Zellkulturgefäß und
Verwendung von Multischalen zur Züchtung von Antitumorzellen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Zellkulturgefäß zum Züchten eines Antitumor- zellen-Transplantats für die Gen- und Zelltherapie, umfassend ein Basisteil mit einer Mehrzahl von Stützstellen, welche eine Stützebene zum Abstützen des Zellkulturgefäßes auf einem im wesentlichen planen Untergrund aufspannen, sowie mit einer zur Stützebene im wesentlichen parallel ver- laufenden oberen Fläche, in der eine Mehrzahl von Züchtungsvertiefungen ausgebildet sind, und ferner umfassend einen Deckel zum Abdecken des Basisteils.
Die Stützstellen können dabei beispielsweise von einer Mehrzahl gesonder- ter Stützansätze des Basisteils gebildet sein. Ferner ist es möglich, daß die Stützstellen Teil eines umlaufenden Stützrandes oder einer unteren Begrenzungsfläche des Basisteils sind.
Bei der Züchtung eines Transplantats für die Tumorbekämpfung kann bei- spielsweise wie folgt vorgegangen werden:
Man entnimmt dem Patienten eine Blutprobe. In dieser befinden sich in geringer Anzahl (bspw. 1 0.000) auch auf Zellen des zu bekämpfenden Tumors spezifisch ansprechende Abwehrzellen, sogenannte Anti-Tumor- Zellen.
Bei der Züchtung des Anti-Tumor-Transplantats gilt es nun, diese geringe Anzahl von Anti-Tumor-Zellen spezifisch zu stimulieren und in großem
Maßstab selektiv zu vermehren. Das Wachstum der Anti-Tumor-Zellen kann beispielsweise dadurch stimuliert werden, daß man sie mit ganzen Tumor¬ zellen oder sogenannten Vesikeln der Tumorzellen in Kontakt bringt.
Zum Erhalt von Tumorzellen entnimmt man dem Patienten Tumorgewebe. Die Tumorzellen von z.B. soliden Tumoren werden mit Hilfe an sich bekannter Verfahren, bspw. unter Einsatz von Enzymen, vereinzelt. Durch Lyse der Tumorzellen und anschließendem Filtrieren wird die Erbinformation entfernt, so daß man nur noch die Zellmembranen oder Bruchstücke dieser Zellmem- branen zurückbehält, nämlich die vorstehend angesprochenen Vesikel. Diese Vesikel tragen zwar immer noch die für Tumorzellen charakteristischen Oberflächenmerkmale, so daß sie von Abwehrzellen als Tumorzellen erkannt werden können. Sie können jedoch auf ihre Umgebung, bspw. die Abwehrzellen, nicht mehr durch Abgabe von Hormonen oder dergleichen einwirken, so daß sie die Arbeit des Immunsystems nicht behindern können. Ferner können sie sich nicht mehr vermehren, so daß sie nach der Injektion des Anti-Tumor-Transplantats in den Patienten nicht der Bildung von Metastasen Vorschub leisten können.
Die so gewonnenen Tumorzellen oder Tumorzellvesikel kann man zur Stimulation des Wachstums der Anti-Tumor-Zellen in einem Nährlösung enthaltenden Züchtungsgefäß mit der vorbehandelten Blutprobe zusammenführen. Nach einer ersten Expansion der Anti-Tumor-Zellen müssen die Zellen portioniert und mit frischer Nährlösung auf mehrere Züchtungsgefäße oder mehrere Züchtungsaufnahmen ein und desselben Züchtungsgefäßes verteilt werden.
Haben sich die Anti-Tumor-Zellen in ausreichendem Maße vermehrt, so können sie durch einen Selektionsschritt weitgehend vom Hintergrund unerwünschter, unspezifischerZellen getrennt werden. Hierzu markiert man die Anti-Tumor-Zellen bspw. mit Hilfe von Retroviren, welche zur Expression eines Selektionsmarkers führen, z.B. neomycin- oder I-NGFR-Gen
(l-NGFR - niederaffiner NGF-Rezeptor - Iow affinity nerve qrowth factor receptor) . An die Separation kann sich ein erneuter Expansionsschritt anschließen, wobei die Anti-Tumor-Zellen wiederum portioniert und auf eine Mehrzahl von Züchtungsgefäßen bzw. -aufnahmen verteilt werden müssen.
Auf diese Weise kann aus anfänglich bspw. etwa 10.000 Anti-Tumor-Zellen in der vorbehandelten Blutprobe ein Anti-Tumor-Transplantat von etwa 107 bis 108 Anti-Tumor-Zellen in einem Volumen von 50 bis 100 ml erhalten werden.
Das vorstehend beschriebene beispielhafte Züchtungsverfahren wirft - wie andere vergleichbare Züchtungsverfahren auch - in der Praxis verschiedene Probleme auf:
Im Hinblick auf die Gefahr einer Kontamination der Zellenkultur, deren Gefahr nicht nur im Absterben der Kultur, sondern insbesondere in einer Infektion des Patienten liegt, birgt jeder Zugriff von außen auf die Zellkultur ein nicht bzw. nur schlecht zu kalkulierendes Risiko. Bei dem vorstehend beschriebenen herkömmlichen Verfahren sind insbesondere bei der wieder- holten Portionierung der expandierten Anti-Tumor-Zellen zahlreiche derartige Eingriffe erforderlich.
Im Hinblick auf das vorstehend diskutierte Problem werden in der Praxis daher ausschließlich relativ großvolumige Züchtungsgefäße bzw. Züch- tungsgefäße mit relativ großvolumigen Züchtungsaufnahmen verwendet, da nur diese bei einer minimalen Zahl von Portionierungsschritten das erforderliche Transplantatsvolumen zu erhalten gestatten. Derartige Züchtungsgefäße sind beispielsweise Kulturschalen mit einer Mehrzahl von typischerweise vier bis sechs relativ großvolumigen Züchtungsvertiefungen, von denen die vorliegende Erfindung im Oberbegriff des Anspruchs 1 ausgeht.
Die Vertiefungen der gattungsbildenden Multischalen haben einen ebenen Boden und daran im wesentlichen orthogonal anschließende Begrenzungswände. Andererseits sind die bekannten, sich verjüngenden Multischalen ausschließlich für diagnostische Anwendungen konzipiert (Terasaki-Platten) . Einschränkend gilt für letztere Systeme, daß das pro Vertiefung applizier- bare Volumen für Zellkulturmedium deutlich unter 1 ml liegt. Multischalen mit im wesentlichen orthogonalem Begrenzungswänden bedingen nach dem Einbringen der vorbehandelten Blutprobe bzw. einer zuvor portionierten Zellkultur eine relativ geringe anfängliche Dichte der Anti-Tumor-Zellen in der jeweiligen Züchtungsvertiefung.
Die Wachstumsrate von Anti-Tumor-Zellen hängt nun aber unter anderem von der Dichte dieser Zellen in der Züchtungsvertiefung ab. Kritisch ist hier jedoch nicht nur eine zu hohe Zellendichte, sondern auch eine zu geringe Zellendichte, so daß das Anwachsen der Zellen bei den herkömmlichen Multischalen relativ lange dauert. Dies hat insbesondere aufgrund der mehrfachen Portionierung der Zellkultur eine entsprechend geringere Effizienz des Züchtungsverfahrens zur Folge.
Aus der US 5,229,1 63 ist eine für diagnostische Zwecke konzipierte Mikro- titer-Platte bekannt. Die DE 29 02 026 B2 offenbart Multiwell-Platte, die für Testzwecke und Zellkulturen im kleinen Maßstab ausgelegt ist. Auch bei den aus der JP 08 1 31 1 53 A bekannten Aufnahmen geht es um diagnostische Probleme, nämlich um die Bestimmung der Cytotoxizität von Chemika- lien. Die EP 0 589 634 A1 befaßt sich mit der Detektion von Mikroorganismen in Proben. Aus der US 5,288,638 ist eine Kulturflasche bekannt, die ein einziges großes Volumen umfaßt und zur Durchführung mikrobiologischer Tests von unter Druck stehenden Flüssigkeiten dient. Schließlich offenbart die US 5,462,874 eine spezielle Multiwell-Platte, deren Züch- tungsvertiefungen im wesentlichen orthogonale Begrenzungswandungen aufweisen und somit für die in der vorliegenden Anmeldung diskutierte Züchtung eines Anti-Tumor-Zellen-Transplantats nicht in Betracht kommen.
Im Hinblick auf die vorstehend diskutierten Nachteile des Standes der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Kulturgefäß bereitzustellen, welches eine Reduzierung sowohl der zum Anwachsen der Zellkultur erfor¬ derlichen Zeitdauer als auch des Risikos einer Verunreinigung der Zellkultur ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß von einem Zellkulturgefäß der eingangs angegebenen Art gelöst, bei welchem sich wenigstens eine Züchtungsvertiefung von der oberen Fläche des Basisteils zum Vertiefungsboden hin verjüngt, d.h. bei welchem die Querschnittsfläche dieser wenigstens einen Vertiefung von der oberen Fläche des Basisteils zum Boden hin abnimmt, und bei welchem darüber hinaus das Basisteil und der Deckel flüssigkeitsdicht miteinander verbindbar sind.
Zur Züchtung des Zelltransplantats können die Anti-Tumor-Zellen zunächst nur in eine sich verjüngende Züchtungsvertiefung des mit Nährlösung gefüllten Zellkulturgefäßes eingebracht werden. Die Zellen rutschen schwerkraftbedingt an den Wandungen der Vertiefung entlang zu deren Boden, wo sie aufgrund der sich verjüngenden Struktur der Vertiefung in einer ihr Anwachsen begünstigenden Dichte beieinander liegen. Bei ihrer Vermehrung können sich die Zellen in der Züchtungsvertiefung nicht nur nach oben, sondern auch in Querrichtung ausbreiten. Dies verhindert, daß sie frühzeitig eine ihre weitere Vermehrung behindernde Dichte erreichen.
Nach erfolgter initialer Expansion der Zellkultur hin zu einer kritischen hohen Zelldichte kann die Portionierung allein durch Schütteln des Zellkulturgefäßes erfolgen. Hierbei vermischt sich die in der bzw. den anderen Züchtungsvertiefungen aufgenommene Nährlösung mit der die anfängliche Zellkultur enthaltenden Nährlösung. Stellt man das Züchtungsgefäß nun in den Züchtungsschrank zurück, so verteilt sich die Nährlösung und mit ihr auch die gezüchteten Anti-Tumor-Zellen auf die Mehrzahl von Züchtungsvertiefungen. Es ist somit kein Eingriff von außen erforderlich, so daß bei dem
erfindungsgemäßen Zellkulturgefäß auch die mit einem derartigen Eingriff verbundene Gefahr einer Kontamination der Zellkultur nicht besteht.
Zur Erzielung einer das Anwachsen der Zellen nach erfolgter Portionierung begünstigenden Zellendichte auf dem Boden der Züchtungsvertiefungen, können die Bodenflächen der Züchtungsvertiefungen unterschiedlich groß bemessen sein. Vorzugsweise können die andere Züchtungsvertiefung bzw. die anderen Züchtungsvertiefungen eine größere Bodenfläche aufweisen als die der ersten Expansion dienende Züchtungsvertiefung. Ferner können alle oder zumindest einige Züchtungsvertiefungen sich zu ihrem Boden hin verjüngend ausgebildet sein.
Um den Zellen bei der Vermehrung stets eine Ausbreitung auch in Querrichtung ermöglichen zu können, ist vorgesehen, daß die Querschnittsfläche der Vertiefungen zumindest über einen Teil der Höhe der Vertiefungen zum Boden hin monoton abnimmt. Die Vermehrung behindernde Ecken können bspw. dadurch vermieden werden, daß die Querschnittsfiäche ferner stetig abnimmt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Vertiefungen konisch oder kegelstumpfförmig ausgebildet. Der halbe Öffnungswinkel des Kegels beträgt dabei vorzugsweise zwischen etwa 30° und etwa 70° . Die Vertiefungen können jedoch auch eine andere Gestalt aufweisen und bspw. halbkugelförmig ausgebildet sein. Ferner kann sich an die konische bzw. kegelstumpf-förmige Fläche bspw. eine Zylinderfläche anschließen.
im Hinblick auf die vorstehend angesprochene Ermöglichung der Ausbreitung auch in Querrichtung ist es selbstverständlich auch bei anderen Ausführungsformen, beispielsweise Ausführungsformen mit pyramiden- oder pyramidenstumpf-artigen Vertiefungen, bevorzugt, wenn der Winkel, den die Schrägfläche mit der Vertikalen einschließt, zwischen etwa 30° und etwa 70° beträgt.
Zur Begünstigung der Zellvermehrung kann wenigstens eine der Vertiefun¬ gen zumindest teilweise, vorzugsweise im Bereich ihres Bodens, mit wenig¬ stens einem die Zellvermehrung begünstigenden Stoff beschichtet sein. Diese Beschichtung kann beispielsweise die vorstehend angesprochenen Tumorzellvesikel und/oder andere die Expansion der Anti-Tumor-Zellen begünstigende Stimulatoren umfassen. Und auch die Innenfläche des Deckels kann mit wenigstens einem die Zellvermehrung begünstigenden Stoff beschichtet sein.
Eine Möglichkeit der Verbindung von Basisteil und Deckel besteht darin, diese Teile stoffschlüssig miteinander zu verbinden, bspw. durch Verkleben, Verschweißen oder dergleichen. Diese beispielsweise bereits bei der Fertigung erfolgende dauerhafte Verbindung von Deckel und Basisteil ist insbesondere im Hinblick auf die Gefahr einer Kontamination der Umgebung von Vorteil.
Grundsätzlich ist jedoch auch möglich, daß der Deckel mit dem Basisteil verschraubbar ist, da dies die gewünschte Dichtungswirkung in besonders einfacher Weise zu erzielen erlaubt. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß der Deckel an dem Basisteil festspannbar ist, wobei hierunter auch eine Klemmverbindung nach Art eines Tupperware(R1-Gefäßes verstanden werden soll.
Das erfindungsgemäße Zellkulturgefäß kann beispielsweise in Draufsicht kreisförmig ausgebildet sein. Es ist jedoch auch möglich quadratische oder rechteckige Zellkulturgefäße zu verwenden.
Um gewünschtenfalls auf den Innenraum des Zellkulturgefäßes zugreifen zu können, beispielsweise um verbrauchte Nährlösung durch frische Nährlö- sung ersetzen zu können oder um Gentransfersysteme wie bspw. Retrovi- ren zum Markieren der Anti-Tumor-Zellen zugeben zu können oder dergleichen mehr, wird in Weiterbildung der Erfindung vorgeschlagen, daß das
Basisteil oder/und der Deckel wenigstens eine Zugangsstelle, vorzugsweise mehrere Zugangsstellen, zum Zugeben bzw. zum Entnehmen von Stoffen in das Gefäß bzw. aus dem Gefäß aufweist. Diese Zugangsstelle kann beispielsweise eine Öffnung aufweisen, welche mittels einer aus Gummimate- rial bzw. gummi-artigem Material gebildeten Membrane verschlossen ist. Derartig ausgebildete Zugangsstellen sind beispielsweise von Flaschen bekannt, aus welchen mit einer Spritze Flüssigkeit entnommen wird. Sie haben den Vorteil einer geringen Gefahr der Kontamination des Flascheninhalts. Vor dem Durchstechen mit der Spritzennadel wird die Membrane bspw. mit Alkohol desinfiziert. Beim Herausziehen der Spritzennadel aus der Flasche verschließt sich die Membrane aufgrund ihrer Gummielastizität selbsttätig und verhindert so den Eintritt von Verunreinigungen.
Um beipielsweise das Absaugen oder Abgießen der Anti-Tumor-Zellen zu ermöglichen, kann die Zugangsstelle eine mittels eines Schraubverschlusses verschließbare Öffnung aufweisen. Zur Erleichterung des Abgießens sowie zur Sicherstellung einer praktisch vollständigen Entleerung des Zellkulturgefäßes wird ferner vorgeschlagen, daß der Deckel alleine oder das Basisteil alleine oder Deckel und Basisteil gemeinsam einen trichter-artig zusammen- laufenden Wandungsbereich festlegen, dessen Mündungsöffnung die Zugangsstelle zugeordnet ist.
In Weiterbildung der Erfindung wird vorgeschlagen, daß der Deckel oder/und das Basisteil wenigstens eine Anschlußstelle für weitere Behandlungsgeräte aufweist. Ein derartiges weiteres Behandlungsgerät kann beispielsweise eine Separationssäule sein, die nach ausreichender Zellvermehrung zum Abtrennen der Anti-Tumor-Zellen vom Störhintergrund unerwünschter, unspezifischer Zellen verwendet wird. Dabei kann das erfindungsgemäße Zellkulturgefäß sowohl das die Zellkultur an die Separationssäule abgebende Gefäß als auch das die abgetrennten Anti- Tumor-Zellen zur weiteren Vermehrung aufnehmende Gefäß sein.
Zur Verbindung des erfindungsgemäßen Zellkulturgefäßes mit anderen Vorrichtungen, beispielsweise der Separationssäule, können sowohl starre als auch schlauchartig flexible Verbindungselemente verwendet werden.
Zur Minimierung des Kontaminationsrisikos wird hierbei ferner vorgeschlagen, daß die Anschlußstelle eine mittels einer Membrane verschlossene Öffnung aufweist und derart ausgebildet ist, daß die Membran beim Anschließen des weiteren Behandlungsgeräts erst nach Herstellung einer zur Umgebung hin flüssigkeitsdichten Verbindung zwischen dem Zellkulturge- faß und dem weiteren Behandlungsgerät zerstört wird.
Um ein "Atmen" der Zellen bei der Vermehrung ermöglichen zu können ist vorgesehen, daß das Zellkulturgefäß gaspermeabel ausgebildet ist. Hierzu kann es beispielsweise wenigstens eine mittels einer gaspermeablen Mem- brane verschlossene Öffnung aufweisen.
Die Kosten zur Herstellung des Zellkulturgefäßes können dadurch minimiert werden, daß es zumindest teilweise im Spritzgußverfahren aus Kunststoff gefertigt ist.
Zur Ermöglichung einer visuellen Kontrolle des Zellenwachstums wird ferner vorgeschlagen, daß zumindest der Boden der Züchtungsvertiefungen, vorzugsweise das gesamte Basisteil, noch bevorzugter auch der Deckel, aus einem durchsichtigen Material gefertigt ist.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung die Verwendung von eine Mehrzahl von beispielsweise konischen oder kegelstumpfförmigen Vertiefungen aufweisenden Zellkulturschalen zum Züchten von Antitumor- zellen für die Gen- und Zelltherapie.
Die Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es stellt dar:
Fig. 1 eine Schnittdarstellung einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäße Zellkulturgefäßes;
Fig. 2 eine schematische Draufsicht auf das Zellkulturgefäß gemäß Fig. 1 ;
Fig. 3 eine Schnittdarstellung einer weiteren Ausführungsform einer
Züchtungsvertiefung des Zellkulturgefäßes;
Fig. 4 bis 6 schematische Draufsichten auf weitere Ausführungsformen des Zellkulturgefäßes; und
Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Separationssäulen-
Anordnung, bei welcher ein erfindungsgemäßes Zellkultur- gefäß zum Einsatz kommt.
In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßes Zellkulturgefäß allgemein mit 10 bezeichnet. Das Zellkulturgefäß 10 umfaßt ein Basisteil 12 und einen Deckel 14, die vorzugsweise beide aus transparentem Kunststoff gefertigt sind, beispielsweise im Spritzgußverfahren. Das Basisteil 12 und der Deckel 14 weisen in Draufsicht kreisförmigen Querschnitt auf, wie dies in Fig. 2 grob- schematisch dargestellt ist.
Das Basisteil 12 umfaßt einen zylindrischen Umfangsrand 12a, dessen Unterkante 12b eine Stützebene E zum Abstützen des Zellkulturgefäßes 10 auf einem Untergrund, beispielsweise einem Fach eines Zellzüchtungs- schranks, dient. Selbstverständlich ist hierzu keine vollständig in der Ebene E umlaufende Unterkante 12b erforderlich. Vielmehr genügt es zur stabilen Abstützung des Zellkulturgefäßes 10 auf dem Untergrund, wenn das Zellkulturgefäß wenigstens drei Stützbeine aufweist.
Das Basisteil 1 2 weist ferner eine die Umfangswandung 1 2a einseitig verschließende obere Fläche 1 2c auf, in der im Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 und 2 insgesamt vier Züchtungsvertiefungen 1 6 mit einem Volumen von jeweils mindestens 1 ml ausgebildet sind.
In dem dargestellten Ausführungsbeispiel weisen alle Vertiefungen 1 6 eine Querschnittsfläche auf, die sich von der oberen Fläche 1 2c des Basisteils zum Boden 1 6a bzw. 1 6b der Vertiefung 1 6 hin verjüngt. Mit dem Wort "verjüngen" ist hierbei gemeint, daß die Querschnittsfläche der Vertiefung 1 6 mit wachsendem Abstand von der oberen Fläche 1 2c an keiner Stelle wieder zunimmt, sondern stets abnimmt bzw. allenfalls konstant bleibt, wie dies in Fig. 3 für den bodenfernen Bereich 1 6c der Vertiefung 1 6 dargestellt ist. Auch muß die Querschnittsfläche der Vertiefung am Vertiefungsboden nicht zu Null abgenommen haben, sondern es kann eine endliche Boden- fläche vorgesehen sein, wie dies bei den Vertiefungsböden 1 6a und 1 6b gemäß Fig. 1 der Fall ist.
Auch die Vertiefungen 1 6 haben vorzugsweise kreisförmigen Querschnitt. Sie verjüngen sich zur Bodenfläche hin vorzugsweise konisch, wobei der in Fig. 1 mit a bezeichnete, halbe Öffnungswinkel des Konus zwischen etwa 30° und 70° beträgt.
Der bodennahe Bereich der Vertiefungen 1 6 ist mit einer Wachstumsstimu- latoren für die Anti-Tumor-Zellen umfassenden Beschichtung 1 8 versehen, welche beispielsweise Tumorzellvesikel umfaßt.
Im Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 umfaßt der Deckel 1 4 verschiedene Zugangsstellen 20, 22 und 24 zum Zuführen bzw. Entnehmen von Stoffen aus dem Zellkulturgefäß 1 0. Gleichwohl versteht es sich, daß derartige Zugangsstellen auch bzw. ausschließlich am Basisteil 1 2 vogesehen sein können. Auch unterliegt die Anzahl von Zugangsstellen keiner Beschränkung.
Die Zugangsstelle 20 weist einen an dem Deckel 14 einstückig angeformten Rohransatz 20a, eine Gummi-Membrane 20b sowie ein mit dem Rohransatz 20a fest verbundenes, beispielsweise verklebtes Verschlußelement 20c auf. Das Verschlußelement 20c weist in Verlängerung des Lumens 20a1 des s Rohransatzes 20a eine Durchbrechung 20c1 auf. Die Verbindung zwischen dem Lumen 20a1 des Rohransatzes 20a und der Durchbrechung 20c1 ist durch die Gummimembrane 20b dicht verschlossen. Über die Zugangsstelle 20 können beispielsweise die zu expandierenden Anti-Tumor-Zellen mittels einer Spritze in das Zellkulturgefäß 10 eingebracht werden. Hierzu ist die o Zugangsstelle 20 vorzugsweise über bzw. neben einer der Vertiefungen 1 6 angeordnet, so daß die Anti-Tumor-Zellen in einfacher Weise in die zu ihrer initialen Expansion bestimmte Vertiefung 16 eingebracht werden können. In Fig. 1 ist dies die in der linken Bildhälfte dargestellte Vertiefung 1 6'.
s Die Vertiefung 1 6' zur initialen Expansion der Anti-Tumor-Zellen weist eine besonders kleine Bodenfläche 16a auf, so daß die relativ wenigen, anfänglich vorhandenen Anti-Tumor-Zellen im Bereich dieser Bodenfläche 1 6a relativ dicht nebeneinander liegen, was den Austausch von ihr Wachstum begünstigenden Botenstoffe erleichtert. Zudem wird das spezifische Wachs- 0 turn der Anti-Tumor-Zellen durch die beispielsweise Tumorzellvesikel umfassende Beschichtung 1 8 begünstigt. Über die Zugangsstelle 20 kann auch die Nährlösung in dem Zellkuiturgefäß 10 erneuert werden.
Haben die Anti-Tumor-Zellen in der Vertiefung 16' sich in einem Maße 5 vermehrt, daß aufgrund ihrer nunmehr vorliegenden Packungsdichte toxische Reaktionen zu befürchten sind, die zum Absterben der Anti-Tumor- Zellen führen würden, so können die Anti-Tumor-Zellen durch einfaches Schütteln des gesamten Zellkulturgefäßes nach vorheriger Zugabe einer ausreichenden Menge an Nährlösung auch auf die anderen Vertiefungen 16 0 verteilt werden. Diese weisen vorzugsweise eine größere Bodenfläche 16b auf, die so gewählt ist, daß die Anti-Tumor-Zellen auch in den Vertiefungen 1 6 in einer ihr Anwachsen begünstigenden Zelldichte zu liegen kommen.
Ist die Expansion der Anti-Tumor-Zellen abgeschlossen, so können diese durch einfaches Auf-den-Kopf-Stellen des Zellkulturgefäßes 10 mit einer Beschichtung 26 in Kontakt gebracht werden, die im Deckel 14 vorgesehen ist. Diese Beschichtung 26 kann ebenfalls Wachstumsstimulatoren für die Anti-Tumor-Zellen enthalten. Diese Beschichtung 26 kann jedoch alternativ auch Retroviren zum Markieren der Anti-Tumor-Zellen für einen nachfolgenden Separationsschritt umfassen. Auf diesen Separationsschritt wird nachfolgend im Zusammenhang mit der Beschreibung der Fig. 7 noch näher eingegangen werden.
Zum Anschluß des erfindungsgemäßen Zellkulturgefäßes 10 an eine Separationssäule oder dergleichen dient die Zugangsstelle 24, die einen am Deckel 14 angeformten Rohransatz 24a aufweist. Das Lumen 24a1 des Rohransatzes 24a ist mittels einer aufgeklebten Verschlußkappe 24b abge- dichtet, die im Zuge der Verbindung mit einem Verbindungsstutzen, Verbindungsschlauch oder dergleichen zerstört wird. Zur Befestigung des Verbindungsstutzens bzw. Verbindungsschlauchs am Rohransatz 24 ist an letzterem ein Gewinde 24c angeformt.
Es ist jedoch auch möglich, die in der Nährlösung enthaltenen Anti-Tumor- Zellen aus dem Zellkulturgefäß 10 auszugießen. Hierzu weist das Zellkulturgefäß 10 an einem trichterartig zusammenlaufenden Wandungsabschnitt 10a die Zugangsstelle 22 auf. Die Zugangsstelle 22 umfaßt einen Rohransatz 22a sowie ein auf diesen mittels eines Gewindes 22b aufgeschraub- tes Verschlußelement 22c zum Verschließen des Lumens 22a1 des Rohransatzes 22a. Wie man der grobschematischen Darstellung in Fig. 2 entnimmt, kann der trichterartig zusammenlaufende Wandungsabschnitt 10a im Falle eines Zellkulturgefäßes 10 mit kreisförmigem Querschnitt einfach von der Zylinderwandung 14a des Deckels 14 gebildet sein.
Und auch bei einem Zellkulturgefäß mit in Draufsicht polygonalem Querschnitt kann die Polygonform des Zellkulturgefäßes zur Ausbildung des
trichterartigen Wandungsabschnitts genutzt werden, indem man die Zu¬ gangsstelle in einer Ecke des Polygons anordnet. So ist beispielsweise in Fig. 4 ein rechteckiges Gefäß 1 10 dargestellt, bei welchem der Trichter 1 10a von zwei Begrenzungswandungen des Rechtecks gebildet ist.
Gemäß Fig. 5 ist es jedoch ebenso möglich, an einer Seite eines Polygons (im Beispiels gemäß Fig. 5 eines Quadrats) einen zusätzlichen trichterartigen Wandungsabschnitt 21 Oa des Zellkulturgefäßes 210 vorzusehen, an den die Zugangsstelle 222 anschließt.
Gemäß Fig. 4 bis 6 unterliegt auch die Zahl der in dem Zellkulturgefäß vorgesehenen Züchtungsvertiefungen keiner Beschränkung. So weist das Zellkulturgefäß 1 10 gemäß Fig. 4 sechs Vertiefungen 1 1 6, das Züchtungsgefäß 210 gemäß Fig. 5 vier Vertiefungen 21 6 und das Züchtungsgefäß 210 gemäß Fig. 6 sieben Vertiefungen 31 6 auf. Ferner ist auch eine andere Anzahl von Züchtungsvertiefungen möglich. Ferner kommen auch andere Querschnittsgestalten als die in den Fig. 3 bis 6 dargestellten zur Ausbildung des Zellkulturgefäßes in Frage.
Nachzutragen ist noch, daß der Deckel 14 und das Basisteil 1 2 flüssigkeitsdicht miteinander verbunden sind. Da die erfindungsgemäßen Zellkulturgefäße im Hinblick auf die von ihnen ausgehende Kontaminationsgefahr vorzugsweise nach einmaligem Gebrauch als Sondermüll entsorgt werden, wird man das Basisteil 1 2 und den Deckel 14 vorzugsweise untrennbar miteinander verbinden, beispielsweise durch Verschweißen, insbesondere Ultraschallverschweißen, oder Verkleben, wie dies in der rechten Bildhälfte von Fig. 1 bei 30 angedeutet ist. Es ist jedoch auch möglich, das Basisteil 12 und den Deckel 14 miteinander zu verschrauben, wie dies in der linken Bildhälfte der Fig. 1 bei 32 dargestellt ist.
Nachzutragen ist ferner, daß auch die Zugangsstelle 20 vorzugsweise an der zylindrischen Umf angswandung 14a des Deckels angeordnet ist, um so
ein Stapeln der Zellkulturgefäße in einem Züchtungsschrank zu ermögli¬ chen.
In Fig. 7 ist eine Anordnung zur Abtrennung der expandierten Anti-Tumor- Zellen von dem unerwünschten Störhintergrund unspezifischer Zellen dargestellt. Hierzu ist ein erfindungsgemäßes Zellkulturgefäß über seine Zugangsstelle 24 mit einer Separationssäule 34 verbunden, an die sich nach einem Wegeventil 36 eine handelsübliche Zellkulturflasche 38 bzw. ein Auffangbehälter 40 für Flüssigabfälle anschließt. Der mit einer Schraub- kappe 34a versehene Zugangsstutzen 34b der Separationssäule 34 ist dabei derart bemessen, daß er die Membrane 24e der Zugangsstelle 24 erst dann zerstört, wenn die Schraubkappe 34a mit dem Gewinde 24c in Dichtungseingriff getreten ist. Entsprechendes gilt auch für die Anschlußstelle 42 der herkömmlichen Zellkulturflasche 38.
Der Separationsprozeß in der Separationssäule 34 ist im dargestellten Ausführungsbeispiel so ausgelegt, daß die Separationssäule 34 die markierten Anti-Tumor-Zellen in die Zellkulturflasche 38 passieren läßt und die nicht markierten Zellen des Störhintergrunds in der Separationssäule 34 zurückhält. Nach erfolgter Separation können die Anti-Tumor-Zellen in der Zellkulturflasche 38 weiter expandiert werden, bis die für ein Anti-Tumor- Transplantat erforderliche Anzahl von Anti-Tumor-Zellen erhalten worden ist. Selbstverständlich ist es auch möglich, ausgangsseitig der Separationssäule 34 anstelle der Kulturflasche 38 wiederum ein erfindungsgemäßes Zellkulturgefäß 10 anzuordnen.
Obgleich in Fig. 7 die Verbindungen zwischen dem Zellkultur-gefäß 10 und der Separationssäule, zwischen der Separations-säule und der Zellkulturflasche 38 bzw. dem Abfallbehälter 40 als starre Verbindungen dargestellt sind, versteht es sich, daß diese Verbindungen gewünschtenfalls auch flexible Verbindungen sein können, bspw. Verbindungsschläuche umfassen können. In diesem Fall kann dann beispielsweise an dem Zellkulturgefäß 10
eine Lasche 1 0b vorgesehen sein, um dieses an einem Haken 44 aufhängen zu können. Entsprechendes gilt selbstverständlich auch für die Separations¬ säule 34, die Zellkulturflasche 38 und den Abfallbehälter 40.
Nachzutragen ist noch, daß das erfindungsgeπ ,äße Zellkultur-gefäß gasper- meabel ausgebildet ist, um ein "Atmen" der Zellen zu ermöglichen. Diese Gaspermeabilität kann beispielsweise eine Eigenschaft des zur Fertigung des Deckels und/oder des Basisteils verwendeten Materials sein. Beispielsweise kann die Verschlußmembrane 24b gaspermeabel ausgebildet sein. Zusätzlich oder alternativ kann aber auch an dem Zellkulturgefäß ein handelsüblicher Sterilfilter angebracht sein.
Nachzutragen ist ferner, daß die Trennstege 1 2d (siehe Fig. 1 ) zwischen den einzelnen Züchtungsvertiefungen 1 6 vorzugsweise schmal bemessen sind. Dies hat zum einen den Vorteil, daß das Verhältnis des zur Verfügung stehenden Züchtungsvolumens zum Gesamtvolumen des erfindungsgemäßen Züchtungsgefäßes einen hohen Wert aufweist, das Volumen des Züchtungsgefäßes also effizient ausgenutzt wird. Zum anderen lagert sich hierdurch nach dem Schütteln des Züchtungsgefäßes zur Verteilung der Anti-Tumor-Zellen von der initialen Züchtungsvertiefung auf sämtliche Züchtungsvertiefungen nur eine vernachlässigbar geringe Anzahl von Zellen auf diesen Trennstegen und nicht in einer der Züchtungsvertiefungen ab. Ist die Konizität der Wandungen der Züchtungsvertiefungen bis in den Bereich der Trennstege fortgesetzt bzw. verlaufen die Trennstege relativ zur Stütz- ebene E mit einer gewissen Neigung, wie dies in Figur 3 bei 1 2d' angedeutet ist, so kann die Ablagerung von Zellen auf den Trennstegen vermindert, wenn nicht gar vollständig verhindert werden.