CN106282015B - 大循环流化床细胞生物反应器及培养动物细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大循环流化床细胞生物反应器及培养动物细胞的方法，其中，反应器包括摇罐体、摇罐底座、进水硅胶软管、回水硅胶软管、细胞培养罐、培养罐底座、回水管、进水管、摇床、反应器底盘和管路支撑板；本发明通过上述各个部件的相互配合，有效地解决了现有技术中存在的流化床细胞生物反应器易发生微生物污染，溶氧水平低下和工作容积小等缺陷和不足，利于推广与应用。

Description

大循环流化床细胞生物反应器及培养动物细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物反应器技术领域，具体涉及一种用于动物细胞培养的大循环流化床细胞反应器及大规模培养动物细胞的方法。
背景技术
目前，通过动物细胞体外培养表达和生产各类诊断和治疗用单克隆抗体，疫苗，生长因子等生物活性蛋白质具有十分广泛的市场应用前景。因此大规模高密度培养动物细胞的细胞生物反应器已成为生物技术制药产业中关键设备。它很大程度上决定了生物制药企业的产品成本，质量，生产规模和产品种类。
流化床细胞生物反应器包括反应罐体，控温部分，通气部分，进出料口，测量系统，控制系统及其它附属系统。
现有的流化床细胞反应器均是采用插入罐体内机械搅拌装置的结构。其结构和密封件经常出现泄露和微生物污染问题。导致安全可靠性降低，染菌几率高。还有培养液的溶氧水平低，也满足不了高密度培养细胞的要求。再有反应器工作容积小，尽管是采用灌注培养工艺，但也难以实现真正大规模的培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大循环流化床细胞生物反应器及培养动物细胞的方法，以解决现有技术中存在的流化床细胞生物反应器易发生微生物污染，溶氧水平低下和工作容积小等缺陷和不足。
为解决上述技术问题，本发明提供一种大循环流化床细胞生物反应器，其包括摇罐体、摇罐底座、进水硅胶软管、回水硅胶软管、细胞培养罐、培养罐底座、回水管、进水管、摇床、反应器底盘和管路支撑板；所述摇罐体设置于所述摇罐底座中，所述摇罐底座和所述摇床的摇盘连接，所述摇床安装于反应器底盘上；所述摇罐体中具有中心漏斗，且在所述摇罐体的上部装有导流管，所述导流管的进口连接所述的摇罐体内壁，所述的导流管出口沿中心漏斗的上部切线方向进入所述中心漏斗；所述的中心漏斗位于所述摇罐体中心位置，其下端伸出所述摇罐体的底部；所述细胞培养罐设置于培养罐底座中，所述培养罐底座安装于反应器底盘上；所述细胞培养罐的底部、上部分别对应连接有所述进水管、所述回水管；所述进水管、进水硅胶软管、中心漏斗的底部依次连接，所述回水管、回水硅胶软管、摇罐体底部侧位回水出口下端依次连接；所述管路支撑板同时对所述进水管和回水管进行支撑。
其中，所述的摇罐体为圆台形，其半锥角为25度至55度；所述摇罐体具有带各种进水口的罐盖。
其中，所述细胞培养罐具有底部圆台部分和上部圆台部分，在底部圆台部分与上部圆台部分之间具有第一圆柱部分，在上部圆台部分与顶部之间具有第二圆柱部分。
其中，所述细胞培养罐顶部的小头端连接所述回水管的入口端，所述回水管的出口端连接在回水硅胶软管的下端；所述细胞培养罐底部圆台部分延其自身切线方向连接所述进水管的下端，所述进水管的上端连接所述进水硅胶软管的下端。
其中，所述细胞培养罐内有圆台形滤网，所述圆台形滤网和所述细胞培养罐上部的第二圆柱部分内壁连接，且使所述圆台形滤网的锥顶向上。
其中，所述细胞培养罐的底部圆台部分、上部圆台部分以及圆台形滤网的半锥角均为25度-55度。
其中，所述细胞培养罐顶部有带各种进出口的罐盖，所述罐盖和所述细胞培养罐顶端边缘法兰相连接并密封；所述细胞培养罐底座内壁上粘有加热橡胶板。
本发明还提供一种培养动物细胞的方法，包括如下步骤：
加培养液至静态液面后，加热培养液到35.5-37℃；启动摇床，将消毒后的微载体按比例加入培养液中，再将活性动物细胞接种到微载体中；摇罐体内上部的培养液在摇罐体内上部空间，导流管中和中心漏斗内的溶氧区内进行溶氧，溶氧后的培养液在摇动力的作用下进入进水硅胶软管和进水管；然后沿着细胞培养罐底部圆台部分的切线方向进入细胞培养罐，开始螺旋向上流动，直至流到圆台形滤网下边，给在此区域间的微载体内的活性细胞输送营养物质和溶解氧；完成这一供给过程后，培养液穿过圆台形滤网流到培养罐顶部，流入回水管，然后通过回水硅胶软管和摇罐体底部侧位回水出口流回到摇罐体内，螺旋向上流动，重新进入导流管进口，完成一个循环；补充氧气和营养后，再开始下一个循环。
其中，在细胞培养罐给活性动物细胞输送营养和氧气过程中时，带有活性动物细胞的微载体是位于细胞培养罐底部圆台部分到上部圆台形滤网之间的区域中；当含有溶解氧和营养物质的培养液向上流动时,就给微载体中的活性动物细胞输送了营养物质和溶解氧。
其中，所述微载体为有重量和有形状的大孔微载体或多孔微载体，每种所述微载体在培养液中是相对有一个向下的沉降速率的；其中，当培养液向上流速和微载体向下的沉降速率相对平衡时，微载体则不向下沉降而平衡不动；当培养液向上流速高于平衡值时，微载体就随培养液一起向上流动；当培养液的向上流速低于平衡值时,微载体就向下沉降；通过上部圆台部分的结构特性，该部分横截面积逐步扩大，从而降低培养液在此区间的向上流速，利于微载体向下沉降,从而完成了微载体和培养液在此部位的快速可靠分离。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
一、面对动物细胞大规模高密度的培养要求，现行的各种细胞反应器主要存在的问题有以下几项:一是染菌方面的可靠性问题,由于插入罐中的搅拌桨轴承部的密封可靠性差.导致泄露时有发生，降低了可靠性，导致细胞培养失败。本发明产品是全新的结构和原理.它没有搅拌装置插入罐内，整体密封性好，安全可靠性相当高。
二、动物细胞的剪切力敏感性，现行生物反应器中,因搅拌桨和鼓泡产生的流体剪切力和气泡破裂导致细胞损伤,甚至死亡,造成培养失败。所以本发明的反应器罐体内就没有搅拌桨，产生大量气泡的溶氧区在摇罐体内。细胞生存区域是在细胞培养罐内,根本不是同一区域，所以细胞受到的损伤程度是非常低的，而且本发明的反应器是采用大孔微载体培养细胞，细胞在微载体中还受到大孔微载体的硬壳保护。
三、培养液的溶氧水平问题，现行的细胞反应器是靠搅拌浆搅拌和鼓泡解决溶氧问题。但普遍存在溶氧水平底下，特别是在大规模,高密度培养动物细胞过程中,溶氧水平低,总是满足不了动物细胞的呼吸要求，难以高密度，高质量，高效益的培养动物细胞。本产品利用摇床的圆周振荡,摇罐内产生大量的水珠和浪花,增加了培养液表面和摇罐上部的混合气体相互接触溶解的面积，在振荡状态扩大了气-液相比表面积这个参数。所以达到了高溶氧水平，实验中测量发现,在振荡状态下溶氧水平可比传统反应器的溶氧水平高的多，完全满足了高密度,高质量培养细胞的要求。
四、细胞反应器工作容积问题；一般说来,在用细胞生物反应器来大规模培养动物细胞过程中，其他条件不变的情况下,工作容积越大，效率就会越高,成本就相对越低；由于本产品是采用大孔微载体培养动物细胞，采用高效的灌注工艺，它的工作容积是这样计算的:每天的灌注量乘以灌注的天数是实际工作容积。一般每天灌注量是0.5-2倍的培养罐实际工作容积，若我们选此系数为1，即每天灌注量是本产品细胞培养罐的实际容积，灌注的天数一般可达30天左右。若本产品的细胞培养罐的容积为500升，那么实际工作容积就是500升/天乘以30天等于15000升；且本产品经实验证明,在保证细胞培养罐内培养液垂直向上流速不低于60厘米/分钟的情况下，摇罐带动细胞培养罐的容积之比为1比10，即摇罐容积为200升时，便可带动细胞反映罐容积2000升。在这种条件下,采用灌注工艺培养细胞实际工作容积是2000升/天乘以30天等于60000升。这在生物制药行业，生物制品行业都是相当大的批量。实际生产中很少用的上这样大的工作容积，这是本产品的又一大优势,实际工作容积能做的很大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的大循环流化床细胞生物反应器的结构原理图；
图2为图1所示的俯视图；
图3为本发明实施例提供的摇罐体的正视图；
图4为本发明实施例提供的摇罐体的侧视图；
图5为本发明实施例提供的摇罐体的俯视图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例一
结合图1-图5所示，本实施例一提供一种大循环流化床细胞生物反应器，其包括摇罐体01、摇罐底座50、进水硅胶软管06、回水硅胶软管08、细胞培养罐10、培养罐底座40、回水管15、进水管12、摇床20、反应器底盘30和管路支撑板60；摇罐体01设置于摇罐底座50中，摇罐底座50和摇床20的摇盘201连接，摇床20安装于反应器底盘30上；摇罐体01中具有中心漏斗05，且在摇罐体01的上部装有导流管03，导流管进口031连接的摇罐体01内壁，导流管出口032沿中心漏斗05的上部切线方向进入中心漏斗05；中心漏斗05位于摇罐体01的中心位置，其下端伸出摇罐体01的底部；细胞培养罐10设置于培养罐底座40中，培养罐底座40安装于反应器底盘30上；细胞培养罐10的底部、上部分别对应连接有进水管12、回水管15；进水管12、进水硅胶软管06、中心漏斗05的底部依次连接，回水管15、回水硅胶软管08、摇罐体01底部侧位回水出口152依次连接；管路支撑板60同时对进水管12和回水管15进行支撑。
实施例二
结合图1-图5所示，本实施例二在上述实施例一的基础上，对摇罐体01以及附属结构进行详细的说明。当然，实施例一中的技术方案也属于本实施例二的保护范围。
具体地，摇罐体01为圆台形，其半锥角为25度至55度，根据具体情况定，一般在三十度到42度之间较好；而且，摇罐体01具有带各种进水口的罐盖。也就是说，摇罐体01上具有带进气口、出气口、进液口和出液口的摇罐盖011，该摇罐体01及附带部分被装在摇罐底座50中，摇罐底座50底部法兰盘和摇盘201用螺栓连接，而摇床20的底盘与反应器底盘30用螺栓连接，把摇床20固定在反应器底盘30上。
优选地，摇罐底座50内壁有电加热橡胶板，为摇罐体01保温。
更加具体而言，导流管03进口一侧连接在摇罐体01内侧圆锥表面上，导流管03出口连接中心漏斗05上部，摇罐沿顺时针摇动方向555摇动时,使培养液也做圆周振荡流动。在此时培养液面由静态液面000变成动态液面666，同时还做顺时针旋转运动。圆周振荡运动的培养液从导流管03进口流进,从导流管03出口流出，从切线方向进入中心漏斗05的上部。按顺时针方向成旋涡向下流动，然后在中心漏斗05的下端口流出，进入到进水硅胶软管06后流入进水管入口121，再向下流到进水管出口122，进入细胞培养罐10内,从底部圆台部分处螺旋向上，流过细胞培养罐10第一圆柱部分，进入到上部圆台部分101，然后再流到第二圆柱部分，进而到达细胞培养罐10顶部。在顶部的小头端向下流进回水管入口151，再向下然后反上回流进回水硅胶软管08，通过回水出口152流回到摇罐体01中。由于摇罐体01的圆周振荡运动，回到摇罐体01内的培养液继续顺时针螺旋向上流动，再次进入导流管进口031，如此循环往复，形成摇罐体01和细胞培养罐10间的培养液循环流。
其中，在摇罐体01内，既无微载体也无细胞，摇床20启动后，使摇罐内培养液产生圆周振荡运动，带动整个培养器内的培养液循环流动。摇罐就是源动力。在摇罐体01内，由罐盖上进气口进入罐内的混合气体在整个罐体的上部，导流管03内,中心漏斗05内和培养液的水珠，浪花的表面进行气-液相混合，溶混合气进入培养液中，未溶入的剩余气体上升到液面后逸出，与此同时,溶入混合气体的培养液流进进水管12，再流进细胞培养罐10底部。把培养液所携的营养物质和溶解氧供给在大孔微载体19内的细胞。
实施例三
结合图1-图5所示，本实施例三在上述实施例一、实施例二的基础上，对细胞培养罐10以及附属结构进行详细的说明。当然，实施例一中的技术方案也属于本实施例二的保护范围。
具体地，细胞培养罐10具有底部圆台部分和上部圆台部分101，在底部圆台部分与上部圆台部分101之间具有第一圆柱部分，在上部圆台部分101与顶部之间具有第二圆柱部分。优选地，细胞培养罐10的底部圆台部分、上部圆台部分101以及圆台形滤网17的半锥角均为25度-55度。当然，具体可根据实际情况而灵活设置。
细胞培养罐10内有圆台形滤网17，圆台形滤网17和细胞培养罐10上部的第二圆柱部分内壁连接，且使圆台形滤网17的锥顶向上。细胞培养罐10内上部圆柱形部分有圆台形滤网17，圆台形滤网17的下边缘与圆柱形罐内壁相连接，上边缘高于静态液面000，具体要高出30毫米。
优选地，圆台形滤网17的圆锥表面的半锥角为40度-60度，具体数值根据实际情况定。一般在45-60度之间较好。圆台形滤网17上孔的直径要小于微载体19的直径，这样才能可靠的滤去微载体19，只让培养液通过。细胞培养罐10内从底部到上部圆台形滤网17之间充满带有微载体19的混合液，细胞在微载体19中生存。由于圆台形滤网17的作用，带有细胞的微载体19随培养液螺旋向上流动时，只有培养液能顺利流过，而微载体19全部被挡在滤网下。所以细胞的生存区域是在细胞培养罐10底部到圆台形滤网17下面的这个区域内。
细胞培养罐10顶部的小头端连接回水管入口151，回水管15向下然后又向上类似U形管，回水管15的出口端连接在回水硅胶软管08的下端，回水硅胶软管08的上端连接摇罐体底部侧位回水出口152，在细胞培养罐10和摇罐体01之间形成回路。对应地，细胞培养罐10底部圆台部分延其自身切线方向连接进水管12的下端，进水管12的上端连接进水硅胶软管06的下端。
而且，细胞培养罐顶部具有带进气口，出气口，进液口，出液口，取样口和各种电极插口的细胞培养罐盖102。细胞培养罐10及附带部分被装在细胞培养罐底座40中。细胞培养罐底座40底部法兰盘和反应器底盘30用螺栓连接，固定在反应器底盘30上。而且，在细胞培养罐底座40内壁上还粘有加热橡胶板。此外，反应器底盘30上焊有管路支撑板60，管路支撑板60顶部于回水管15和进水管12相连接，支撑两水管,使其固定。
实施例四
结合图1-图5所示，本实施例四在上述实施例一、实施例二、实施例三的基础上，还提供一种培养动物细胞的方法，其包括如下步骤：
加培养液至静态液面000后，加热培养液到35.5-37℃；启动摇床20，具体以70-110转/分的转速范围内转动，将消毒后的微载体19按比例加入培养液中，再将活性动物细胞接种到微载体19中；摇罐体01内上部的培养液在导流管03中和中心漏斗05内的溶氧区内进行溶氧，溶氧后的培养液在摇动力的作用下进入进水硅胶软管06和进水管12；然后沿着细胞培养罐10底部圆台部分的切线方向进入细胞培养罐10，开始螺旋向上流动，直至流到圆台形滤网17下边，给在此区域间的微载体19内的活性细胞输送营养物质和溶解氧；完成这一供给过程后，培养液穿过圆台形滤网17流到培养罐顶部，流入回水管15，然后通过回水硅胶软管08和摇罐体底部侧位回水出口152流回到摇罐体01内，螺旋向上流动，重新进入导流管03进口，完成一个循环；补充氧气和营养后，再开始下一个循环。
在细胞培养罐10给活性动物细胞输送营养和氧气过程中时，带有活性动物细胞的微载体19是位于细胞培养罐10底部圆台部分到上部圆台形滤网17之间的区域中；当含有溶解氧和营养物质的培养液向上流动时,就给微载体19中的活性动物细胞输送了营养物质和溶解氧。
微载体19为有重量和有形状的大孔微载体19或多孔微载体19，每种微载体19在培养液中是相对有一个向下的沉降速率的；其中，当培养液向上流速和微载体19向下的沉降速率相对平衡时，微载体19就不向下沉降而平衡不动；当培养液向上流速高于平衡值时，微载体19就随培养液一起向上流动；当培养液的向上流速低于平衡值时,微载体19就向下沉降；
通过上部圆台部分101的结构特性，该部分横截面积逐步扩大，从而降低培养液在此区间的向上流速，利于微载体19向下沉降,从而完成了微载体19和培养液在此部位的快速可靠分离，为灌注培养工艺的应用，提供了可靠的基本条件。细胞培养罐10的上部圆台部分101，有一个对螺旋向上流动的混合培养液流速减速的功能。在这部分，因为培养罐的圆台体部分的截面积的变大，从下向上螺旋流动的混合培养液向上流速就产生相反变化，即向上流速变小。当向上速度值小于和微载体19的沉降速率平衡值时,微载体19便不再向上流动，而是停止或垂直向下沉降。正因如此，在这区域中,微载体19不在随流而上，只培养液本身继续向上流动。加之滤网作用，使的培养液和微载体19在此能完全可靠的分离。微载体19带着细胞一直保留在细胞培养罐10的底部到滤网下边的区域中。培养液流到罐顶部流入回水管15，回到摇罐中，进入下一循环。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种大循环流化床细胞生物反应器，其特征在于，包括摇罐体、摇罐底座、进水硅胶软管、回水硅胶软管、细胞培养罐、培养罐底座、回水管、进水管、摇床、反应器底盘和管路支撑板；
所述摇罐体设置于所述摇罐底座中，所述摇罐底座和所述摇床的摇盘连接，所述摇床安装于反应器底盘上；所述摇罐体中具有中心漏斗，且在所述摇罐体的上部装有导流管，所述导流管的进口连接所述的摇罐体内壁，所述的导流管出口沿中心漏斗的上部切线方向进入所述中心漏斗；所述的中心漏斗位于所述摇罐体中心位置，其下端伸出所述摇罐体的底部；
所述细胞培养罐设置于培养罐底座中，所述培养罐底座安装于反应器底盘上；所述细胞培养罐的底部、上部分别对应连接有所述进水管、所述回水管；所述进水管、进水硅胶软管、中心漏斗的底部依次连接，所述回水管、回水硅胶软管、摇罐体底部侧位回水出口依次连接；所述管路支撑板同时对所述进水管和回水管进行支撑；
所述细胞培养罐具有底部圆台部分和上部圆台部分，在底部圆台部分与上部圆台部分之间具有第一圆柱部分，在上部圆台部分与细胞培养罐顶部之间具有第二圆柱部分；
所述细胞培养罐顶部的小头端连接所述回水管的入口端，所述回水管的出口端连接在回水硅胶软管的下端；所述细胞培养罐底部圆台部分延其自身切线方向连接所述进水管的下端，所述进水管的上端连接所述进水硅胶软管的下端；
所述细胞培养罐内有圆台形滤网，所述圆台形滤网和所述细胞培养罐上部的第二圆柱部分内壁连接，且使所述圆台形滤网的锥顶向上。
2.根据权利要求1所述的大循环流化床细胞生物反应器，其特征在于，所述的摇罐体为圆台形，其半锥角为25度至55度；所述摇罐体具有带各种进水口的罐盖。
3.根据权利要求1所述的大循环流化床细胞生物反应器，其特征在于，所述细胞培养罐的底部圆台部分、上部圆台部分以及圆台形滤网的半锥角均为25度-55度。
4.根据权利要求1所述的大循环流化床细胞生物反应器，其特征在于，所述细胞培养罐顶部有带各种进出口的罐盖，所述罐盖和所述细胞培养罐顶端边缘法兰相连接并密封；所述培养罐底座内壁上粘有加热橡胶板。
5.一种根据权利要求1-4中任一项所述的大循环流化床细胞生物反应器而进行的培养动物细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
加培养液至静态液面后，加热培养液到35.5-37℃；启动摇床，将消毒后的微载体按比例加入培养液中，再将活性动物细胞接种到微载体中；摇罐体内上部的培养液在摇罐体内上部空间，导流管中和中心漏斗内的溶氧区内进行溶氧，溶氧后的培养液在摇动力的作用下进入进水硅胶软管和进水管；然后沿着细胞培养罐底部圆台部分的切线方向进入细胞培养罐，开始螺旋向上流动，直至流到圆台形滤网下边，给在此区域间的微载体内的活性细胞输送营养物质和溶解氧；完成这一供给过程后，培养液穿过圆台形滤网流到培养罐顶部，流入回水管，然后通过回水硅胶软管流回到摇罐体内，螺旋向上流动，重新进入导流管进口，完成一个循环；补充氧气和营养后，再开始下一个循环。
6.根据权利要求5所述的培养动物细胞的方法，其特征在于，
在细胞培养罐给活性动物细胞输送营养和氧气过程中时，带有活性动物细胞的微载体是位于细胞培养罐底部圆台部分到上部圆台形滤网之间的区域中；当含有溶解氧和营养物质的培养液向上流动时,就给微载体中的活性动物细胞输送了营养物质和溶解氧。
7.根据权利要求5所述的培养动物细胞的方法，其特征在于，
所述微载体为有重量和有形状的大孔微载体或多孔微载体，每种所述微载体在培养液中是相对有一个向下的沉降速率的；其中，当培养液向上流速和微载体向下的沉降速率相对平衡时，微载体则不向下沉降而平衡不动；当培养液向上流速高于平衡值时，微载体就随培养液一起向上流动；当培养液的向上流速低于平衡值时,微载体就向下沉降；通过上部圆台部分的结构特性，该部分横截面积逐步扩大，从而降低培养液在此区间的向上流速，利于微载体向下沉降,从而完成了微载体和培养液在此部位的快速可靠分离。
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