CN101831385B

CN101831385B - 罐外循环的填充床式细胞反应器及培养动物细胞方法

Info

Publication number: CN101831385B
Application number: CN 201010156153
Authority: CN
Inventors: 惠识瑶
Original assignee: HUI ZHIYAO
Current assignee: HUI ZHIYAO
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: CN101831385A

Abstract

罐外循环的填充床式细胞生物反应器及培养动物细胞方法。目前世界生物技术制药产业发展迅猛，并已取得了巨大的成就。现有的反应器采用插入罐体内的机械搅拌方式，搅拌装置结构及其润滑物质经常带来的微生物污染的问题，或者由于机械搅拌的剪切造成细胞死亡，而且高密度的培养，往往溶氧水平偏低，不能满足需要。本产品组成包括：反应罐罐体(100)，所述的反应罐罐体底部连接摇床(50)，所述的反应罐的上部装有外导管(105)，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下并在底部回到罐体内，所述的外导管的进口开在所述的反应罐的圆台形内壁上，所述的外导管的出口端的回液口(106)从罐体底部的中心进入所述的反应罐体内，所述的反应罐罐体上具有带进出气管和出气管(85)的罐盖，所述的反应罐罐体内具有填充片状微载体(111)的填充床。本发明为动物细胞培养提供了优质环境。

Description

罐外循环的填充床式细胞反应器及培养动物细胞方法

技术领域：

本发明涉及一种细胞生物反应器，具体涉及一种用于动物细胞培养的罐外循环的无机械搅拌装置的填充床式细胞反应器及培养动物细胞方法。

背景技术：

目前世界生物技术制药产业发展迅猛，并已取得了巨大的成就。通过动物细胞体外培养表达和生产各类诊断和治疗用单克隆抗体，疫苗，生长因子等生物活性蛋白质具有十分广泛的市场应用前景。因此，用来大规模高密度培养动物细胞的细胞生物反应器，就成了声物技术制药产业中最重要的装备。它很大程度上决定了生物技术制药企业的产品成本，生产规模和产品种类。现有的反应器采用插入罐体内的机械搅拌方式，搅拌装置结构及其润滑物质经常带来的微生物污染的问题，搅拌润滑带入杂菌的情况发生率高，一旦杂菌污染，就会造成细胞死亡，或者由于机械搅拌的剪切造成细胞死亡，而且高密度的培养，往往溶氧水平偏低，不能满足需要，也是造成密度不高，表达量偏低的重要原因。

发明内容：

本发明的目的是提供一种性能独特，原理创新的罐外循环的无搅拌装置的填充床式细胞反应器的实现方法。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

一种罐外循环的填充床式细胞反应器，其组成包括：反应罐罐体，所述的反应罐罐体底部连接摇床，所述的反应罐的上部装有外导管，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下并在底部回到罐体内，所述的外导管的进口开在所述的反应罐的圆台形内壁上，所述的外导管的出口端的回液口从罐体底部的中心进入所述的反应罐体内，所述的反应罐罐体上具有带进出气管和出气管的罐盖，所述的反应罐罐体内具有填充片状微载体的填充床。

所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的反应罐罐体上部为圆台形、下部为圆柱形、底部为圆锥形，所述的填充床包括空套管，所述的空套管通过下孔板连接所述的反应罐罐体，所述的空套管上端连接上孔板，片状微载体充填在所述的下孔板和所述的上孔板之间，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋转的角度为180度。

所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的反应罐罐体上部的半锥角α为25°-55°，所述的反应罐体外部具有保温水夹套、所述的反应罐体内侧底部有圆锥形口和回液口。

所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的进气管上端穿过所述的罐盖，所述的进气管的另一端为出气矩形管并伸到罐内，所述的出气矩形管上具有出气微孔，所述的出气矩形管安装在外导管的液面下，所述的反应罐罐盖上装有进液管、出液管、溶氧探头、P H探头和温度探头，所述的反应罐罐体下部圆柱体与圆锥底面之间通过圆弧过渡，所述的圆锥底面有天圆地方结构连接到外导管末端的回液口。

一种利用罐外循环的填充床式细胞反应器培养动物细胞的方法，

加培养基至反应罐工作容积后，启动摇床，将动物活性细胞接种到填充床的片状微载体中；开在圆锥内壁上的外导管进口将上部的培养液导至外导管中；培养液在罐体上部，外导管上部空间和外导管液面下区域中进行溶氧；经过回液口出来的营养液向上穿过填充床过程中，给活性动物细胞输送营养和氧气；由于在摇床的离心力作用下培养液向外并向上运动进入外导管进口，培养液在外导管的引导下回到罐体底部，然后由下向上做螺旋上升运动，直至再次进入外导管进口，经过反复循环，直到营养被动物细胞汲取完成；补充氧气和营养，开始下一个循环流。

所述的利用罐外循环的填充床式细胞反应器培养动物细胞的方法，所述的培养液在与外导管下部的液体溶氧区域进行溶氧是指在溶氧区域中，由进气管把混合气由罐外输入，经进气管下部的出气矩形管上的出气微孔，进入外导管液面下的液体中与做圆周震荡的培养液，形成气-液相混合的溶氧过程，混合气体中的氧气溶解混合于培养液中，并随培养液做循环流动；在振荡回流的作用下外导管中的培养液向下流动；经回液口再次回到罐体底部向上呈螺旋上升的轨迹运动。

所述的利用罐外循环的填充床式细胞反应器培养动物细胞的方法，所述的通过填充床给活性动物细胞输送营养和氧气过程中，所述的填充床包括由上孔板和下孔板与空套管和罐体圆柱形内壁构成的空间，其中填满片状微载体，细胞就贴附于片状微载体之上，作为活性动物细胞的生存区域，当培养液流穿过填充床时，将营养和氧气带给细胞，并将排泄物带走，完成为细胞提供营养物质和溶解氧的过程，所述的出气管的出口压力为4000Pa，营养液体温度为35--38℃，冲击波频率为75-110次/分钟。

有益效果：

1.就细胞生物反应器本身而言，面对动物细胞大规模高密度培养的要求，细胞生物反应器必须解决自身功能的放大和强化问题，这些困难主要源于两方面的矛盾；一方面用于培养过程的生物反应器必须有足够的气液传质能力并能提供良好的流体混合条件，否则就难以支持细胞的生长。尤其在大规模高密度细胞培养过程中这一要求更加苛刻，细胞生物反应器在培养细胞过程中，需要确保提供良好的传质混合能力。本产品有效的克服了现在技术的缺点和不足，通过偏心旋转将溶氧流体通过外导管输出并回流到罐内，形成罐内的液体通过外导管的循环运动在振荡环流混合的作用下溶氧。由于不存在机械搅拌力，剪切力小，在罐内外的循环过程中，溶氧速度快、工作容积可线性放大、结构简单但有效。本产品脉冲式的供氧、供养分的方式仿生命程度高，为生存在填充床中片状微载体中的细胞赋予了仿生命特征的良好生存条件，可应用到人体活性细胞和动物活性细胞培养过程中。

2.另一方面，由于动物细胞对剪切力敏感性，生物反应器中因搅拌和鼓泡产生的流体剪切力和气泡破裂会无可避免的导致细胞损伤甚至死亡，造成培养失败。所以，为了实现细胞生物反应器在培养细胞过程中，既要确保提供良好的传质混合能力，又要尽可能使流体剪切力降低来减少对细胞的损伤，从而确保大规模高表达的蛋白质生产，尽可能的降低微生物的污染概率，本发明的方案中，反应器的罐体内取消了传统的机械搅拌装置，这样就彻底消除了由搅拌装置结构泄漏所带来的微生物污染的问题和机械搅拌破损问题。同时，没有机械搅拌装置，也大大降低了搅拌剪切力和设备成本。

3.本产品的细胞生长区域-填充床和气-液混合溶氧区域分开，也避免了气泡破裂给细胞带来的损伤。既确保大规模高表达的蛋白质生产，又尽可能的降低了微生物的污染概率。

附图说明：

附图1是本发明的主视结构示意图。

附图2是附图1的左视图。

附图3是附图1的俯视图。

具体实施方式：

实施例1：

罐外循环的填充床式细胞反应器，其组成包括：反应罐罐体100，所述的反应罐罐体连接摇床50，摇床摇动使反应罐体作偏心转动。所述的反应罐罐体100上部为圆台形107、下部为圆柱形109、底部为圆锥形120，所述的圆台形的上部开有外导管进口105，外导管在罐体外绕罐体旋下并在底部回到罐体内，所述的外导管在罐体外绕罐体1800左右，所述的外导管的回液口106在罐体底部的中心进入所述的反应罐体内，所述的反应罐罐体上盖具有带进气管85的罐盖，出液管86、进液管87、溶氧探头80、P H探头81穿过罐盖进入到罐体中，所述的反应罐罐体内具有由上孔板110、下孔板112、空套管116及片状微载体111组成的填充床。

实施例2：

实施例1所属的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的填充床包括上孔板110、下孔板112、空套管115和片状微载体111。所述的反应罐罐体100内圆柱形109内壁连接下孔板112和空套管115，所述的空套管115上端连接上孔板110，所述的上孔板110、空套管115、下孔板112构成填充床，片状微载体111充填在所述的下孔板和上孔板之间。所述的填充床与反应罐罐体100中心线一致。所述的反应罐有底盘102，所述的反应罐110与摇盘50之间通过底盘102连接，所述的反应罐罐体100装有上盖101，所述的反应罐罐体100与上盖之间用螺栓连接。

所述的外导管进口105在圆台形表面上端，所述的外导管108绕罐体1800左右不超过360度不小于90度，所述的上盖101上的进气管85、进液管87、出液管86、溶氧探头80和P H探头81穿过罐盖进入到罐体中。

实施例3：

实施例1或2所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的反应罐罐体上部圆台形的表面的半椎角α为25°到55°，例如30°或者35°、40°、45°或者50°，可以根据需要的营养液的溶氧水平和要求循环的速度通过实验确定，一般在30-42°之间都是比较好的，所述的反应罐体外部有保温水套104。

所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的反应罐罐体与摇床之间用螺栓固定；所述的罐体与上盖之间用“O”形胶圈来密封；所述的反应罐罐体下部的圆柱形有圆角过渡到底部圆锥形，所述的反应罐体内侧底部有圆锥形，通过天圆地方结构过渡连接到外导管下部末端。

实施例4：

以上实施例所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的摇床50设置在地面上，所述的反应罐体100放在摇床50上，用螺栓紧固连接，当摇床摇动时，是反应罐体偏心转动，罐内培养液产生圆周振荡运动，而没有中心死角，培养液的静态平液面变为振荡液面即动态液面115，并绕罐体中心线转动；加上罐内外循环结构的作用，实现了罐体内培养液的垂直方向的循环流动。

实施例5：

实施例1所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的外导管108，其外导管进口105开在罐体内侧圆锥表面上，所述的外导管绕罐体外1800，所述的外导管的下部末端的回液口106连接到罐体底部的圆锥体末端口，做圆周振荡运动的培养液流进外导管进口105，后经外导管108再经回液口106流回到罐内，从下向上做螺旋上升运动，随着罐体的圆周震荡运动培养液流一直上升到外导管进口105再次进入到外导管内如此循环往复，形成罐内的培养液循环流。

实施例6：

实施例1所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，所述的填充床的上部是上孔板110连接到空套管116的上端，下部是下孔板112与空套管116连接向内至空套管的外壁，向外至罐体的圆柱内壁113，形成填充床的空间，并由片状微载体充满。

混合气体由进气管进入罐体内由进气管的另一端位于外导管液面下的出气矩形管上的出气微孔出气进入外导管的液面下，与做圆周振荡和冲刷罐体内表面的培养液进行气-液相混合，溶混合气体中的氧气进入培养液中，同时含有溶解氧的培养液流入外导管中，然后又经下部回液口106回到罐体底部，再向上做螺旋上升运动，流经填充床，供给营养物质和溶解氧给在片状微载体上贴附的细胞。

实施例7：

一种利用罐外循环的填充床式细胞反应器及培养动物细胞方法，加培养基至反应罐工作容积后，启动摇床，将动物活性细胞种子液接种到填充床的片状微载体中；随着罐体做圆周振荡运动，罐内上部培养液进入外导管105，同时，在罐体上部、外导管上部空间和外导管液面下气-液相混合，将混合气中的氧气溶入培养液中，这些含有溶解氧的培养液被外导管108引导至罐体底部的回液口，重新进入罐体内，从下向上做螺旋上升运动，穿过填充床时，把营养和溶解氧送给活性动物细胞；随后培养液继续向上做螺旋上升运动，直至再次进入罐体上部的外导管进口105，经过反复循环，直到营养动物细胞汲取完成；补充氧气和营养，开始下一个循环流周期。

所述的通过填充床给活性动物细胞输送营养和氧气过程中，所述的填充床包括由上孔板和下孔板与空套管和罐体圆柱形内壁构成的空间，其中填满片状微载体，细胞就贴附于片状微载体之上，作为活性动物细胞的生长区域，当培养液流穿过填充床时，将营养和氧气带给细胞，并将排泄物带走，完成为细胞提供营养物质和溶解氧的过程，所述的出气管的出口压力为4000Pa，营养液体温度为35--38℃，冲击波频率为75-110次/分钟。

Claims

1.一种罐外循环的填充床式细胞反应器，其组成包括：反应罐罐体，其特征是: 所述的反应罐罐体底部连接摇床，所述的反应罐的上部装有外导管，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋下并在底部回到罐体内，所述的外导管的进口开在所述的反应罐的圆台形内壁上，所述的外导管的出口端的回液口从罐体底部的中心进入所述的反应罐体内，所述的反应罐罐体上具有带进气管和出气管的罐盖，所述的反应罐罐体内具有填充片状微载体的填充床。

2.根据权利要求1所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，其特征是：所述的反应罐罐体上部为圆台形、下部为圆柱形、底部为圆锥形，所述的填充床包括空套管，所述的空套管通过下孔板连接所述的反应罐罐体，所述的空套管上端连接上孔板，片状微载体充填在所述的下孔板和所述的上孔板之间，所述的外导管沿罐体外绕罐体旋转的角度为180度。

3.根据权利要求1或2所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，其特征是：所述的反应罐罐体上部的半锥角α为25°-55°，所述的反应罐体外部具有保温水夹套、所述的反应罐体内侧底部有圆锥形口。

4.根据权利要求1或2所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，其特征是：所述的进气管上端穿过所述的罐盖，所述的进气管的另一端为出气矩形管并伸到罐内，所述的出气矩形管上具有出气微孔，所述的出气矩形管安装在外导管的液面下，所述的反应罐罐盖上装有进液管、出液管、溶氧探头、pＨ探头和温度探头，所述的反应罐罐体下部的圆柱形有圆角过渡到底部圆锥形，所述的反应罐体内侧底部有圆锥形，通过天圆地方结构过渡连接到外导管下部末端。

5.根据权利要求3所述的罐外循环的填充床式细胞反应器，其特征是：所述的进气管上端穿过所述的罐盖，所述的进气管的另一端为出气矩形管并伸到罐内，所述的出气矩形管上具有出气微孔，所述的出气矩形管安装在外导管的液面下，所述的反应罐罐盖上装有进液管、出液管、溶氧探头、pＨ探头和温度探头，所述的反应罐罐体下部的圆柱形有圆角过渡到底部圆锥形，所述的反应罐体内侧底部有圆锥形，通过天圆地方结构过渡连接到外导管下部末端。

6.一种利用权利要求1或2或3或4或5罐外循环的填充床式细胞反应器培养动物细胞的方法，其特征是:

加培养基至反应罐工作容积后，启动摇床，将动物活性细胞接种到填充床的片状微载体中；开在反应罐的圆台形内壁上的外导管进口将上部的培养液导至外导管中；培养液在罐体上部，外导管上部空间和外导管液面下区域中进行溶氧；经过回液口出来的培养液向上穿过填充床过程中，给活性动物细胞输送营养和氧气；由于在摇床的离心力作用下培养液向外并向上运动进入外导管进口，培养液在外导管的引导下回到罐体底部，然后由下向上做螺旋上升运动，直至再次进入外导管进口，经过反复循环，直到营养被动物细胞汲取完成；补充氧气和营养，开始下一个循环流。

7.根据权利要求6所述的利用罐外循环的填充床式细胞反应器培养动物细胞的方法，其特征是: 所述的培养液在罐体上部，外导管上部空间和外导管液面下区域中进行溶氧是指在溶氧区域中，由进气管把混合气由罐外输入，经进气管下部的出气矩形管上的出气微孔，进入外导管液面下的液体中与做圆周震荡的培养液，形成气—液相混合的溶氧过程，混合气体中的氧气溶解混合于培养液中，并随培养液做循环流动；在振荡回流的作用下外导管中的培养液向下流动；经回液口再次回到罐体底部向上呈螺旋上升的轨迹运动。

8.根据权利要求7所述的利用罐外循环的填充床式细胞反应器培养动物细胞的方法，其特征是: 所述的通过填充床给活性动物细胞输送营养和氧气过程中，所述的填充床包括由上孔板和下孔板与空套管和罐体圆柱形内壁构成的空间，其中填满片状微载体，细胞就贴附于片状微载体之上，作为活性动物细胞的生存区域，当培养液流穿过填充床时，将营养和氧气带给细胞，并将排泄物带走，完成为细胞提供营养物质和溶解氧的过程，所述的出气管的出口压力为4000Pa，培养液体温度为35—38℃，冲击波频率为75—110次/分钟。