BRPI0621678A2

BRPI0621678A2 - método para aumentar o oxigênio dissolvido em um vaso de cultura e vaso para a cultura em suspensão de células de mamìferos

Info

Publication number: BRPI0621678A2
Application number: BRPI0621678-1A
Authority: BR
Inventors: Mizhou Hui
Original assignee: Amprotein Corp
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2011-12-20
Also published as: ZA200810776B; EP2021459A4; MX2008015671A; CA2654577A1; JP2009539373A; CN101506349B; DK2021459T3; EP2021459B8; IL195568A0; ES2663202T3; WO2006138143A1; EP2021459B1; AU2006344392A1; RU2008152326A; EP2021459A1; CN101506349A

Abstract

MéTODO PARA AUMENTAR O OXIGêNIO DISSOLVIDO EM UM VASO DE CULTURA E VASO PARA A CULTURA EM SUSPENSãO DE CéLULAS DE MAMìFEROS. Trata-se de um método para aumentar o oxigênio dissolvido do meio de cultura baseado no estudo de um sistema de bioreator eficaz descoberto precedente. Este método, conjuntamente com a adição de uma mistura ideal, forma uma base teórica para a construção eficaz do desenho e do protótipo do bioreator.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR O OXIGÊNIO DISSOLVIDO EM UM VASO DE CULTURA E VASO PARA A CULTURA EM SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve um método para produzir bioreatores eficazes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em uma descoberta precedente descrita em um pedido de patente PCT/US06/22312 intitulado "Vasos de cultura em suspensão" foi descrito um vaso da cultura de corpo grande com um fundo frusto-conico invertido na plataforma do agitador orbital para a cultura de células de mamíferos em suspensão. Surpreendentemente, este sistema era significativamente melhor do que o bioreator clássico e os frascos de agitador de fundo liso. Foi descrito este sistema que faz com que o meio de cultura suba pela parede do vaso facilmente com menos tensão hidromecânica. Este sistema criou uma camada de meio de cultura fina ampla para uma superfície prolongada, uma aeração maior e uma melhor mistura.

É interessante observar que não era conhecido qual exatamente era o mecanismo de ação desse sistema de vaso de fundo frusto-conico baseado em agitador. Na presente invenção, foi descoberto o mecanismo de ação. Com base no mecanismo de ação, ou seja, um método para aumentar o nível de oxigênio dissolvido no meio de cultura, foram projetados e testados vários tipos de bioreatores de cultura de células de mamíferos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve o mecanismo de ação de vasos previamente descritos de cultura em suspensão com um fundo frusto-conico ou de frusto invertido (pedido de patente PCT/US06/22312). A presente invenção apresenta um método para aumentar o oxigênio dissolvido (DO) no meio de cultura, que forma uma base para desenhar e tornar eficazes bioreatores de cultura de células de mamíferos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 - Um vaso de corpo amplo com fundo frusto-conico invertido para a cultura de células de mamíferos em suspensão.

Figura 2a - Ilustração da tecnologia de detecção de sensor de remendo de DO/pH Flurometrix.

Figura 2b - Sistema de detecção de sensor de remendo de DO/pH 2b Fluorometrix.

Figura 3 - vaso de cultura de volume útil de 150 mL com fundo frusto-conico invertido na plataforma do agitador.

Figura 4 - Uso de bomba de ar para borbulhar o meio de cultura no estado estático para aumentar o nível de DO.

Figuraas 5a, b, c, d, e - Características de superfícies médias instantâneas capturadas em câmera digital Nikon. Em um momento instantâneo, todas as fotografias mostraram um nível de superfície médio inclinado em um lado da parede do vaso.

Estas características do movimento do meio aumentam o DO no meio de cultura ao "varrer" ou lavar repetitivamente a superfície lisa do vaso exposta ao ar.

Figuras 6a, b - Utilizando o movimento de rolamento dos tubos de plásticos inclinados, o meio de cultura dentro do tubo "varre" ou lava repetitivamente a superfície lisa da parede do vaso exposta ao ar. Este movimento aumenta rapidamente o DO no meio para 100%.

Figura 7 - Uso de tubos de plástico com fundo frusto-conico invertido (diâmetro de 3 cm) , as células CHOK cultivadas em suspensão atingiram facilmente 2,2% de pcv em quatro dias de cultura na plataforma do agitador ajustável com 100% de DO constantes. Isto criou um sistema de minibioreator eficaz para a seleção de robustez de clones de células.

Figura 8a - Um bioreator de auto-rolamento com formato de esfera com movimento para frente e para trás para a mistura do meio de cultura.

Figura 8b - Um bioreator de auto-rolamento com formato de esfera na plataforma do agitador orbital para a mistura do meio de cultura.

Figura 8c - Um vaso de bioreator de auto-rolamento com formato de cone com trilhos orbitais projetados internos.

Figura 9a - Base do vaso de 10 litros com fundo frusto-conico invertido para saco de cultura de plástico.

Figura 9b - Base do vaso de 10 litros com fundo frusto-conico invertido.

Figura 10a - Seleção de robustez de clones de células

Flurometrix atuais e o sistema de minibioreator de elevado rendimento de otimização do processo.

Figura 10b - Múltiplas cavidades baseadas em agitador com fundo frusto-conico para a seleção da robustez de linhagens de células.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta precedente que, sem utilizar uma torre de controle sofisticada e as sondas de DO e pH relacionadas, as células de mamíferos adaptadas em suspensão cresceram de uma maneira significativamente melhor em vasos de cultura com um fundo frusto-conico ou de frusto invertido em uma plataforma do agitador com um determinado comprimento do movimento em relação ao bioreator Applikon clássico, bem como aos frascos de agitador de fundo liso (figura 1).

A fim de estudar o seu mecanismo de ação, foi empregado o sensor de DO, o sensor de pH e o seu sistema de detecção (www.flurometrix.com) (Figuras 2a, b). Também foi empregada uma câmera digital (Nikon) para capturar e estudar o movimento detalhado do meio de cultura durante o movimento de agitação nos vasos de fundo frusto-conico. Primeiramente, foi medido o DO do meio de cultura em um vaso com um volume útil de 150 mL com um fundo cônico invertido (figura 3). Foi verificado que o nível de DO atingiu facilmente os 100% (Tabela 1). Foi então utilizada uma bomba de ar para borbulhar o meio de cultura em um mesmo vaso no estado estático (figura 4). Surpreendentemente, não conseguiu atingir os 100% em um período de tempo razoável (Tabela 2). Este fenômeno causou uma surpresa muito grande, uma vez que foi utilizado rotineiramente o método de borbulhamento de ar para calibrar a sonda de DO no bioreator Applikon de 3 litros e foi suposto que atingiu os 100%. Deve haver um mecanismo de ação por trás deste fenômeno.

Tabela 1 - Meio de cultura fresco foi adicionado ao vaso de cultura com um volume útil de 150 mL com fundo frusto-conico invertido com agitação a 120 RPM (figura 3). A cada trinta minutos, o DO foi medido.

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Tabela 2 - Meio de cultura fresco foi adicionado ao vaso de cultura com um volume útil de 150 mL com fundo frusto-conico invertido sem agitação. Um borbulhamento com bomba de ar foi utilizado para adicionar DO ao meio (figura 4). A cada trinta minutos, o DO foi medido.

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Em busca da resposta, foi utilizada uma câmera de alta velocidade para capturar o movimento instantâneo do meio de cultura nos vasos de cultura com fundo frusto-conico invertido durante a agitação (Figuras 5a, b, c, d) (Figura 3). Todas as fotografias mostraram claramente que em um determinado momento o meio de cultura fica principalmente em um lado dos vasos da cultura ao passo que a maior parte do outro lado é exposta ao contato com o ar. Devido ao fundo cônico invertido, o movimento de agitação move facilmente o meio de cultura que sobe em um lado da parede dos vasos. Isto cria um movimento circular da corrente do meio, "varrendo" ou lavando repetidamente a parede do vaso exposta ao ar. Foi suposto que este movimento circular e sua "varredura" repetitiva aumentou o DO no meio de cultura.

0 oxigênio dissolvido (DO) é encontrado nas bolhas microscópicas de oxigênio que são misturadas na água ou no meio de cultura e ocorrem entre as moléculas de água. No caso acima, é possível que as bolhas minúsculas de oxigênio absorvidas na superfície lisa de vidro ou de plástico e desse modo formaram uma camada microscópica de bolhas de oxigênio durante o período de exposição instantânea ao ar. Foi suposto então que a camada de bolha de ar formada instantaneamente na superfície lisa é tão minúscula que se assemelha ao tamanho microscópico da bolha de DO na água. Esta camada microscópica da bolha é então "varrida" ou lavada ao circular a corrente do meio, desse modo fazendo com que o oxigênio seja dissolvido na água facilmente. Este movimento circular ocorre repetidas vezes devido ao fundo frusto-conico e ao movimento de agitação, aumentando desse modo o nível de DO mais eficientemente do que o borbulhamento direto de ar no meio incluindo o borrifamento.

Para testar esta hipótese, foram empregados tubos de plástico de 12 mL (NUNC) com 4 mL de meio de cultura e cilindro do rolamento a uma velocidade de 60 RPM (figuras 6a, b). Logo após dez minutos de rolamento, todas as amostras do meio nos tubos atingiram 100%. Este estudo mostrou que o meio de cultura ou a corrente do meio que varreu repetidamente ou entrou em contato com a superfície lisa exposta ao ar com determinada velocidade ou intensidade aumentou o DO do meio de cultura de uma maneira surpreendentemente eficaz.

Foram então cultivadas células CHOK em suspensão nos tubos no cilindro de rolamento a uma velocidade de 60 e 100 RPM por quatro dias. Conforme esperado, elas atingiram 100% em todos os casos durante estes quatro dias de cultura. No entanto, as células não cresceram de maneira nenhuma. Desse modo, a conclusão é que deve ser necessária uma mistura eficaz além de um DO do meio suficiente para a cultura ideal de células em suspensão. As células foram então cultivadas em tubos de centrífuga de 50 mL (NUNC) com fundo frusto-conico invertido em uma plataforma do agitador ajustável por quatro dias (figura 7). Todas as célula cresceram e alcançaram facilmente 2,2% de volume de célula aglomerado (pcv). Este resultado indicou que o movimento de mistura é requerido além de um DO suficiente para a cultura ideal de células em suspensão.

Com base nas descobertas acima, foram desenhados vários tipos de bioreatores para a construção do protótipo. Para cada tipo, foi incorporado o método para aumentar o DO no meio de cultura repetidamente ao utilizar a corrente de meio para varrer ou entrar em contato com a superfície lisa exposta ao ar com intensidade conjuntamente com o movimento de mistura do meio suficiente em consideração (figuras 8a, b, c). Os detalhes são descritos ainda no Exemplo 4.

Também foram examinados os detalhes de um processo de grupo em batelada ao utilizar uma linhagem de células CHOK em suspensão expressando TNFR2-Fc-IL-Ira em um meio de cultura em suspensão sem soro. Foi claramente demonstrado que os vasos de cultura com fundo frusto-conico invertido eram ideais com nível de DO, densidades de célula, e rendimento do produto ideais (Tabela 3) . Os detalhes também são descritos no Exemplo 1.

Exemplo 1

Estudo de cultura de batelada de vaso com um volume útil de 150 mL com fundo frusto-conico invertido.

O uso de vasos de agitador com um volume útil de 150 mL de pequena escala para a cultura de batelada de linhagem de células de produção CHO que expressa candidatos de droga de TNFR2-Fc-IL-Ira foi feito no meio de cultura BOOl sem soro por oito dias. O DO foi medido a cada dia utilizando o sistema de detecção de sensor de remendo de DO Fluorometrix (figuras 2a, b). Além do uso do sistema de detecção Flurometrix, o pH também foi detectado por um medidor de pH portátil (figura 2b). A glicose foi medida por um medidor de glicose de um toque (figura 2b). A Tabela 3 mostra claramente que os vasos de cultura com fundo frusto-conico invertido eram ideais com nível de DO, densidade de célula, e rendimento do produto ideais.

Tabela 3 - Monitoramento simultâneo do DO, pH e glicose. A velocidade e a temperatura de mistura em um processo de cultura de batelada em um vaso com um volume útil de 150 mL com fundo frusto-conico invertido.

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Exemplo 2

Produção de sacos de plástico de cultura de células de um só uso em bases de vasos de bioreatores com fundo frusto-conico invertido

Bases de vasos de bioreatores com fundo frusto- conico invertido e sacos de plástico mole (figuras 9a, b) foram desenhadas e construídas. Essas bases e sacos foram projetados para serem utilizados em plataformas de agitadores com comprimento de movimento ajustável. A finalidade do fundo frusto-conico projetado conjuntamente com a plataforma ajustável do agitador era fazer o meio de cultura subir tão alto quanto possível e tão mais fácil quanto possível (uso mínimo da energia de agitação) para aumentar o nível de DO no meio e enfrentar o desafio de utilização de um nível elevado de O2 na condição de cultura de alta densidade de célula. Bases de vasos de tamanhos de 3, 10, 20, 40, 100, 500 e 1.000 litros e sacos de plástico foram projetados para a construção do protótipo e os testes. 0 objetivo é a construção de bioreatores de cultura de mamífero de um só uso com menos força de cisalhamento econômicos para R&D e usos industriais.

Exemplo 3

Desenho de placa de múltiplas cavidades baseada em agitador com fundo frusto-conico invertido para a seleção da robustez dos clones de produção após a seleção de título de expressão de proteína de elevado rendimento

A robustez de uma linhagem de células de produção é importante para a estabilidade do processo de escalonamento e o rendimento de expressão final de uma determinada droga de proteína. Entre as linhagens de células de alta expressão selecionadas entre milhares de clones de células, algumas delas são linhagens de células robustas que satisfazem o padrão de células de produção industrial. As linhagens de células robustas selecionadas podem crescer em alta densidade elevada por um tempo mais longo e gerar desse modo um título de expressão mais de dez vezes maior do que o título de expressão de clone de célula selecionado original.

0 sistema de mini-bioreator atual (www.flurometrix.com) para a seleção de robustez de linhagens de células e a otimização do processo (figura 10a) não é otimizado para o crescimento de células de alta densidade e não tem um nível de DO ideal para o suporte de uma população de células de alta densidade. Desse modo, não tem a seleção dos clones de células robustas. Sem DO do meio suficiente, não há nenhuma maneira de otimizar o processo de alimentação de batelada a uma alta densidade de célula.

A placa de múltiplas cavidades projetada na plataforma do agitador (figura 10b) irá prover DO suficiente no meio devido ao movimento de agitação e ao fundo frusto- conico das cavidades de cultura para suportar o crescimento de células de alta densidade, desse modo podendo selecionar a capacidade final de uma determinada linhagem de células de crescer em uma densidade mais elevada e ser distiguida dos clones de células não-robustas. Este sistema é fácil de manipular e além disso muito econômico.

Exemplo 4

Desenho de bioreatores eficazes com base no método para aumentar o DO no meio de cultura combinado com o movimento de mistura eficaz

Com base nos experimentos de cilindro de rolamento acima realizados (figuras 6a, b), foi descoberto um método para aumentar o DO no meio de cultura de células de mamíferos. Foram então projetados bioreatores de rolamento (figuras 8a, b c). A figura 8a mostra um vaso de bioreator de auto-rolamento com formato de esfera pela lavagem repetitiva da superfície interna do vaso exposta ao ar. Esse movimento de rolamento aumenta o DO no meio de cultura para suportar o crescimento de células de alta densidade. Enquanto que um movimento para frente e para trás ao nível da terra deixa o meio de cultura bem misturado durante o movimento de rolamento (figura 8a). Conjuntamente, eles suportam uma cultura de células em suspensão ideal.

A figura 8b mostra um vaso de bioreator de auto- rolamento com formato de esfera. Esse movimento de rolamento aumenta o DO no meio de cultura ao lavar repetitivamente a superfície interna do vaso exposta ao ar para suportar o crescimento de células de alta densidade. Enquanto que uma plataforma de agitador orbital ao nível da terra deixa o meio de cultura bem misturado durante o movimento de rolamento. Conjuntamente, eles suportam uma cultura de células em suspensão ideal.

A figura 8c mostra um vaso de bioreator de auto- rolamento com formato de cone. Esse movimento de rolamento aumenta o DO no meio de cultura ao lavar repetitivamente a superfície interna do vaso exposta ao ar para suportar o crescimento de células de alta densidade. Enquanto que os trilhos orbitais projetados internamente deixam o movimento do meio de cultura se mover até a extremidade superior enquanto rola e cair de volta na extremidade inferior. Este movimento adicional ajuda a mistura do meio de cultura durante o movimento de rolamento. Conjuntamente, eles suportam a cultura de células em suspensão ideal.

Claims

1. MÉTODO PARA AUMENTAR O OXIGÊNIO DISSOLVIDO EM UM MEIO DE CULTURA, para uma cultura em suspensão de células de mamíferos sem o uso de bombeamento de oxigênio ou ar, caracterizado pelo fato de que a cultura de células é contida dentro de um vaso de cultura que tem paredes lisas.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de não incluir o uso de uma força de cisalhamento significativa nas célula cultivadas.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender o movimento do meio de cultura em um movimento de varredura repetitivamente através da superfície lisa da parede do vaso de cultura exposta ao ar.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o movimento compreende qualquer um dos seguintes movimentos: agitação, rolamento, oscilação, movimento para frente e para trás, e fluência.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a superfície compreende um vidro.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a superfície compreende um plástico.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a superfície compreende um metal.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de incluir a mistura de meio adicional para o crescimento ideal da célula na cultura em suspensão.

9. VASO PARA A CULTURA EM SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS, caracterizado pelo fato de ser um recipiente com formato de esfera de auto-rolamento com movimento para frente e para trás adicional.

10. VASO PARA A CULTURA EM SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS, caracterizado pelo fato de ser um recipiente com formato de esfera de auto-rolamento com movimento de agitação orbital adicional.

11. VASO PARA A CULTURA EM SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS, caracterizado pelo fato de ser um recipiente com formato de cone de auto-rolamento com trilhos orbitais projetados internos para o movimento adicional do meio de cultura.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser executado no vaso tal como reivindicado em 9, 10 ou 11.