CN102978113B - 搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于动物细胞的自悬浮培养或者是微载体悬浮培养的生物反应器。为了找到一种搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，从而消除搅拌式生物反应器中搅拌桨和深层通气对所培养的动物细胞造成的剪切伤害，同时无需外接设备，就可以方便的完成培养过程中的换液、清洗、消化。本发明公开了一种搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，包括反应容器、反应器顶盖、反应器搅拌轴，还包括有一个带孔过滤套筒，所述过滤套管悬置于反应容器中，将反应容器区分为搅拌、通气、过滤一体化腔室及细胞培养腔室。从而将搅拌、通气及培养物过滤三方面工艺操作合为一体，且位于生物反应器内部，统一整体灭菌，无外接设备，操作简单，安全高效。

Description

搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器

技术领域

本发明涉及动物细胞生物反应器工程，具体来说涉及一种适用于动物细胞的自悬浮培养或者是微载体悬浮培养的生物反应器。

背景技术

目前，用于动物细胞大规模培养的反应器多为机械搅拌式生物反应器，FDA批准的生产工艺也基本都是搅拌式反应器的分批式、流加式、灌注式培养工艺，是当前动物细胞大规模培养及生物医药产品生产的主流技术。搅拌式反应器通过搅拌桨的持续搅拌均匀分布营养、气体（氧气等）及热量，为动物细胞提供相对稳定的生长环境。

但是搅拌式生物反应器在实际运行中依然存在一些缺点：

1）培养过程中，持续运转的搅拌桨叶对所培养的动物细胞具有不可消除的剪切力损伤，一般转速越大，剪切力损伤越大。随着细胞密度的提高，生物体对氧气的需求增加，应用提高搅拌转速从而提高传氧速率的策略可能会直接导致细胞因高剪切力而大量死亡。

2）空气、氧气及二氧化碳在动物细胞培养过程中调节着溶氧及pH两个重要参数。气体在培养液中的溶解需要搅拌桨进行有效的搅拌分散，增加气体与液体的传导面积（大气泡破裂分散成若干小气泡）。但是每一个气泡在培养液里行进过程中的破裂、分散对初始培养的动物细胞会造成不可逆的伤害。

3）动物细胞大规模培养过程中通常伴随着换液、清洗、消化、灌注等工艺操作，目前有两种操作方式：①采用罐内的spin-filter去除培养上清，但spin-filter的最小操作高度过高，换液量仅为培养总体积的1/3～1/2，换液不彻底，影响随后的清洗、消化等操作。同时spin-filter的工作高度将直接制约了灌注培养的体积及培养效能。②采用外接设备，如罐外细胞截留器、声波细胞截留器等等，将培养物和培养液一并取出并在相关设备的作用下截留培养物（细胞或长有细胞的微载体），将培养上清去除，培养物重新泵回罐中，这一过程已经可以连续进行。但这些设备大都属于国外企业的高端产品，价格极其昂贵。并且这些设备是反应器的外接设备，传递操作或多或少都存在污染风险。

由此可见，开发一种可以有效减小搅拌剪切力、气泡破裂损伤，同时又能保证细胞生长所需的营养、气体、热量均匀分布，而且具有有效分离细胞培养物与培养上清的一体化装置势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一种搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，从而消除搅拌式生物反应器中搅拌桨和深层通气对所培养的动物细胞造成的剪切伤害，同时该生物反应器还需要具备培养物（微载体/细胞）的过滤功能，无需外接设备，就可以方便的完成培养过程中的换液、清洗、消化，从而适应于补料培养、循环培养及灌注培养等工艺操作，安全可靠。

为了实现本发明的目的，本发明公开了一种搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，包括反应容器、反应器顶盖、反应器搅拌轴，还包括有一个带孔过滤套筒，其孔径小于实际培养物，所述过滤套筒内壁固定有带分布器的气体分布管以及取液管，并通过气体分布管及取液管安装于反应器顶盖，所述反应器搅拌轴位于过滤套管中轴，所述过滤套管悬置于反应容器中，将反应容器区分为搅拌、通气、过滤一体化腔室及细胞培养腔室。具体来说，过滤套筒通过气体分布管和取液管安装于搅拌式生物反应器的顶盖，以螺纹螺丝固定透过顶盖的气体分布管和取液管即可。其中气体分布管用于向培养液中通入无菌气体，取液管用于连接硅胶管移取不含有培养物的培养液。另个腔室是指位于过滤套筒内部的搅拌、通气、过滤一体化腔室，和位于反应器内壁和过滤套筒间的细胞培养腔室。利用该装置将机械搅拌桨、深层通气与细胞培养物分开，可有效降低培养过程中搅拌桨叶及气泡对细胞培养物的损伤。同时不锈钢过滤套筒具备过滤功能，其内部的取液管在取液时仅仅移取培养液，而细胞培养物仍保留在细胞培养腔室中，快速有效的将培养液与培养物分开，大大简化在生物反应器中进行换液、清洗、消化、流加培养、循环培养、灌注培养等操作工艺。

由于将反应容器区分为搅拌、通气、过滤一体化腔室及细胞培养腔室，所以必须保证培养在其中的细胞或者是载体受到过滤套筒上孔径的限制，不能在两个腔室内自由移动，所以孔径要小于实际培养物，对于动物细胞的微载体悬浮培养，孔径一般选择为100μm左右，对于动物细胞的自悬浮培养，孔径一般选择为10μm～15μm。

由于过滤套筒与反应容器的直径比，直接影响到细胞培养腔室的空间大小，所以本发明公开了反应容器与过滤套筒直径比为2：1~3：1的技术方案，从而保证细胞培养腔室的空间大小可以满足细胞的培养增值速度。

同时，本发明还进一步公开了所述过滤套筒距离反应容器底端3~5cm，使得细胞培养腔室仍然为一个连通腔体，不会被中间加入的过滤套筒分隔为两个单独的培养空间。

作为进一步的改进，本发明公开了所述反应器搅拌轴安装有两种或两种以上搅拌桨，从而形成轴向流和径向流，实现液体的上下环形流动。

作为搅拌桨的一种优选方式，本发明公开了所述反应器搅拌轴同时安装有涡轮推进桨和直排六叶浆，从而更加有利于轴向流和径向流的形成，上下环形流动性更好。

同时，本发明还进一步公开了分布器的优选方式，所述分布器为环形分布器或微泡分布器。

由于气体分布管和取液管本身起到对过滤套筒的固定作用，所以本发明还公开了所述气体分布管及取液管对称固定于过滤套筒内壁的技术方案，这样一来就使得过滤套筒的固定更加合理，固定力更加均匀，过滤套筒的中心轴也与物理中轴对应起来，产品在工作中更加稳定。

作为一种固定方式的优选，本发明公开了所述气体分布管及取液管点焊固定于过滤套筒内壁，不仅固定牢靠，而且焊点小，对细胞培养的影响小。

最后本发明公开了一种过滤套筒的优选材质，所述过滤套筒为不锈钢材质，更为优选的是316L标号的不锈钢材质。使得整个装置更加耐老化，耐腐蚀，当然为了进一步提高这种性能，还可以在装置的表面进行硅化处理。

综上所述，采用本发明公开的技术方案后，可以将搅拌、通气及培养物过滤三方面工艺操作合为一体，且位于生物反应器内部，统一整体灭菌，无外接设备，操作简单，安全高效。

附图说明

图1搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器示意图；

其中1为气体分布器管，2为取液管，3为反应器顶盖，4为反应器搅拌轴，5为过滤套筒，6为搅拌、通气、过滤一体化腔室，7为细胞培养腔室，8为反应容器，9为直排六叶浆，10为涡轮推进浆。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的实施方式。但需要具体指出的是，以下具体描述仅以说明为目的，不应将其理解成对本发明范围的限定。根据本发明的描述，本专业的技术人员推导出的等效的改换方式，理应涵盖在本发明的范围之内。

实施例1

在BHK21自悬浮培养中，将本发明公开的整体装置安装于5L动物细胞反应容器8中，如图1所示，不锈钢过滤套筒5高度为32cm，直径为6cm，安装于反应器顶盖3下，气体分布器管1和取液管2穿越顶盖，用螺纹螺丝与反应器顶盖3固定，确保过滤套筒5的中心轴与反应器搅拌轴4完全重合。不锈钢过滤套筒5的过滤孔径选用10μm，确保可以截留住单个悬浮生长的BHK21细胞。整体装置随反应容器8同时整体灭菌，冷却并无菌检测后保压待用。

培养开始时，BHK21种子细胞以每毫升3.5×10⁵个细胞的密度接种于细胞培养腔室7中，并加入培养液，最大培养体积为3.8L。培养液的液面始终低于不锈钢过滤套筒5的顶端，即该装置有效的将BHK21细胞截留在细胞培养腔室7中，培养参数pH设定为7.2、DO设定为40%、温度设定为37℃、转速设定为35～55rpm。随着反应器搅拌轴4的转动，安装于其上的涡轮推进浆10和直排六叶浆9一起转动，形成横向流以及径向流，从而形成了上下环形流动体系。随着培养时间的推移，细胞密度逐步升高。培养3天后细胞密度达到每毫升1.1×10⁶个细胞，检测培养上清中的代谢副产物乳酸浓度为15.7mmol/L，氨浓度为4.9mmol/L，进行换液操作。此时用蠕动泵作用于连接在取液管2上的硅胶管，直接从搅拌、通气、过滤腔一体化腔室6中充分吸取培养上清，去除的培养上清体积大致为3.0～3.5L。加入新鲜培养液继续培养。随着细胞密度的进一步上升，可适当提高培养转速，从35rpm逐步提高至60rpm，甚至可达到75rpm，从而充分分散从气体分布管道1中释放的气体（包括空气和氧气），并通过过滤套筒5再扩散至细胞培养腔室7中，有效提高了供氧速率，有利于细胞密度的进一步提高并维持较高的细胞活力。通过重复上述换液操作，最终BHK21的最大细胞密度可达到每毫升4.8×10⁶个细胞，细胞存活率高于95%，培养周期可延长至9天。

实施例2

在Marc-145细胞微载体悬浮培养中，将本发明公开的整体装置安装与5L动物细胞反应器8中，如图1所示，装置高度为32cm，装置直径为6cm，安装于反应器顶盖3下，气体分布器管1和取液管2穿越顶盖，用螺纹螺丝与顶盖固定，确保本装置的中心轴与反应器搅拌中心轴4完全重合。不锈钢过滤套筒5的过滤孔径选用120um，确保可以截留住微载体培养物（微载体cytodex1及微载体上粘附生长的Marc-145细胞）。全部装置伴随反应器同时整体灭菌，冷却并无菌检测后保压待用。

培养开始时，Marc-145种子细胞以每毫升3×10⁵个细胞的密度及预处理完毕的cytodex1（使用浓度为5g/L）接种于细胞培养腔室7中，并加入培养液，初始培养体积为1.5L。初始培养参数pH设定为7.2、DO设定为40%、温度设定为37℃、转速设定为30pm，随着反应器搅拌轴4的转动，安装于其上的涡轮推进浆10和直排六叶浆9一起转动，形成横向流以及径向流，从而形成了上下环形流动体系。初始培养12小时后，适当增加培养液体积，但是培养液的液面始终低于不锈钢过滤套筒5的顶端，即该装置有效的将Marc-145细胞的微载体培养物截留在细胞培养腔室7中，继续培养，参数pH设定为7.2、DO设定为40%、温度设定为37℃、转速设定为45～65rpm。培养24小时后，取样观察微载体上Marc-145细胞的粘附情况，占球率基本达到95%以上。随即开始进行循环灌注培养，此时用蠕动泵作用于连接在取液管2上的硅胶管直接从搅拌、通气、过滤腔一体化腔室6中以一定的速率吸取培养上清，同时以相同的速率加入新鲜培养液。随着细胞密度的进一步上升，可适当提高吸取培养上清及加入新鲜培养液的速率，即循环灌注速率，以满足细胞对营养物质的需要。培养转速从35rpm逐步提高至75rpm，可充分分散从气体分布管道1中释放的气体（空气和氧气），并通过过滤套筒5再扩散至细胞培养腔室7中，有效提高了供氧速率，有利于细胞密度的进一步提高并维持较高的细胞活力。通过重复上述循环灌注操作，Marc-145细胞在培养5天内即达到了最大细胞密度每毫升5.4×10⁶个细胞，细胞存活率高于95%，可用于高致病性猪蓝耳病病毒的增殖。

Claims (9)

1.搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，包括反应容器、反应器顶盖、反应器搅拌轴，其特征在于：还包括有一个带孔过滤套筒，其孔径小于实际培养物，所述过滤套筒内壁固定有带分布器的气体分布管以及取液管，并通过气体分布管及取液管安装于反应器顶盖，所述反应器搅拌轴位于过滤套筒中轴，所述过滤套筒悬置于反应容器中，将反应容器区分为位于过滤套筒内部的搅拌、通气、过滤一体化腔室及位于反应容器内壁和过滤套筒间的细胞培养腔室，将机械搅拌桨、深层通气与细胞培养物分开；

所述过滤套筒距离反应容器底端3~5cm。

2.根据权利要求1所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述反应容器与过滤套筒直径比为2：1~3：1。

3.根据权利要求1所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述反应器搅拌轴安装有两种或两种以上搅拌桨。

4.根据权利要求3所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述反应器搅拌轴同时安装有涡轮推进桨和直排六叶浆。

5.根据权利要求1所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述分布器为环形分布器或微泡分布器。

6.根据权利要求1所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述气体分布管及取液管对称固定于过滤套筒内壁。

7.根据权利要求1或6所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述气体分布管及取液管点焊固定于过滤套筒内壁。

8.根据权利要求1所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述过滤套筒为不锈钢材质。

9.根据权利要求8所述的搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器，其特征在于：所述过滤套筒为316L标号的不锈钢材质。