CN101812404B

CN101812404B - 罐外循环的流化床式细胞反应器及培养动物细胞方法

Info

Publication number: CN101812404B
Application number: CN 201010156171
Authority: CN
Inventors: 惠识瑶
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: CN101812404A

Abstract

罐外循环的流化床式细胞生物反应器及培养动物细胞方法。现有的反应器采用插入罐体内的机械搅拌过程，搅拌装置结构及其润滑物质经常带来的微生物污染的问题，搅拌润滑带入杂菌的情况发生率高，由于机械搅拌的剪切造成细胞死亡。本产品组成包括：其组成包括：反应罐罐体(100)，反应罐罐体底部连接摇床(50)，摇床摇动使反应罐体作偏心转动，反应罐的上部装有外导管(108)，外导管的进口开在反应罐圆锥部分的内壁上，外导管沿罐体外绕罐体旋下，外导管的出口端的回液口(106)从罐体底部的中心进入反应罐体内，反应罐罐体上具有带进口管和出口管的罐盖，反应罐罐体内具有细胞生存区域，细胞生存区域上方具有锥形滤网(112)。本发明为动物细胞培养提供了优质环境。

Description

罐外循环的流化床式细胞反应器及培养动物细胞方法

技术领域：

本发明涉及一种细胞生物反应器，具体涉及一种用于动物细胞培养的罐外循环的流化床式细胞反应器及相关培养动物细胞方法。

背景技术：

目前世界生物技术制药产业发展迅猛，并已取得了巨大的成就。通过动物细胞体外培养表达和生产各类诊断和治疗用单克隆抗体，疫苗，生长因子等生物活性蛋白质具有十分广泛的市场应用前景。因此，用来大规模高密度培养动物细胞的细胞生物反应器，就成了生物技术制药产业中最重要的装备。它很大程度上决定了生物技术制药企业的产品成本，生产规模和产品种类。现有的反应器采用插入罐体内的机械搅拌过程，搅拌装置结构及其润滑物质经常带来的微生物污染的问题，搅拌润滑带入杂菌的情况发生率高，一旦杂菌污染，就会造成细胞死亡，或者由于机械搅拌的剪切造成细胞死亡，而且大规模高密度的培养，往往溶氧水平低，不能满足需要，也是造成密度不高，表达量偏低的重要原因。

发明内容

本发明的目的是提供一种性能独特，原理创新的罐外循环的无搅拌装置的流化床式细胞反应器的实现方法。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

罐外循环的流化床式细胞反应器，其组成包括：反应罐罐体，所述的反应罐罐体底部连接摇床，所述的反应罐的上部装有外导管，所述的外导管的进口开在所述的反应罐圆锥部分的内壁上，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下，所述的外导管的出口端的回液口从罐体底部的中心进入所述的反应罐体内，所述的反应罐罐体上具有带进口管和出口管的罐盖，所述的反应罐罐体内具有细胞生存区域，所述的细胞生存区域上方具有锥形滤网。

所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的反应罐罐体上部为圆台形、下部为圆柱形、底部为圆锥形，所述的细胞生存区域包括空套管和锥形滤网，所述的空套管通过微孔板连接所述的反应罐罐体，所述的锥形滤网下端连接微孔板，大孔微载体悬浮在所述的微孔板和所述的锥形滤网之间。

所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的反应罐罐体上部的半锥角α为25°-55°，所述的反应罐体外部具有保温水夹套、所述的反应罐体内侧底部有圆锥形底和回液口，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下的角度为180度。

所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，进气管上端穿过所述的罐盖，所述的进气管的另一端为出气矩形管并伸到罐内，所述的出气矩形管上具有出气微孔，所述的出气矩形管安装在外导管的液面之下，所述的反应罐罐盖上装有进液管、出液管、溶氧探头、P H探头和温度探头，所述的反应罐罐体下部圆柱体与圆锥底面之间通过圆角过渡，所述的圆锥底面有天圆地方结构连接到外导管末端的回液口。

一种利用罐外循环的流化床式细胞反应器培养动物细胞的方法，

加培养基至反应罐工作容积后，启动摇床，然后加大孔微载体到培养液中后，再将动物活性细胞接种到大孔微载体中，随着培养基在罐内作圆周振荡运动，开在圆锥内壁上的外导管进口将上部的培养液导至外导管中；同时培养液在罐体上部，外导管上部空间和外导管液面下区域中进行溶氧；经过罐底回液口出来的营养液由下向上螺旋上升穿过细胞生存区域，给活性动物细胞输送营养和氧气；由于摇床的离心力作用下培养液向外并向上运动穿过锥形滤网进入外导管，因锥形滤网的作用，大孔载体及其上的细胞均被挡在锥形滤网之下，进入外导管的培养基落回到外导管下端的回液口，重新进入罐内后，再由下向上做螺旋上升运动，直至再次进入外导管进口，经过反复循环，直到营养被动物细胞汲取完成；补充氧气和营养，开始下一个循环流。

所述的利用罐外循环的流化床式细胞反应器培养动物细胞的方法，所述的培养液在外导管的液面之下液体溶氧区域进行溶氧是指在此溶氧区中，由进气管把混合气由罐外输入，经进气管下部的出气矩形管上的出气微孔，进入外导管液面下部与做圆周震荡的培养液面，形成气-液相混合的溶氧过程，混合气体溶解混合于培养液中，并随培养液做循环流动；在振荡回流的作用下，外导管中的培养液向下流动到底部之后，经回液口再次回到罐体内底部，然后向上呈螺旋上升的轨迹运动，穿过细胞生存区，把营养和溶解氧输送给细胞。

所述的利用罐外循环的流化床式细胞反应器培养动物细胞的方法，所述的通过细胞生存区域给活性动物细胞输送营养和氧气过程中，所述的细胞生存区域包括微孔板、空套管、锥形滤网和罐体内壁构成的空间，其中填满大孔微载体，细胞就贴附于大孔微载体之中，作为活性动物细胞的生存区域，当培养液流穿过细胞的生存区域时，将营养和氧气带给细胞，并将排泄物带走，完成为细胞提供营养物质和溶解氧的过程，所述的出气管的出口压力为4000Pa，营养液体温度为35--38℃，冲击波频率为75-110次/分钟。

本发明的有益效果：

1.就细胞生物反应器本身而言，面对动物细胞大规模高密度培养的要求，细胞生物反应器必须解决自身功能的放大和强化问题，这些困难主要源于两方面的矛盾；一方面用于培养过程的生物反应器必须有足够的气液传质能力并能提供良好的流体混合条件和生存条件，否则就难以支持细胞的生长。尤其在大规模高密度细胞培养过程中这一要求更加苛刻，细胞生物反应器在培养细胞过程中，需要确保提供良好的传质混合能力。本产品有效的克服了现在技术的缺点和不足，通过偏心旋转将溶氧流体通过外导管输出并回流到罐内，形成罐内的液体通过外导管的循环运动在振荡环流混合的作用下溶氧。由于不存在机械搅拌力，剪切力小，在罐内外的循环的振荡环流混合过程中，溶氧速度快、工作容积可线性放大、结构简单但非常有效。本产品脉冲式的供氧、供养分的方式仿生命程度高，为生存大孔微载体中的细胞赋予了仿生命特征的良好生存条件，可应用到人体活性细胞和动物活性细胞培养过程中。

2.另一方面，由于动物细胞对剪切力敏感性，生物反应器中因搅拌和鼓泡产生的流体剪切力和气泡破裂会无可避免的导致细胞损伤甚至死亡，造成培养失败。所以，为了实现细胞生物反应器在培养细胞过程中，既要确保提供良好的传质混合能力，又要尽可能使流体剪切力降低来减少对细胞的损伤，从而确保大规模高表达的蛋白质生产，尽可能的降低微生物的污染概率，本发明的方案中，反应器的罐体内取消了传统的机械搅拌装置，这样就彻底消除了由搅拌装置结构泄漏所带来的微生物污染的问题和细胞破损。同时，没有机械搅拌装置，也大大降低了搅拌剪切力和设备成本。

3.本产品的细胞生长区域-填充床与气-液混合溶氧区域分开，也避免了气泡破裂给细胞带来的损伤又提高了溶氧速度。既确保大规模高表达的蛋白质生产，又尽可能的降低了微生物的污染概率。

附图说明：

附图1是本发明的主视结构示意图。

附图2是附图1的左视图。附图3是附图1的俯视图。

具体实施方式：

实施例1：

罐外循环的流化床式细胞反应器，其组成包括：反应罐罐体100，所述的反应罐罐体底部连接摇床50，摇床摇动使反应罐体作偏心转动。所述的反应罐罐体100上部为圆台形107、下部为圆柱形109、底部为圆锥形120，所述的圆台形的上部装有外导管108，所述的外导管的进口开在所述的反应罐圆锥部分的内壁上，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下，所述的外导管在罐体外绕罐体180⁰，所述的外导管的出口端的回液口106从罐体底部的中心进入所述的反应罐体内，所述的反应罐罐体上具有带进口管和出口管的罐盖，所述的反应罐罐体装有上盖101，上盖上的进气管85、出液管86、进液管87、溶氧探头80、PH探头81和温度探头穿过上盖进入罐体，所述的反应罐罐体内具有由锥形滤网112、空套管116、微孔板110和大孔微载体组成的细胞生存区域。

实施例2：

实施例1所属的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的细胞生存区域中具有微孔板110、空套管116和大孔微载体111，反应罐罐体100内圆柱形109内壁和圆台形107内壁连接上端锥形滤网、下端连接微孔板110，所述的微孔板110连接空套管116构成细胞生存区域，所述的细胞生存区域与反应罐罐体中心线同心，所述的反应罐体底部的圆锥形120下端圆口连接外导管末端的回液口116，这样就在罐体底部实现了和外导管的相通；所述的反应罐罐体100有底盘102，所述的反应罐100与摇盘50之间通过底盘102连接，所述的反应罐罐体100装有上盖101，所述的反应罐罐体100与上盖之间用螺栓连接；所述的外导管进口105在圆台形表面上端，所述的外导管108绕罐体180⁰，根据不同情况，最大不超过360度，最小不小于90度，所述的上盖101上具有进气管85、进液管87、出液管86、溶氧探头80和PH探头81。

实施例3：

实施例1或2所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的反应罐罐体上部圆台形的表面的半椎角α为25°到55°，例如30°或者35°、40°、45°或者50°，可以根据需要的营养液的溶氧水平和要求循环的速度通过实验确定，一般在30-42°之间都是比较好的，所述的反应罐体外部有保温水套104。

所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的反应罐罐体与摇床之间用螺栓固定；所述的罐体与上盖之间用“O”形胶圈来密封；所述的反应罐罐体下部的圆柱形有圆角过渡到底部圆锥形，所述的反应罐体内侧底部有圆锥形，由天圆地方结构过渡到回液管106再连接到外导管下部末端。

实施例4：

以上实施例所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的摇床50设置在地面上，所述的反应罐体100放在摇床50上，用螺栓紧固连接，当摇床摇动时，使反应罐体偏心转动，罐内培养液产生圆周振荡运动，而没有中心死角，培养液的静态平液面变成振荡液面即动态液面115，并绕罐体中心线转动；同时有罐内循环结构和外导管的作用，罐体内外的培养液实现了垂直方向的循环流动。

实施例5：

实施例1所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的外导管108，其外导管进口105开在罐体内侧圆锥表面上，所述的外导管绕罐体外180⁰，所述的外导管的下部末端的回液口106连接到罐体底部的圆锥下端口，做圆周振荡运动的培养液流进外导管进口105，后经外导管108末端的回液口106流回到罐内，然后从下向上做螺旋上升运动，随着罐体的圆周震荡运动培养液流一直上升到外导管进口105再次进入到外导管内如此循环往复，形成罐内的培养液循环流。

实施例6：

实施例1所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，所述的细胞生存区域的上部是锥形滤网连接反应罐上部圆台形表面，下部是微孔板112与空套管116连接向内至空套管的外壁，向外至罐体的圆柱内壁109，形成细胞生存区域，并由大孔微载体充满其间。

混合气体由进气管进入罐体内，由进气管另一端位于外导管液面下的出气矩形管上的出气微孔进入外套管液面下的液体中，其余的气体从液面逸出，并与做圆周振荡和冲刷罐体内表面的培养液进行气-液相混合，溶混合气体中的氧气进入培养液中，同时含有溶解氧的培养液流入外导管中，然后又经下部回液口106回到罐体底部，再向上做螺旋上升运动，流经填充床，供给营养物质和溶解氧给在大孔微载体上贴附的细胞。

实施例7：

一种利用罐外循环的流化床式细胞反应器及培养动物细胞方法，加培养基至反应罐工作容积后，启动摇床，将大孔微载体加入到罐内培养液中，然后将动物活性细胞接种到大孔微载体中；随着罐体做圆周振荡运动，罐内上部培养液进入外导管105，同时，在罐体上部和外导管下部培养液面之下的空间气-液相混合，将混合液中的氧气溶入培养液中，这些含有溶解氧的培养液被外导管108引导至罐体底部的回液口，重新进入罐体内，从下向上做螺旋上升运动，穿过填充床时，把营养和溶解氧输送给活性动物细胞；随后培养液继续向上做螺旋上升运动，直至再次进入外导管进口，经过反复循环，直到营养被动物细胞汲取完成；补充氧气和营养，开始下一个循环流。

实施例8：

实施例1所述的利用无搅拌装置的流化床式细胞反应器培养活性细胞的方法，所述的通过细胞生存区域给活性动物细胞输送营养和氧气过程中，所述的细胞生存区域包括由微孔板、空套管、锥形滤网和罐体内壁构成的空间，其中填满悬浮的大孔微载体，细胞就贴附于大孔微载体之内，作为活性动物细胞的生长区域，当培养液流穿过时，将营养和溶解氧带给细胞，并将排泄物带走，完成为细胞提供营养物质和溶解氧的过程，所述的出气管的出口压力为4000Pa，营养液体温度为35--38℃，冲击波频率为75-110次/分钟。

Claims

1.一种罐外循环的流化床式细胞反应器，其组成包括：反应罐罐体，其特征是: 所述的反应罐罐体底部连接摇床，所述的反应罐的上部装有外导管，所述的外导管的进口开在所述的反应罐圆锥部分的内壁上，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下，所述的外导管的出口端的回液口从罐体底部的中心进入所述的反应罐体内, 所述的反应罐罐体上具有带进口管和出口管的罐盖，所述的反应罐罐体内具有细胞生存区域，所述的细胞生存区域上方具有锥形滤网。

2.根据权利要求1所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，其特征是：所述的反应罐罐体上部为圆台形、下部为圆柱形、底部为圆锥形，所述的细胞生存区域包括空套管和锥形滤网，所述的空套管通过微孔板连接所述的反应罐罐体，所述的锥形滤网下端连接微孔板，大孔微载体悬浮在所述的微孔板和所述的锥形滤网之间。

3.根据权利要求1或2所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，其特征是：所述的反应罐罐体上部的半锥角α为25°-55°，所述的反应罐体外部具有保温水夹套、所述的反应罐体底部有圆锥形下端圆口，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下的角度为180度。

4.根据权利要求1或2所述的罐外循环的流化床式细胞反应器，其特征是：进气管上端穿过所述的罐盖，所述的进气管的另一端为出气矩形管并伸到罐内，所述的出气矩形管上具有出气微孔，所述的出气矩形管安装在外导管的液面之下，所述的反应罐罐盖上装有进液管、出液管、溶氧探头、pＨ探头和温度探头，所述的反应罐罐体下部的圆柱形由圆角过渡成底部圆锥形，所述的反应罐体内侧底部有圆锥形，由天圆地方结构过渡到回液口，再连接到外导管下部末端。

5.一种利用权利要求1或2或3或4所述的罐外循环的流化床式细胞反应器培养动物细胞的方法，其特征是:

加培养液至反应罐工作容积后，启动摇床，然后加大孔微载体到培养液中后，再将动物活性细胞接种到大孔微载体中，随着培养液在罐内作圆周振荡运动，开在圆锥内壁上的外导管进口将上部的培养液导至外导管中；同时培养液在罐体上部，外导管上部空间和外导管液面下区域中进行溶氧；经过罐底回液口出来的培养液由下向上螺旋上升穿过细胞生存区域，给活性动物细胞输送营养和氧气；由于摇床的离心力作用下培养液向外并向上运动穿过锥形滤网进入外导管，因锥形滤网的作用，大孔载体及其上的细胞均被挡在锥形滤网之下，进入外导管的培养基落回到外导管下端的回液口，重新进入罐内后，再由下向上做螺旋上升运动，直至再次进入外导管进口，经过反复循环，直到营养被动物细胞汲取完成；补充氧气和营养，开始下一个循环流。