层的压配合连接而不产生形状的改变。在挤压堆叠板1的情况下，或在由挤压子堆叠板或网板构成的堆叠板的情况下，用小的支柱宽度而不大量损失分离表面面积的情况下实现非常高的刚性是可能的，因此优选这种方式的生产。

型板可在板生产过程中通过直接成型而制成，或者通过(例如粘合)将凸出的、热成形板或冷成形板结合至光滑板而制成。凸板和光滑板的材料性质可以依据它们的不同功能性(对于凸板具有好的滑动性和形状稳定性，对于光滑板具有好的密封性)进行优化调整，即，通过选择本领域技术人员已知并且具有适当的表面质量的合适材料。

可商购的、节约成本的并且适合制药过程的由例如聚碳酸酯组成的子堆叠板形式的塑料网板，通常被切割或制成合适的长度并相互附接以产生堆叠板1。

这些网板被挤压为用于切割的连续产品，具有最终通道几何形状(沉积表面区域)和现成的表面质量。通常通过在例如圆锯上锯开而实现将其切割成一定尺寸，更具体地切割成所需长度。通常，纵向支柱首先充当分离器的外壳，其次用于稳定流体通道，横向支柱首先充当分离器的外壳，其次形成分离表面区域。

由塑料网板构成的堆叠板被实现为直的立方体(图3)，其中通道开口的平面相对于堆叠板1的支撑面成直角，或者为倾斜的立方体(图2)，其中在装配状态下的通道开口位于水平面上。优选后一个方案(倾斜的立方体)，以防止沉积引起的浓度梯度朝向底部通道开口。通道接收反应器混合物的均质化流，可选地在水平分布器85的协助下。

在第一实施方案中(图1-13)，本发明的一次性倾斜通道固体分离器的元件安装在流体可穿过的γ-可灭菌的塑料袋中。由单层或多层塑料网板组成的堆叠板1被引入塑料袋的中央区域的上段。塑料袋还将收获流收集区56和圆锥形渐缩的固体收集区划定界限，固体收集区57优选相对于垂直面成10°-60°的角度58、59。在塑料袋的中央区域的下段，馈入装置或适配件84展示出一个水平分布器85，用于经由横进表面面积510实现细胞培养液(＝馈入物)74的均匀水平流分布。

在该实施方案中，通过一次性倾斜通道固体分离器完成上述目的，所述一次性倾斜通道固体分离器用于阻留和回流来自生物反应器混合物中的细胞，所述一次性倾斜通道固体分离器包含流体可穿过其中的γ-可灭菌的塑料袋，具有以下配件：

-在塑料袋的上部区域，一个或多个馈入装置/适配件80，用于从收获流收集区56去除与细胞分离的收获流70(＝收获物)，

-在塑料袋的中央区域的上段，由单层或多层塑料网板组成的堆叠板1形成的分离区，所述堆叠板在运行过程中相对于水平面呈30°-80°的角度(10＝β)倾斜，

-在塑料袋中央区域的下段，一个或多个馈入装置或适配件84，用于对反应器混合物74进行流体分布，可选地具有水平分布器85，用于经由横进表面面积510实现细胞培养液(＝馈入物)74的均匀水平流分布。

-在塑料袋的下部区域，向下渐缩(特别以圆锥或棱锥的形式)的固体收集区57，用于通过重力收集细胞。通常，固体收集区57具有一个或多个用于去除细胞的馈入装置89或适配件88。

塑料袋的上部区域也可为向上渐缩。

塑料袋通常由单层或多层透明的聚合物材料制成，使得在运行过程中能够看到装置内部。在惯常的低薄膜厚度s<<1mm的情况下，聚合物材料允许设备具有相对小的质量分数。所述塑料袋的获取和处理是节约成本的，并且这非常适合构建一次性系统。因此，处置使用过的分离器和使用新的一次性分离器比清洁使用过的分离装置更加经济，尤其是因为当使用一次性分离器时，使用用于注射的水(WFI)进行昂贵的清洁和费时的清洁确认不再适用。本发明的分离器优选为无菌包装的。

用于制造所述塑料袋的特别适合的材料为专利说明书US 6,186,932B1的第2和3列使用的用于其中提及的运送袋(小袋)的材料和材料组合。所述专利说明书中所记载的壁强度也可被转用到本发明的分离装置。

在优选的实施方案中，所述塑料袋的壁由本领域技术人员已知的薄膜复合材料组成，并且由两层或更多层(层压品或共挤物)组成以改善塑料袋关于展开性能、延展性能、气体扩散、稳定性、方法相容性(最小限度的产物和细胞的吸附)和可焊性的性质。

通道长度的尺寸需要遵循待考虑的层流条件(雷诺数Re<2300)。通道长度L由可得的袋内部测量值的长度(＝袋的长度LK)指导。待实现的袋长度LK由塑料袋中待实现的填充水平和塑料袋中的待实现的流体静压力指导。如果有必要，过高的流体静压力可被传送到尺寸适当、不接触产物从而可重复使用的外壳上。

通道长度L通常为所述塑料袋的长度LK的30％－95％，特别优选60％－90％。

含有由聚合物薄膜组成的塑料袋的本发明的固体分离器可例如根据US 6,186,932 B1中描述的方法生产，并需要调整焊缝。用于生产本发明的优选实施方案的分离装置的示例性实施方案在下文中进一步描述。

馈入装置通常由与产物接触的薄膜相同的材料制成，以允许用所述薄膜进行在无菌和强度方面完美的焊接。优选的产物接触的薄膜材料为本领域技术人员已知的具有各种交联程度的聚乙烯。根据应用和处理需要，使用的外部夹套薄膜是本领域技术人员已知的相对于内部薄膜熔点更高的各种材料，用于热焊接方法和/或更好的强度和/或扩散性质。

网板通常连结至支承板30，该支承板30提供支撑并且可通过粘合或焊接结合至所述塑料袋以实现精确定位。

在三维袋(由4个薄膜网焊接在一起的袋)中，有利地可使用如下堆叠板1，该堆叠板1的横截面为正方形、圆柱形、矩形或椭圆形，高宽比H/D为0.3<H/D<1.5，优选0.6<H/D<1.2，特别优选0.9<H/D<1.0。

适合用于更简单且更廉价的二维袋(由两个薄膜网焊接在一起的袋)的是如下的平面堆叠板，该平面堆叠板具有矩形横截面，H/D比率为0.005<H/D<1，优选0.02<H/D<0.6，特别优选0.1<H/D<0.4。根据堆叠板的高度，可在堆叠板和开始渐缩的位置之间留出一定距离以用于制造二维袋。

为了生产所述分离器，还准备了馈入装置和另外的适配件，并且如果合适的话，将其安装在塑料薄膜的适当位置。

然后，将塑料袋50与围封堆叠板1的塑料薄膜焊接在一起，以得到具有焊缝55的塑料袋50(图5)。

然后通常将包括支承板的堆叠板1压入抵住塑料袋50的内表面，以防止细胞侵入塑料袋50和堆叠板1之间而造成污染。

在所述生产方法的第一实施方案中，塑料袋50被紧扎在堆叠板1上(图5)，使用一个或多个紧固带60将形成的折叠部52压平并固定(图6)。紧紧围绕在袋和堆叠板周围的塑料薄膜也适合作为紧固带。有利的紧固性质见于例如家用薄膜或柔性的、薄的硅膜。将堆叠板1焊接到袋壁上还可适用于建立袋和堆叠板之间的紧密连接。

为了运行，本发明的装置相对于水平面以β＝10的角度定向。在运行过程中，角度β由细胞/固体的沉降和滑动性能控制，相对于水平面为30°≤β≤80°。在一个优选的实施方案中，相对于水平面，角度β为35°-75°，特别优选45°-60°。

为了确保运行过程中的角度β，本发明的固体分离器固定至框架140运行(图11-13)。

框架140通常包含框架底座145和支承件148，该支承件148相对于底座占用区具有预先确定的角度10(＝β)。在支承件148上，包含支承板30的堆叠板1借助突出部分142和/或盖板110以及紧固元件115保持在预先确定的高度，使得在运行过程中收获流收集区56(上部)和固体收集区57能够以最小褶皱放置在支承件上。这减少了死区和相应的污垢。

在优选的实施方案中，框架140具有用于容纳堆叠板1的外壳100和盖板110。

在这种情况下，紧固过程还可发生在以下过程中：将本发明的固体分离器装配到框架140上，更具体地，装配在外壳100和盖板110中(图6和7)，可能也不用紧固带60缠绕。因此，塑料袋50借助外壳100被保持就位在支承板30上和堆叠板1上，折叠部52借助盖板110被压到堆叠板1上。优选地，盖板110的一侧借助例如铰链紧固在外壳130上，另一侧借助一个或多个可锁定的紧固元件115紧固在外壳130上。这能够更加简单地操作框架140来启动本发明的固体分离器。

在优选的实施方案中，盖板110具有延伸部分112和/或框架体130，框架体130保持圆锥形渐缩的固体收集区57的形状，更具体地保持角度59恒定，以及防止固体收集区在运行过程中在充满的状态下膨胀。除此之外，这类形状匹配的容器有利于系统在相对大的流体静力下运行，如在当连接至大的生物反应器时所期望的。

本发明的倾斜通道固体分离器优选作为一次性物品实现，以避免清洁问题。

本发明的倾斜通道固体分离器存储起来节省空间，因为它们能够互相堆叠起来而不会有任何问题，并只有在启动期间装配成适当的角度。然后它们能够在生物反应器外被轻易连接和操作。

在其他实施方案中(图14和15)，本发明的倾斜通道固体分离器的上部区域为收集器，所述收集器例如由具有软管连接件的物品制成，该物品通过在车床上对尤其是由聚碳酸酯例如组成的塑料固体杆进行切割而成。主要适用于大量物品的情况下的其他方法为注射成型法。所述收集器展示出多个馈入装置(80)，用于去除与细胞分离的收获流(70)(＝收获物)的至少一个馈入装置连接至收获流收集区56。收获流收集区56由收集器中的凹陷形成，所述凹陷通向所述馈入装置80用于去除与细胞分离的收获流(70)。所述凹陷的横截面通常为圆形或正方形。优选地，所述横截面与上部插塞板的开口尺寸相适应，从而与网板基体的边缘尺寸相适应。所述凹陷的高度根据死容积的最小化和流体控制的优化被调整。所述凹陷的高度通常为1-5mm。所述凹陷也可为漏斗形状。

在该实施方案中，所述网板基体的上端和下端插入并用粘合剂接合在所谓的插塞板中。所述插塞板通常通过在车床和铣床上切割制成或者用注射成型法制成。所述插塞板优选由收集器的材料组成。所述插塞板展示出正方形开口，优选以预先确定的角度，用于插塞所述网板基体的上端和下端。所述插塞板通常为圆形。

优选地，漏斗形成下段和固体收集区(57)，所述固体收集区(57)具有一个或多个用于去除固体的馈入装置89。所述漏斗通常通过在车床上切割或用注射成型法制成，且具有下部软管连接。所述漏斗优选由插塞板的材料组成。所述漏斗的上部区域展示出一个或多个馈入装置或适配件84，所述馈入装置或适配件84用于经由横进表面面积510实现细胞培养液(＝馈入物)74的均匀水平流分布。可选的水平分布器可以通过两个或更多个呈几何学分布的孔形成，通常为两个相对的孔，在所述孔中，侧面的连接被胶合就位。所述漏斗通过粘合剂接合到下部插塞板。

优选地，向下渐缩的固体收集区(57)(特别以圆锥或棱锥的方式)具有相对于垂直面10°-60°的角度(58、59)。可单独选择角度58和59。

收集器、插塞板和漏斗通常能够抵抗弯曲以使所述倾斜通道固体分离器具有机械稳定性。

优选地，网板基体借助加强托架保持稳定。所述加强托架通过粘合剂接合被附接至网板基体以及上部和下部的插塞板，并且确保倾斜通道固体分离器具有足够的机械稳定性。

与现有技术的不锈钢倾斜通道分离器相比，复杂地制造所述基体(切割、大量焊接步骤和电抛光成非常平滑的成品)不适用于本发明的倾斜通道固体分离器(＝塑料板分离器)的情况。复杂的焊接被简单的粘合剂接合代替。生产本发明的倾斜通道分离器不需要用螺钉和密封。总之，与不锈钢的倾斜通道分离器相比，所述塑料板分离器的生产在时间和材料成本方面具有相当大优势。

本发明的所述倾斜通道固体分离器通常以如下步骤生产：

a.将网板基体切割成一定尺寸，更具体地锯成一定尺寸，

b.对网板基体进行去毛刺和清洁，

c.生产以下部件：

1)漏斗

2)两个插塞板

3)收集器

4)优选加强托架

d.将网板基体双向插入到插塞板中，粘合剂接合，优选使用UV-固化粘合剂例如Loctite 3211，

e.将上部插塞板通过粘合剂接合至收集器，

f.将下部插塞板通过粘合剂接合至漏斗，

g.附接并且粘合剂接合所述加强托架。

为了运行，倾斜通道固体分离器通常固定在控制台上。

由于塑料构造和其产生的较轻的重量，根据尺寸，由不锈钢制成的可重复使用的控制台就可满足安装需要。对于具有常规尺寸的倾斜通道分离器(分离器表面面积为0.15m²)，可实现约4kg的包括控制台的总重量(与相同尺寸的不锈钢相比，约40kg)。这使得不需要移动运输框架就可以轻易地移动本发明的一次性倾斜通道分离器。

通常，本发明的倾斜通道固体分离器借助软管线在外部联接至生物反应器，例如联接至US 2009-0180933中描述的一次性生物反应器。通过至少两个泵，优选低剪切蠕动泵，实现确保本发明的分离器的供应(图18)。泵允许从生物反应器空间去除细胞培养液，允许在穿过热交换器冷却之后将细胞培养液馈入到分离器装置中，允许从分离器装置去除收获流体以及将固体流反向运输(＝返回70)到生物反应器中。所需分离表面面积根据细胞的沉积性质和灌注速率和争取得到的细胞浓度确定。优选的灌注速率为0.1-40l/天，特别优选0.5-20l/天。根据细胞的沉积性质(根据细胞的浓度、大小和凝聚倾向)，优选的分离表面面积/生物反应器容积为0.1-100m²/m³，特别优选2-20m²/m³。

所描述的方法使得能够简便且节约成本地生产用于阻留和回流细胞的本发明的倾斜通道固体分离器。与不锈钢系统相比较，由于堆叠板的结构可以在较宽的范围内变化，可以容易且精确地限定后续的装置的几何形状，并且还能够提供用于非常大的生物反应器。所描述的方法使得能够特别节约成本地生产一次性元件，使用所述一次性元件能够使提供根据制药指南清洁的留滞系统所需要付出的努力减少到最低。

与发酵罐的连接借助无菌的连接器实现，所述无菌的连接器附接在软管线的末端、由不同制造商(Pall、Sartorius、Coulder)提供、且位于层流壳的内部或外部；但与发酵罐的连接优选通过软管焊接实现。因此，附接到本发明的固体分离器的所述软管线优选——至少一部分——设置有适合软管焊接的软管元件。此外，为了输送悬液，软管线通常包含至少两个特定的能够高度抵抗机械应力的软管元件(例如，由来自Verder的Verderprene弹性软管组成)，所述软管元件可被非侵入性地插入蠕动泵中，而不会危害分离器的无菌性。连接、运行和维护是没有问题的。将本发明的装置或本发明的装置的一部分制作成一次性元件，消除了清洁的问题。

为了改善细胞在堆叠板的通道内和圆锥形渐缩的固体收集区的内壁上的滑动性能，可以使用适当的方法将本发明装置制做成振动的，例如气动振动器或电动振动器。

如果气体施用所必需的气泡能够保持远离入口，那么在有氧的生物反应器中直接使用堆叠板1是理论上可行的。

但是，优选本发明的分离器意欲用于生物反应器外。

本发明还提供了由生物反应器和本发明所述的细胞分离装置之一组成的生物反应器单元。优选地，所述生物反应器是一次性反应器，更具体为US 2009-0180933中描述的反应器。

所述生物反应器单元为例如可以以已知的方式运行的灌注反应器。生长培养基被连续馈入到所述生物反应器中，并且含有低含量细胞的细胞培养物上清液被连续清除。灌注反应器能够以高灌注速率q/V(培养基通过量q/生物反应器容积V)运行，当从生物学的视角看时这是有用的，并且提供了足够的分离表面面积。在这种情况下，流体连续通过分离器。

灌注反应器还能够以这样的方式运行：最初允许培养物以分批方式达到高生长。当培养基被大量消耗到不再可能达到可观的生物质积累的程度时，通过外部细胞分离器去除几乎不含生物质的培养物上清液。然后可利用生物反应器中获得的空间馈入新鲜的生长培养基，使得能够进一步生长，从而得到更高的总生物质生产率(重复-分批方式)。在这种情况下，流体以分批的方式通过细胞分离器。该方法适用于例如待接种到非常大的生物反应器中的预培养物，因为该方法能够增加现存的预培养物生物反应器的生产率。

为了在生物反应器上运行，本发明的倾斜通道固体分离器的连续流体是优选的。

生物反应器或灌注反应器可用于培养在体外生长并且在游离悬液中或在微载体上的细胞。优选的细胞包括原生动物，以及例如为了产生特定的有效药学成分(例如病毒、蛋白质、酶、抗体、神经元、组织细胞或诊断结构)而进行遗传改型所得到的粘附性和非粘附性的人的真核细胞(神经、血液或组织细胞，以及胚胎来源或成体来源的干细胞)、动物或植物来源的真核细胞。特别优选地，使用适用于高性能药物生产的细胞，例如纤毛虫、昆虫细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HKB细胞(由人HEK 293细胞系与人伯基特淋巴瘤细胞系2B8融合产生)、杂交瘤细胞以及干细胞。

在所述单元的其他实施方案中，分批运行的本发明所描述的细胞分离器之一，在发酵完成后且在细胞被去除之前，与其他生物反应器或收获箱连接，目的是减少待施用到过滤器的细胞群，从而减少所需的过滤器表面面积。

阻留和回流固体(更具体为细胞)的方法在流体穿过的倾斜通道固体分离器中实施，含有固体的培养基以连续或分批的方式被馈入到所述倾斜通道固体分离器中，不含固体的培养基被清除，流率允许依据主导的Re<2300来保持层流状态，从而避免所分离的细胞对抗重力场的降低有效性的再悬浮。

雷诺数Re可根据eq.7由穿过横截面的平均流速w、流动培养基的运动粘性v和通道的内径d来计算：

Re＝(w·d/v)   (Eq.7)

在倾斜通道中，通道内壁上的流速低于通道中心内的流速。细胞在通道内沉积，并且在通道的下侧与流动方向相反的方向滑动至下部通道末端。去除了细胞的细胞培养液通过通道被释放到置于通道上部的收获流收集区56，并最终从容器中输送出去。

本发明的方法可优选在生物反应器外实施。为此，将含有细胞的细胞培养液从生物反应器输送到本发明的细胞分离器中。优选地，在细胞进入分离器之前将细胞在外部容器中冷却，目的是减慢代谢从而抵消降低生产率的细胞营养不足。在冷却的悬液中，不必需为沉积的细胞提供氧气。在大多数情况下，细胞培养液冷却至分离器的环境温度是完全足够的，因此，除了所需代谢效应外，还安全地避免了运流电流。为了监测充足的细胞营养，可以为分离器提供至少一个一次性传感器，例如用于测量氧气浓度和/或pH。传感器可以容纳在壁内和与生物反应器或收获容器连接的连接线中。

所述方法使得能够在流体连续通过的无菌塑料袋内有效地留滞和回流细胞。在留滞和回流过程中，仅通过温和的剪切力作用于细胞，细胞通常对温和的剪力是良好耐受的。将细胞在发酵温度或比发酵温度低的温度水平下置于分离装置中，并提供营养供应。

现将更加具体地参照附图阐明本发明的示例性实施方案，而不意欲对本发明进行限制。

图1示出了含有堆叠板的本发明的一次性固体分离器的简图。

图2示出了堆叠板1(纵截面)的简图。

图3示出了堆叠板1(纵截面)的简图。

图4是多种堆叠板的构造(来自图3的横截面AA‘)的简图。

图5是塑料袋50应用于堆叠板1(来自图3的横截面AA‘)的简图。

图6和图7示出将塑料袋50收紧并固定在堆叠板1上(横截面)。

图8和图9示出另一种使用框架体130和盖板110将塑料袋50收紧并固定在堆叠板1上(横截面)。

图10是在框架140上具有堆叠板1的本发明的固体分离器的侧视图。

图11是在框架140上具有堆叠板1的本发明的固体分离器的主视图。

图12是在框架140上具有堆叠板1的本发明的固体分离器的纵截面，该固体分离器具有框架体130和盖板110。

图13是在其框架140上具有堆叠板1的本发明的固体分离器的主视图，该固体分离器具有框架体130和盖板110。

图14是本发明的固体分离器的在其控制台上的纵截面、俯视图、横截面(A-A,C-C)和放大图(D)。

图15示出了本发明的固体分离器在其控制台上的三维简图。

图18是灌注反应器的流程图。为了降低生物反应器排出口中细胞的呼吸活性，排出后尽快在冷却装置中将其温度降低至更低水平。这防止细胞分离器中的细胞在氧气有限的状态下停留太长时间，这会在生理上损伤细胞。在所示的实例中，分离器640由分离袋620和一体的冷却装置600组成。由低剪切泵630和631调节生物反应器610和分离器640之间的液体流。也可以设想其他相互连接，例如两个泵630和631位于生物反应器排出口中。

参考标记：

1    堆叠板/分离器表面面积

5    支柱宽度

8    板间隔

10   角度

13   长度

15   宽度

18   高度

30   支承板

50   塑料袋

52   多余部分/折叠部

55   焊缝

56   收获流收集区

57   固体收集区

58   角度

59   角度

60   紧固带

70   收获流(收获物)

74   生物反应器混合物/馈入

79   回流

80   馈入装置

81   流体反向器

84   馈入装置

85   水平分布器

86   入口流

88   中央吸入口

89   馈入装置

90   连接板

100  外壳

110  盖板

112  延伸部分

115  紧固元件

130  框架体

140  框架

142  突出部分

145  框架底座

148  支承件

200  振动器

210  装配板

堆叠板的轮廓

311  堆叠板

320  矩形轮廓

321  堆叠板

330  圆形轮廓

331  堆叠板

340  圆形轮廓

341  堆叠板

350  6-角轮廓

351  堆叠板

500  收集器

510  插塞板

520  漏斗

530  加强托架

540  网板基体

550  控制台

600  冷却装置

610  生物反应器

620  分离装置

630,631  泵

640  分离器＝分离袋+可集成到框架或容器中的冷却装置

650  培养基

本发明的研究根据拨款协议“Bio.NRW:MoBiDik–ModulareBioproduktion–Disposable und Kontinuierlich”(Bio.NRW:MoBiDik–Modular bioproduction–Disposable and Continuous)(基金号w1004ht022a)得到资助，作为欧洲区域发展基金(ERDF)的一部分。

Claims (12)

1.含有堆叠板的倾斜通道固体分离器中的单层或多层塑料网板用于阻留来自反应器混合物的固体的用途。

2.一种倾斜通道固体分离器，其用于阻留和回流来自反应器混合物的固体，包含以下元件：

-所述固体分离器的上部区域，其具有一个或多个馈入装置/适配件(80)，用于从收获流收集区(56)去除与细胞分离的收获流(70)(＝收获物)，连接至

-由单层或多层塑料网板组成的堆叠板(1)形成的分离区，所述堆叠在运行过程中相对于水平面倾斜30°-80°的角度(10)，连接至

-所述固体分离器的下段，其具有一个或多个馈入装置或适配件(84)，用于所述反应器混合物(74)的流分布，下方是

-向下渐缩的固体收集区(57)，其用于借助重力收集所述细胞。

3.权利要求2的倾斜通道固体分离器，其中所述固体收集区(57)以圆锥或棱锥的方式向下渐缩。

4.权利要求2或3的倾斜通道固体分离器，其中所述固体收集区(57)具有一个或多个用于去除所述固体的馈入装置(89)或适配件(88)。

5.权利要求2-4中任一项的倾斜通道固体分离器，包含位于内部的至少一个一次性传感器。

6.权利要求2-5中任一项的倾斜通道固体分离器，其中所述分离区由堆叠板(1)中相互邻近排列的多个通道组成。

7.权利要求2-6中任一项的倾斜通道固体分离器，其中支柱高度与通道宽度的比率hs/d为0.01≤hs/d≤5，其中两个尺寸hs和d的限制为均大于或等于3mm。

8.权利要求2-7中任一项的倾斜通道固体分离器，其包含流体通过的γ-可灭菌的塑料袋(50)，在所述塑料袋(50)中：

-在所述塑料袋(50)的上部区域，用于从所述收获流收集区(56)去除与固体分离的收获流(70)的馈入装置/适配件(80)，

-在所述塑料袋(50)的中央区域的上段，具有由单层或多层塑料网板组成的堆叠板(1)的分离区，

-在所述塑料袋(50)的中央区域的下段，馈入装置或适配件(84)具有水平分布器(85)，用于经由横进表面面积(510)实现对细胞培养液(74)的均匀水平流分布，

-在所述塑料袋(50)的下部区域，以圆锥的方式向下渐缩的固体收集区(57)用于借助重力收集所述固体。

9.权利要求8的倾斜通道固体分离器，其中所述通道的通道长度L为所述塑料袋的长度LK的30％-95％。

10.权利要求8或9的倾斜通道固体分离器，其包含用于容纳所述固体分离器的容器，其中所述容器具有至少一个用于容纳所述固体分离器的内部和一个用于将所述固体分离器从上方装入所述容器内的开口，其中所述内部具有与所述固体分离器的形状相匹配的壁，所述壁围绕所述内部并将其与外界划分开。

11.权利要求2-7中任一项的倾斜通道固体分离器，其中：

-所述固体分离器的上部区域为具有收获流收集区(56)的收集器，连接至

-由单层或多层塑料网板组成的堆叠板(1)形成的分离区，该分离区形成网板基体，所述网板基体被插塞到顶部和底部处的插塞板中，并连接至

-所述固体分离器的下段，其具有一个或多个馈入装置或适配件(84)，用于所述反应器混合物(74)的流分布，下方是

-固体收集区(57)，其以圆锥的方式向下渐缩，用于借助重力收集所述细胞，

-其中所述下段和以圆锥方式向下渐缩的固体收集区(57)是一个漏斗，并且

-其中所述固体分离器的所有元件都由塑料组成。

12.一种生物反应器单元，其包含生物反应器，该生物反应器连接至根据权利要求2-11中任一项的倾斜通道固体分离器。