CN101506349B - 制造有效生物反应器的方法 - Google Patents

Abstract

基于早先发现的有效生物反应器系统的研究，公开了增加培养基溶氧的方法。这一方法和最佳混合一起形成了有效生物反应器设计和原型构建的理论基础。

Description

制造有效生物反应器的方法

相关申请

本申请是2006年6月8日递交的名为“suspension culture vessels”的专利申请PCT/US06/22312的继续申请。

技术领域

本发明记载了制造有效生物反应器的方法。

背景技术

在名为“suspension culture vessels”的专利申请PCT/US06/22312中描述了早先的发现，其中描述了在摇床平台上用于悬浮哺乳动物细胞培养物的宽体(wide-body)培养容器，该培养容器具有倒椎台状(frusto-conical)底部。出人意料地，该系统明显比传统生物反应器和平底摇瓶更好。已经描述了这一系统使得培养基通过较小的水-机械应力(hydro-mechanical stress)而轻易地攀至容器壁。这一系统产生了宽阔的薄培养基层用于延展表面，更多的通气以及更好的混合。

引起兴趣的是，并不清楚这一基于摇床的椎台状底部容器系统的准确作用机制。本发明发现了该作用机制。基于该作用机制，即增加培养基中的溶氧水平的方法，本发明设计并检测了若干类型的哺乳动物细胞培养生物反应器。

发明内容

本发明描述了先前记载的具有倒椎台状或倒截椎底部(专利申请PCT/US06/22312)的悬浮培养容器的作用机制。本发明公开了增加培养基中溶氧(DO)的方法，该方法构成设计并制造有效哺乳动物细胞培养生物反应器的基础。

附图说明

图1：用于悬浮哺乳动物细胞培养物的具有倒椎台状底部的宽体容器。

图2a：Fluorometrix DO/pH补丁状传感器(patch sensor)监测技术的示图。

图2b：Fluorometrix DO/pH补丁状传感器监测系统。

图3：在摇床平台上具有倒椎台状底部的150ml工作容积培养容器。

图4：使用气泵使静止状态的培养基起泡来增加DO水平。

图5a、b、c、d、e：Nikon数码相机捕捉的瞬间培养基表面特征。在该瞬间，所有图片显示标记的主要在容器壁一侧的培养基表面水平。这一培养基运动的特征通过重复“清扫”或冲洗暴露于空气的平滑容器表面而增加培养基中的DO。

图6a、b：使用标记塑料管的滚动运动，管内的培养基重复“清扫”或“冲洗”暴露于空气的平滑容器壁表面。该运动使培养基中的DO迅速增加至100％。

图7：使用具有倒椎台状底部(直径3cm)的塑料管，在具有恒定DO 100％的可调摇床平台上培养4天，悬浮培养的CHOK细胞轻易达到2.2％pcv。对于细胞克隆鲁棒性(robustness，或称健壮性)筛选创造了一有效的小型生物反应器系统。

图8a：用于混合培养基的前后运动的球形自滚式生物反应器。

图8b：用于混合培养基的摇床平台上的球形自滚式生物反应器。

图8c：具有内凸轨道的锥形自滚式生物反应器。

图9a：用于塑料培养袋的具有倒椎台状底部的10升容器底。

图9b：具有倒椎台状底部的10升容器底。

图10a：目前的Flurometrix细胞克隆鲁棒性筛选和优化高通量小型生物反应器系统的工艺。

图10b：用于细胞系鲁棒性筛选的具有倒椎台状底部的基于摇床的多个孔。

发明的具体说明

本发明至少部分基于早先的发现，即不用复杂的控制塔和相关的DO以及pH探针，适合哺乳动物细胞的悬浮液在具有倒椎台状或倒截椎底部的培养容器中，于具有某一运动距离的摇床平台上生长明显比传统Applikon生物反应器以及平底摇瓶更好(图1)。

为了研究其作用机制，使用了DO传感器、pH传感器及它们的监测系统(www.flurometrix.com)(图2a、b)。还使用数码相机(Nikon)来捕捉并研究倒椎台状底部容器振荡运动期间具体的培养基运动。

首先，测量具有倒椎台状底部的150ml工作容积容器中培养基的DO(图3)。发现DO水平轻易达到100％(表1)。然后使用气泵使同一容器中处于静止状态的培养基起泡(图4)。出人意料地，其在合理的时间段内DO不能达到100％(表2)。这一现象是非常出人意料的，因为常规使用起泡法来校正3升Applikon生物反应器中的DO探针并假定DO达到100％。这一现象背后必然存在一种作用机制。

表1：向以120rpm振荡的、具有倒椎台状底部的150ml工作容积培养容器(图3)中加入新鲜的培养基。每30min，测量DO。

时间(min)	0	30	30	30
					DO％	45	75	92	100

表2：向未振荡的、具有倒椎台状底部的150ml工作容积培养容器中加入新鲜的培养基。使用气泵起泡向培养基中加入DO(图4)。每30min，测量DO。

时间(min)	0	30	30	30
					DO％	45	52	55	75

探寻答案时，使用高速相机来捕捉具有倒椎台状底部的培养容器在振荡时的瞬间运动(图5a、b、c、d)(图3)。所有图片清楚地显示在瞬间运动时，培养基主要在培养容器的一侧而另一侧大部分暴露于空气接触。由于倒椎形底部，振荡运动轻易地使培养基运动攀至容器壁的一侧。这产生培养基流的循环运动，重复“清扫”或冲洗暴露于空气的容器壁。假设这一循环运动及其重复的“清扫”增加培养基中的DO。

发现溶氧(DO)是以在水或培养基中混合的氧气微泡的形式且发生于水分子之间。上面的情况下，在瞬间暴露于空气的阶段，微小的氧气泡被平滑玻璃或塑料表面吸收并因此形成氧气泡微层是可能的。然后假设在平滑表面上瞬间形成的气泡层太微小而在水中组装成DO的微泡尺寸。这一微泡层随后被循环培养基流所“清扫”或洗去，从而使氧气轻易溶解在水中。这一循环运动由于倒椎台状底部和振荡运动而一次次发生，从而比直接使培养基起泡(包括鼓泡)更有效地增加DO水平。

为了检验这一假设，使用具有4ml培养基和转速为60rpm滚筒的12ml塑料管(NUNC)(图6a、b)。在10min短暂滚动后，管中的所有培养基样品达到100％DO。这一研究显示了培养基或培养基流以某一速度或重复清扫或接触暴露于空气的平滑表面，出人意料地有效增加了培养基DO。

然后在管中以滚筒速度为60和100rpm培养CHOK-悬浮细胞4天。如预期，这4天培养期间，所有情况下的DO均达到100％。然而，细胞根本没有生长。因此总结对于最佳悬浮细胞培养物，除了足够的培养基DO，必须进行有效地混合。然后在具有倒椎台状底部的50ml离心管(NUNC)中于可调整的摇床平台上培养细胞4天(图7)。所有细胞都生长且轻易达到2.2％紧实细胞体积(pcv)。这一结果表明对于最佳悬浮细胞培养物，除了足够的DO，还需要混合运动。

基于上述发现，设计了若干用于原型构建的生物反应器类型。对于每种类型，考虑将重复使用培养基流用力清扫或接触暴露于空气的平滑表面的方法与足够的培养基混合运动整合一起来增加培养基中DO(图8a、b、c)。实施例4中进一步描述细节。

还通过在无血清悬浮培养基中使用表达TNFR2-Fc-IL-1ra的CHOK悬浮细胞系检查了批量培养工艺的细节。清楚地显示了具有倒椎台状底部的培养容器是理想的，其具有最佳的DO水平、细胞密度和产物产率(表3)。实施例1也描述了细节。

实施例1、具有倒椎台状底部的150ml工作容积容器的分批培养研究

使用小规模的150ml工作容积摇瓶容器在无血清培养基B001中对表达TNFR2-Fc-IL-1ra药物候选者的CHO生产细胞系进行分批培养8天。使用Flurometrix DO补丁状传感器监测系统每日测量DO(图2a、b)。除了使用Flurometrix监测系统以外，还通过便携式pH测量仪测量pH(图2b)。通过稳步(one-touch)葡萄糖测量仪(图2b)测量葡萄糖。表3清楚地显示具有倒椎台状底部的培养容器是理想的，其具有最佳的DO水平、细胞密度和产物产率。

表3、同时监控DO、pH、葡萄糖。具有倒椎台状底部的150ml工作容积容器中分批培养工艺的混合速度和温度。

天	1	2	3	4	5	6	7	8
									DO％	100	100	100	100	100	100	100	100
pH	7.5	7.4	7.0	6.8	6.6	6.6	6.7	6.8
									葡萄糖g/L	1.5	1.5	1.2	0.8	0.5	0.3	0.2	0.1
温度	37	37	37	34	34	34	34	34
									混合速度rpm	120	120	120	120	120	120	120	120
表达效价mg/L	22	55	115	220	415	530	705	750
									细胞密度pcv％	0.3％	0.7％	1.5％	2.8％	3.2％	3.6％	3.2％	2.8％

实施例2、在具有倒椎台状底部的生物反应器容器底上制造一次性塑料细胞培 养袋

设计并构建具有倒椎台状底部的生物反应器容器底和软性塑料袋(图9a、b)。这些底和袋被设计为在具有可调运动距离的摇床平台上使用。设计的倒椎台状底部和可调摇床平台旨在使培养基攀至尽可能高且尽可能容易(使用最小的振荡能量)以增加培养基中的DO水平并满足高细胞密度培养条件下高水平O₂使用的挑战。设计了3、10、20、40、100、500和1000升尺寸的容器底和塑料袋用于原型构建和检测。目标是构建成本有效的剪力较小的一次性哺乳动物培养物生物反应器用于研发和工业使用。

实施例3、设计具有倒椎台状底部的基于摇床的多孔板用于在高通量蛋白质表 达滴定筛选后产生克隆鲁棒性筛选

生产细胞系的鲁棒性对于给定蛋白质药物的大规模工艺的稳定性以及最终表达产率是重要的。在从数以千计的细胞克隆筛选的高表达细胞系中，它们中的一些是满足工业生产细胞标准的鲁棒(robust，或称健壮)细胞系。所选的鲁棒细胞系能够以高密度生长较长时间并因此产生比原始筛选的细胞克隆表达效价＞10倍的更高表达效价。

当前用于细胞系鲁棒性筛选及工艺优化的微型生物反应器系统(www.flurometrix.com)(图10a)对于高细胞密度细胞生长不是最佳的且不具有最佳DO水平来支撑高密度细胞群。因此，其并未筛选鲁棒细胞克隆。没有充足的培养基DO，就不可能优化高细胞密度补料分批工艺。

在摇床平台上设计的多个孔板(图10b)将提供培养基足够的DO，这是由于振荡运动以及培养孔的倒椎台状底部支撑高细胞密度生长，从而能够筛选给定细胞系在最大密度下的最终生长能力以及与非鲁棒细胞克隆相区别。这一系统除了非常经济有效外还易于掌握。

实施例4、基于结合了有效混合运动来增加培养基中DO的方法设计有效生物 反应器

基于上面进行的滚筒实验(图6a、b)，发现了增加哺乳动物细胞培养基中DO的方法。随后设计滚动生物反应器(图8a、b、c)。图8a示出通过重复冲洗暴露于空气的容器内表面的球形自滚式生物反应器容器。这一滚动运动增加培养基中的DO以支撑高细胞密度生长。而水平面的前后运动使得培养基在滚动运动期间充分混合(图8a)。它们一起支撑最佳悬浮细胞培养。

图8b示出球形自滚式生物反应器容器。这一滚动运动通过重复冲洗暴露于空气的容器内表面而支撑高细胞密度生长。而在水平面的轨道摇床平台使得培养基在滚动运动期间充分混合(图8b)。它们一起支撑最佳悬浮细胞培养。

图8c示出锥形自滚式生物反应器容器。这一滚动运动通过重复冲洗暴露于空气的容器内表面而支撑高细胞密度生长。而内凸的轨道使得滚动时培养基向上运动至上部一端和落回下端。这一额外的运动帮助培养基在滚动运动期间充分混合。它们一起支撑最佳悬浮细胞培养。

Claims (11)

1.增加用于哺乳动物细胞悬浮培养的培养基中溶氧的方法，包括：

向一容器中引入培养基与含氧气体接触，并且

培养基循环清扫容器内表面，所述清扫是通过轨道振荡、滚动、摇摆、前后移动容器或者通过贯穿容器内侧移动培养基流而实现的；

其中所述容器是具有倒锥台状或倒截锥底部的悬浮培养容器。

2.权利要求1的方法，其中各个培养基清扫是通过在轨道摇床上振荡容器而实现的。

3.权利要求1的方法，其中各个培养基清扫是通过容器自滚以及同时前后移动容器而实现的。

4.权利要求1的方法，其中各个培养基清扫是通过容器自滚以及同时振荡容器所实现的。

5.权利要求1的方法，其中该容器具有倒锥台状的底部。

6.一种用于哺乳动物细胞悬浮培养的容器，包括具有倒锥台状或倒截锥底部的容器以及在容器中的培养基。

7.权利要求6的容器，其中该底部是倒锥台状的。

8.一种用于哺乳动物细胞培养的装置，包括：

一次性塑料细胞培养袋，其一旦装入培养基就具有倒锥台状的较低部分，以及

细胞培养容器，其具有倒锥台状底部以容纳在装入培养基后的所述一次性塑料细胞培养袋。

9.权利要求8的装置，其中该容器与倒锥台状底部同心。

10.权利要求8的装置，还包括在其上安装细胞培养容器的轨道摇床。

11.一种具有倒锥台状底部的基于摇床的用于培养细胞的多孔板，包括容纳培养基的多个孔，每个孔具有倒锥台状的较低部分。 

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