CN101469319B - 一种生产有效生物反应器的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产有效生物反应器的方法，该方法包括在本发明描述的生物反应器中培养动物细胞，通过反应器的器壁和细胞之间的摩擦增加动物细胞悬浮培养液中溶氧的方法。

Description

一种生产有效生物反应器的方法

发明领域

本发明涉及一种生产有效生物反应器的方法，该方法包括在本发明描述的生物反应器中培养动物细胞，通过反应器的器壁和细胞之间的摩擦增加动物细胞悬浮培养液中溶氧的方法。 

发明背景 

动物细胞的高密度悬浮培养是蛋白类药物或疫苗产品开发的有用工具。常常需要小体积的细胞培养罐用于动物实验研究的样品生产，较大体积的细胞培养罐用于临床研究药品的生产。许多细胞生物学家喜欢应用简化的小型悬浮培养装置，但放大专家则喜欢“易于优化”的大体积细胞反应器系统。 

目前的生物反应器培养罐和摇瓶的形状都是很典型的柱体形。这样的罐体或瓶工作体积的高∶径比大于1∶1。罐体中的培养基表面积不足于氧气被有效吸收。常用空气或氧气喷射来解决这一问题。然而，过量的空气喷射常产生泡沫和使气泡破裂，同样过量的氧气喷射也毒害细胞。因此，用较复杂的控制塔和相关的溶氧探头来监控空气或纯氧的喷射。不过，优化控制塔或探头比较昂贵。因此，需要开发无控制塔和无相关溶氧探头的小体积培养罐，特别是一次性罐体，和“易于优化”的大体积培养罐。 

本专利的这种设计允许不使用复杂的控制塔和相关的探头来大体积培养细胞，也开发了一次性或可灭菌的小体积摇瓶型的悬浮培养系统。还研究了一个“易于优化”的搅拌器驱动的大体积工业化倒置的平锥底生物反应器系统。 

本发明描述了一种生物反应器，即一种悬浮细胞培养罐，该培养罐是一种宽体平锥底可在摇床上用于悬浮培养动物细胞的细胞反应器，与传统的生物反应器和平底摇瓶相比。该培养罐可以使细胞液很容易地波及罐壁，产生很小的机械张力，形成了较宽的薄培养液层，有利于扩大表面积，增大气体交换量，改善混合效果。 

本发明进一步的利用该培养罐对培养液进行培养，发现了一种在培养液中增加溶解氧的方法。 

发明内容

本发明提供一种利用细胞培养罐对培养液进行培养的方法，特别是在本发明描述的培养罐中对培养液增加溶解氧的方法。 

对于细胞培养，本发明发现只要培养基表面积与培养基体积比高于0.14cm2/cm3，不利用复杂的控制塔和相关的溶氧和pH探头，也可以使悬浮的动物细胞生长良好，这种培养是在宽体平锥底培养罐(图1)中，通过底部的空气喷射或表面的纯氧供给，在37℃用带有20-25mM HEPS的无血清培养基进行培养的，与传统的柱体搅拌罐相比宽体平锥底摇瓶具有表面通气好的优势。 

本发明是首次利用摇瓶培养罐来培养动物细胞，惊奇的是，它们工作的效果比传统的Applikon平底反应器好，在细胞密度、重组蛋白产量、细胞活力和细胞皮实性方面优势明显，显然结合了摇床、平锥底、宽体和pH稳定的培养基，工作起来对动物细胞培养和重组蛋白的产量具有优势。 

本发明的宽体平锥底培养罐的特点是有效的锥体角度，用塑料的不同锥角的锥底离心管研究了锥角对固定转角摇动、培养基混合、接种体积的影响，发现如果锥角太小(比如小于30度，或者太宽，大于70度)，摇床不能使培养基很容易地波及管壁。 

本发明的宽体平锥底培养罐特点是3升悬浮培养罐不用复杂的控制塔和相关的溶氧、pH探头，通气是通过位于锥底最低点的空气喷射来进行，可延长气泡的行程，或者在培养基表面通纯氧。 

应用此种宽体平锥底培养罐研究了表达的TNFR1Fc-IL-lra，IL-18bp-Fc-IL-lra，VEGFR1-Fc-IL-lra，and Tie2-Fc-IL-lra的CHO细胞的培养，令人吃惊的是，宽体平锥底培养罐工作明显地好于平底的Applikon搅拌型反应器和平底的摇瓶，显然摇床摇动能够推动培养基波及罐体壁，且不产生剪切力和机械张力，形成较大范围的薄培养基层流，有利于扩大通气量， 

本发明是在上述宽体平锥底培养罐基础上，采用了溶氧探头、pH探头和相应的探测系统(www.flurometrix.com)(图2a，b).同时也利用数码相机拍照并研究宽体平锥底培养罐中培养基的运动规律。 

首先，测定了宽体平锥底培养罐中工作体积为150ml培养液的溶氧值(图3)。发现溶氧水平很容易达到100％(表1)。然后用空气泵在相同的罐中静态向培养液中 泵入空气，惊奇的是，在一定的时间内不能达到100％的溶氧(表2)，对这种现象非常惊奇，因为日常用的3升Applikon的反应器都是用泵入空气法来较正溶氧探头并设定溶氧为100％的，在这种现象的背后必然存在着一种作用机制。 

表1在150ml工作体积的宽体平锥底培养罐中加入新配制的培养基后，120rpm摇动(图3)每隔30分，测定一次溶氧。 

时间(分)	0	30	30	30
					DO％(溶氧值百  分比)	45	75	92	100

表2在150ml工作体积的倒置宽体平锥底培养罐中加入新配制的培养液静置，用空气泵向培养液中吹气增加溶氧(图4)，每隔30分测定一次溶氧值 

时间(分)	0	30	30	30
					DO％(溶解氧百  分比)	45	52	55	75

为了寻找答案，利用数码相机拍下了倒置宽体平锥底培养罐中培养液的瞬时运动时相(图5a，b，c，d)(图3)。所有的图片清晰地表明在瞬时运动中，培养液大部分波及培养罐的一侧，而另一侧则暴露在空气中。由于是倒置的锥底，摇动容易使培养液爬至罐壁上。这便产生了一种培养液流的圆形运动，重复摆动或冲刷着暴露于空气中的罐壁。我们设想，这种圆形运动与它重复的摆动增加了培养基中的溶氧。 

在微小的氧气泡中发现有溶解氧，氧与水或培养液混合存在，并能在水分子间形成小泡。根据上述，可能是在光滑的玻璃或塑料表面吸附着这些微小的氧气泡，并在瞬时的暴露于空气的过程中形成了微层的氧气泡。那么设想在光滑表面形成的这种瞬时的空气泡层是如此的小，以致于类似于水中的溶解氧的小泡大小。这种小泡层然后被吞噬或被循环的培养液流冲走，这样使得氧气更容易溶解于水中。这种循环运动不断地重复，因为是平锥底和摇动，使得溶氧水平的增加比直接向培养基中通气更有效。 

为了验证此假设，利用12ml的塑料管(NUNC公司产品)，装入4ml培养液并在转鼓上以每分60转的速度转动(图6a，b)。转动10分钟后，管中的所有培养液样品的 溶氧水平都达到了100％。这个研究表明在一定的转速或力量下，培养液流重复摆动或接触暴露于空气的光滑表面有效地增加了培养液的溶氧水平。 

在转瓶中悬浮培养CHOK细胞，转速为60-100转/每分，培养4天。恰好培养4天的培养液，其溶氧都达到了100％。但细胞根本没有生长。因此认为对适宜的悬浮细胞培养除了充足的溶氧外，还需要有效的的混合。然而，在50ml离心管中(NUNC公司产品)培养细胞，这种离心管呈倒置的平锥底，并置于摇床上摇动4天(图7)，所有的细胞生长良好，并很容易达到2.2％细胞压积。这一结果表明，对于优化的悬浮细胞培养，除了充足的溶氧外，混合运动是必要的。 

根据上面的发现，设计了几种反应器的样机，对于每一种型号的样机，采取了用外力重复使培养液流摆动或接触暴露于空气的光滑表面和足够的培养液混合运动来增加培养液中的溶氧(图8a，b，c)，细节将在例4中进一步讨论。 

同时也研究了在无血清培养液中培养表达TNFR2-Fc-IL-lra融合蛋白的CHO细胞的批式悬浮培养过程，明显地看到，倒置的宽体平锥底培养罐对优化溶氧水平、细胞密度和外源蛋白产量是非常理想的(表3)，细节在例1中讨论。 

根据以上研究，本发明提出一种利用本发明的细胞培养罐对培养液进行培养的方法，该方法包括的步骤是： 

步骤1：将细胞培养液置于具有光滑表面的宽体平锥底培养罐中； 

步骤2：使培养液在宽体平锥底培养罐运动。 

以上步骤中，不包括利用对细胞培养有明显的剪切力的方法。 

所述运动包括穿过暴露于空气的光滑培养罐表面的重复冲刷运动；或者培养罐的自转运动，使细胞培养基不断穿过暴露空气或氧气的光滑培养罐的上壁；或者，暴露于空气或氧气的自转多层圆盘不断地在培养基中转动。 

所述运动包括下述的任何运动：摇动、滚动、转动、摆动、前后来回运动和流动、喷射和流动。 

所述的宽体平锥底培养罐，其结构为： 

其中所述宽体平锥底培养罐如图1所示，其由三部分连接而成，上部有三个圆柱状出口，出口为圆柱状凸出于罐体并以左中右排列，中间出口大于两边出口；中部为圆柱状罐体和上下部相连；下部为平底圆锥状，圆锥底部为平面状。 

其中内壁为光滑表面，可以是玻璃材料、塑料材料、金属材料制成的。 

所述宽体平锥底培养罐，罐中可有一滚动的多层转盘可转动，能增加培养基中的溶解氧。 

所述宽体平锥底培养罐用于生产克隆细胞的皮实性筛选。 

本发明的方法，也可以在一种可调速自转型的圆形的罐体中进行，能够前后运动，能够做摆动运动。在罐体内部设计有转轴能使培养基随罐体转动而运动，使得培养基在转动时上移至罐体的上端并不时地降落于罐体的最下端，确保培养基的附加运动。 

附图说明：

图1a为宽体倒置平锥底悬浮动物细胞培养罐实体图 

图1b为宽体倒置平锥底悬浮动物细胞培养罐设计图(这是技术部定的10升罐体另件图2005.7.19) 

图2a为光度计DO/pH片状传感器探测技术图解 

图2b为光度计DO/pH片状传感器探测系统 

图3：为摇床上工作的倒置平锥底150ml工作体积培养罐 

图4：为用空气泵给培养基在静态状态下通气以增加溶氧水平 

图5a，图5b，图5c，图5d，为不同时相培养液冲刷罐壁的图相 

图6a，图6b，为转鼓培养和斜置的培养平面 

图7：为用倒置的平锥底的塑料管(直径3cm)来悬浮培养CHOK细胞，用恒定100％的溶氧，在可调的摇床上培养4天细胞密度很容易达到2％pcv.这就形成了一种有效的微型生物反应器系统，可用于细胞克隆高耐性筛选。 

图8a为圆形的自转型生物反应器，前后运动使培养液混合 

图8b为圆形自转型生物反应器，置于摇床上使培养液混合 

图8c为锥形自转生物反应器，内部设计了轨道 

图9a为倒置的平锥底10升罐底架，用于塑料培养袋的托架。(10升改进外罐体-铁板主视图) 

图9b为倒置的平锥底10升罐底架 

图10a为常用的光度计细胞克隆高耐力筛选和过程优化高通量微型生物反应器系统 

图10b为倒置平锥底多管摇瓶型的反应器，用于细胞株高耐力的筛选 

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 

实施例1：研究150ml工作体积的倒置宽体平锥底培养罐的批式培养 

利用小规模150ml摇瓶批式培养表达TNFR2-Fc-IL-1ra的CHO细胞，在无血清培养液B001中培养8天，用光度计溶氧探头传感检测系统(图2a，b)每天对溶氧进行测定，除了利用光度计溶氧探头传感检测系统外，用手提式pH计进行检测pH(图2b)，葡萄糖采用葡萄糖计来测量(图2b)。表3清晰地表明平锥底培养罐对优化溶氧、细胞密度和外源蛋白产量是非常理想的。 

表3：在150ml工作体积的平锥底罐中批式培养的DO、pH、葡萄糖、混合速度和温度数值 

天数	1	2	3	4	5	6	7	8
									DO％	100	100	100	100	100	100	100	100
pH	7.5	7.4	7.0	6.8	6.6	6.6	6.7	6.8
									葡萄糖g/L	1.5	1.5	1.2	0.8	0.5	0.3	0.2	0.1
温度	37	37	37	34	34	34	34	34
									混合速度(rpm)	120	120	120	120	120	120	120	120
表达滴度	22	55	115	220	415	530	705	750
									细胞密度 (pcv％)	0.3％	0.7％	1.5％	2.8％	3.2％	3.6％	3.2％	2.8％

实施例2：制作一次性塑料细胞培养袋，置于平锥底罐架上 

设计并制作了倒置的平锥底细胞反应器架和软的塑料袋(图9a，b)，设计的这些托架和袋置于可调运动幅度的摇床上。这种设计的平锥底罐在可调运动幅度的摇床上摇动以使培养液尽可能高地爬壁运动，尽可能容易地增加溶氧水平，以满足高密度细胞培养对氧气的需求。制作了3升、10升、20升、40升、100升、500升和1000升大小的托架和塑料袋模型来做测试。目的是制造更有效的低剪切力的一次性使用 的动物细胞反应器，用于研究开发和工业化生产使用。 

实施例3：设计摇动式的可装有多个平锥底瓶的多孔板，用于高通量筛选高滴度的高皮实的细胞克隆生产细胞株的高皮实性对特定蛋白药物的最终表达量和产业化放大过程中的稳定性至关重要，从成千上万的细胞克隆中筛选到的高表达细胞株，只有一些细胞株比较皮实，能满足工业化生产对细胞的要求，这些筛选到的较皮实的细胞株能高密度生长较长时间，并比最初筛选到的细胞克隆的表达滴度高10倍多。 

常用的用于细胞株皮实性筛选的小型生物反应器系统(www.flurometrix.com)对于高密度细胞培养不是最优化的，并且不能优化溶氧水平支持高密度细胞的生长。因此，它不具有筛选高皮实性细胞克隆的能力，如果没有充足的培养液溶氧，无法优化高密度细胞的批式培养。 

这种设计的多瓶孔板，置于摇床上，能提供充足的溶氧，主要是由于摇动和平锥底的摇瓶，能支持高密度细胞的生长，因此，能够在高密度细胞培养条件下筛选特定细胞株的最高表达能力，并能从低皮实性细胞克隆中分离出较皮实的细胞克隆，这种系统易于操作，而且成本低。 

实施例4：增加培养液中的溶氧并结合有效的混合运动来设计更有效的生物反应器 

根据前面做的转鼓实验(图6a，b)，发现了一种增加动物细胞培养液中溶氧的方法。并据此设计了转动式的生物反应器(图8a，b，c)，图8a显示的是一个球型的自转生物反应器，通过反复地冲冼暴露于罐内壁表面的空气。这种转动有利于增加培养液中的溶氧以支持高密度细胞的生长。自转中前后运动使得培养液能更好的混合(图8a)，所有这些都有利于支持优化悬浮细胞的培养。 

图8b显示的是一个球型的自转生物反应器，这种自转运动可以通过反复的冲冼暴露于罐内壁表面的空气来增加溶氧水平以支持高密度细胞的生长。自转中水平面的摇动使得培养液能很好的混合，这些都支持优化悬浮细胞的培养。 

图8c显示的是一种锥型的自转生物反应器，这种自转运动可通过反复的冲冼暴露于罐内壁表面的空气来增加培养液中的溶氧水平，而罐内设计的轴在自转过程中可使培养液运动至最上端，并回到最下端，这种附加的运动有助于自转过程中培养液的混合，这些都有利于悬浮细胞的培养。 

Claims (1)

1.一种利用运动使罐体中细胞培养液反复冲刷光滑的罐体内表面能增加动物细胞悬浮培养液中溶解氧的方法，以此方法用于动物细胞培养，该方法包括以下步骤：

步骤1：将细胞培养液置于具有光滑表面的宽体平锥底培养罐中；

步骤2：使培养液在宽体平锥底培养罐中运动；

其中所述培养罐如图9示，做成一个一次性的塑料袋用作细胞培养的反应器，置于用金属或塑料材料做的宽体锥底托架中用于细胞培养；

所述培养罐，罐中有一滚动的多层转盘可转动，能增加培养基中的溶解氧；

所述运动为培养液穿过暴露于空气或氧气的自转多层圆盘不断地在培养基中转动。

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