KR20090035511A

KR20090035511A - 배양 용기 중의 용존 산소를 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20090035511A
Application number: KR1020097000211A
Authority: KR
Inventors: 미쪼우 후이
Original assignee: 앰프로틴 코포레이션
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2009-04-09
Also published as: EP2226809B1; EP2226809A1; US20080276048A1; WO2007015722A3; WO2007015722A2; CA2624408A1; AU2006276308A1; US7426613B2; EP1949384A4; US20060285395A1; EP1949384A2; AU2006276308B2; US7844786B2

Abstract

기존에 발견된 유효한 생물반응기 시스템의 연구에 기초하여, 배지 용존 산소를 증가시키는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 최적 혼합의 추가와 함께 유효한 생물반응기 설계 및 원형 구조용의 이론적인 기반을 형성한다.

현탁 배양, 용존 산소, 배양 용기, 볼형상 용기

Description

배양 용기 중의 용존 산소를 증가시키는 방법{A METHOD TO INCREASE DISSOLVED OXYGEN IN A CULTURE VESSEL}

관련 출원

본 출원은 특허 출원 제PCT/US06/22312호(발명의 명칭: 현탁 배양 용기, 출원일: 2006년 6월 8일)의 계속출원이다.

발명의 기술분야

본 발명은 유효한 생물반응기(bioreactor)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

특허 출원 제PCT/US06/22312호(발명의 명칭: 현탁 배양 용기)에 기재된 본 발명자의 이전의 발명에 있어서, 본 발명자는 포유류 세포 현탁 배양용의 궤도형 진탕기 플랫폼(orbital shaker platform) 상에 역원뿔대(inversed frusto-conical) 형상 바닥을 구비한 와이드-바디(wide-body) 배양 용기를 기술한 바 있다. 경이롭게도, 본 시스템은 전통적인 생물반응기 및 평평한 바닥 진탕기 병(flat bottom shaker bottle)보다 상당히 양호하였다. 본 발명자는 보다 적은 유압-기계식 응력으로 용기의 벽을 용이하게 오르는 배지를 제조하는 이 시스템을 기술한 바 있다. 이 시스템은 통기성이 크고 혼합성이 양호한 확대된 표면용의 넓은 배지 박층을 형성하였다.

흥미롭게도, 본 발명자는 이 진탕기 기저의 원뿔대 바닥 용기 시스템의 작용의 정확한 기전은 알지 못했다. 본 발명에 있어서, 본 발명자는 그 작용의 기전을 발견해내었다. 이 작용 기전, 즉, 배지 중의 용존 산소 레벨을 증가시키는 방법에 의거해서, 본 발명자는 몇몇 유형의 포유류 세포 배양 생물반응기를 설계하고 시험하였다.

본 발명은 역원뿔대 또는 역절두체(inverted frustum) 형상 바닥을 가진 전술한 현탁 배양 용기(국제 특허 출원 제PCT/US06/22312호)의 작용 기전을 기술한다. 본 발명은, 배지 중의 용존 산소(DO: dissolved oxygen)를 증가시키는 방법을 개시하고, 이것은 효과적인 포유류 세포 배양 생물반응기를 설계하고 제조하는 기반을 형성한다.

도 1은 포유류 세포 현탁 배양용의 역원뿔대 형상 바닥을 지닌 와이드-바디 용기를 나타낸 도면;

도 2a는 플루로메트릭스(Flurometrix) DO/pH 패치 센서 검출 기술을 예시한 도면;

도 2b는 플루로메트릭스 DO/pH 패치 센서 검출 시스템을 나타낸 도면;

도 3은 진탕기 플랫폼 상에 역원뿔대 형상 바닥을 지닌 150㎖ 작업 체적(work volume)의 배양 용기를 예시한 도면;

도 4는 DO 레벨을 증가시키기 위해 정적 상태에서 배지를 버블링시키기 위한 에어펌프의 이용을 예시한 도면;

도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d는 즉석의 배지 표면 특성을 포착한 니콘 디지털 카메라의 사진으로, 일순간에, 모든 사진이 용기 벽의 한쪽상에 대부분 표제의 배지 표면 레벨을 보였고, 이 배지 동작의 특성은 공기 노출된 평활한 용기 표면을 반복적으로 "스위핑"(sweeping) 혹은 세정함으로써 배지 중의 DO를 증가시키는 것을 나타냄;

도 6a 및 도 6b는 표제의 플라스틱제 튜브의 롤링 동작을 이용해서, 튜브 안쪽의 배지가 공기 노출된 원활한 용기 벽면을 반복적으로 "스위핑"하거나 세정하는 것을 예시한 도면으로, 이 동작은 배지 중의 DO를 신속하게 100%까지 증가시킴;

도 7은 역원뿔대 형상 바닥(직경 3㎝)을 구비한 플라스틱제 튜브를 이용해서, 현탁 배양된 CHOK 세포가 일정한 DO 100%를 가지면서 조정가능한 진탕기 플랫폼 상에서 배양 4일째에 2.2 pcv(packed cell volume)%에 용이하게 도달한 것을 예시한 도면으로, 이것은 세포 클론 로버스트성 스크리닝(cell clone robustness screening)을 위한 유효한 미니-생물반응기 시스템을 형성함;

도 8a는 배지 혼합을 위한 전후진 운동을 구비한 볼형상 셀프-롤링(self-rolling) 생물반응기를 예시한 도면;

도 8b는 배지 혼합을 위한 궤도형 진탕기 플랫폼 상의 볼형상 셀프-롤링 생물반응기를 예시한 도면;

도 8c는 안쪽으로 돌출된 궤도 레일을 구비한 콘형상 셀프-롤링 생물반응기 용기를 예시한 도면;

도 9a는 플라스틱제 배양백(plastic cell culture bag)용의 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 10ℓ 용기 기저부(base)를 예시한 도면;

도 9b는 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 10ℓ 용기 기저부를 예시한 도면;

도 10a는 현행(current) 플루로메트릭스 세포 클론 로버스트성 스크리닝 및 프로세스 최적화 고처리량 미니-생물반응기 시스템을 예시한 도면;

도 10b는 세포주 로버스트성 스크리닝용의 원뿔대 형상 바닥을 지닌 진탕기 기저의 다수의 웰을 예시한 도면.

본 발명은, 정교한 제어탑, 그리고 관련된 DO 및 pH 프로브를 이용하지 않고도, 현탁에 적합한 포유류 세포가 평탄한 바닥 진탕기 병뿐만 아니라 고전적인 아플리콘(Applikon) 생물반응기에 비해서 소정의 이동 길이를 가진 진탕기 플랫폼 상에 역원뿔대 또는 역절두체 형상 바닥을 구비한 배양 용기(도 1)에서 상당히 양호하게 성장한다고 하는 기존의 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다.

그의 작용 기전을 연구하기 위해, 본 발명자는 DO 센서, pH 센서 및 그들의 검출 시스템(www.flurometrix.com)(도 2a 및 도 2b)을 이용하였다. 또, 본 발명자는 원뿔대 형상 바닥 용기 내에서 진탕 운동 동안 상세한 배지 운동을 포착해서 연구하기 위해 디지털 카메라(니콘사 제품)도 이용하였다.

먼저, 본 발명자는 역원뿔 형상 바닥을 지닌 150 ㎖ 작업 체적 용기 내에서 배지의 DO를 측정하였다. 또, 본 발명자는 DO 레벨이 쉽게 100%에 도달한 것을 확인하였다(표 1). 다음에, 본 발명자는 정적 상태에서 동일 용기 내에서 배지를 버 블링시키기 위해 에어 펌프를 이용하였다(도 4). 놀랍게도, 적당한 시간에 100%에 도달하는 것이 불가능하였다(표 2). 본 발명자는 3ℓ 아플리콘 생물반응기 중에서 DO 프로브를 검정하기 위해 공기 버블링 방법을 통상적으로 이용하였고, DO가 100%에 도달한 것으로 상정하였으므로, 이 현상은 매우 놀라웠다. 따라서, 이 현상 배후의 작용 기전이 있음에 틀림없다.

시간(분)	0	30	30	30
DO%	45	75	92	100
* 역원뿔대 형상 바닥을 지닌 150㎖ 작업 체적 배양 용기 내에 신선한 배지를 120rpm으로 진탕시키면서 첨가하였다(도 3). 매 30분마다 DO를 측정하였다.

시간(분)	0	30	30	30
DO%	45	52	55	75
* 역원뿔대 형상 바닥을 지닌 150㎖ 작업 체적 배양 용기 내에 신선한 배지를 진탕없이 첨가하였다(도 4). 매 30분마다 DO를 측정하였다.

그 해답을 추구함에 있어서, 본 발명자는 진탕 동안 역원뿔대 형상 바닥을 지닌 배양 용기 내에서 배지의 순간 운동을 포착하기 위해 고속 카메라를 이용하였다(도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d)(도 3). 사진은 모두, 일순간에, 배지가 배양 용기의 한쪽 상에 대부분 있는 한편 다른 쪽의 대부분은 공기 접촉에 노출된 것을 명백하게 보이고 있었다. 상기 역원뿔대 형상 바닥으로 인해, 진탕 운동은 배지가 용이하게 움직여 용기 벽의 한쪽상에 오르게 하였다. 이것은 공기 노출된 용기 벽을 반복적으로 "스위핑" 혹은 세정하는 배지 흐름(medium current)의 원운동을 형성한다. 본 발명자는 이 원운동 및 그의 반복적인 "스위핑"이 배지 중의 DO를 증가시킨 것으로 가정하였다.

용존 산소(DO)는 물 혹은 배지 중에 혼합된 산소의 미시적인 기포 중에 발견되고 물분자들 사이에 생긴다. 이상의 내용의 본 발명자의 사례에 있어서, 아주 작은 산소 기포가 평활한 유리 혹은 플라스틱 표면 상에 흡수되고 이에 따라 공기에 노출되는 순간의 기간 동안 산소 기포의 미시적인 층을 형성하는 것이 가능해진다. 본 발명자는 이어서 평활한 표면 상에 즉시 형성된 공기 기포가 너무 작아 이것이 물 속의 DO의 미시적인 기포 크기를 닮은 것으로 가정하였다. 다음에, 이 미시적인 기포층은 배지 흐름의 순환에 의해 "스위핑" 혹은 세정 제거되므로, 물 속에 산소를 용이하게 용해시킨다. 이 순환 운동은 원뿔대 형상 바닥 및 진탕 운동으로 인해 재차 일어나고, 이에 따라, 살포를 비롯한 배지 속으로의 직접적인 공기 버블링보다 더욱 효과적으로 DO 레벨을 증가시킨다.

이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자는 4㎖ 배지를 구비한 12㎖ 플라스틱제 튜브(NUNC) 및 60 rpm 속도의 롤러 드럼을 이용하였다(도 6a 및 도 6b). 10분의 롤링 직후, 튜브 속의 배지 샘플은 모두 100% DO에 도달하였다. 이 연구는, 소정 속도 혹은 힘으로 공기 노출된 평활한 표면과 반복적으로 스위핑 혹은 접촉하는 배지 혹은 배지 흐름이 배지 DO를 놀랍게도 효과적으로 증가시킨 것을 나타내었다.

다음에, 본 발명자는 60 및 100 rpm의 속도로 4일간 롤러 드럼 상에서 튜브 내에 CHOK-현탁 세포를 배양시켰다. 예상된 바와 같이, DO는 이들 4일의 배양 동안 모든 경우에 있어서 100%에 도달하였다. 그러나, 세포는 전혀 성장하지 않았다. 따라서, 본 발명자는, 최적의 세포 현탁 배양을 위해서는 충분한 배지 DO 이외에 효과적인 혼합에 대한 필요가 있어야만 한다고 결론짓게 되었다. 다음에, 본 발명자는 조정가능한 진탕기 플랫폼 상에 역원뿔대 형상 바닥을 지닌 50㎖ 원심 튜브(NUNC)에서 세포를 4일 동안 배양하였다(도 7). 세포는 모두 성장해서 2.2 pcv%에 용이하게 도달하였다. 이 결과는 최적의 세포 현탁 배양을 위해서 충분한 DO 이외에 혼합 운동이 요구되는 것을 나타내었다.

상기 발견 사항에 의거해서, 본 발명자는 원형(prototype) 구조용의 수개의 유형의 생물반응기를 설계하였다. 각 유형에 대해서, 본 발명자는, 공기 노출된 평활한 표면을 스위핑하거나 접촉시키는 배지 흐름을 반복적으로 이용해서 배지 중의 DO를 증가시키는 방법을, 고려되는 충분한 배지 혼합 운동과 함께 강제로 병합하였다(도 8a, 도 8b 및 도 8c). 이에 대한 상세는 실시예 4에 더욱 기재되어 있다.

본 발명자는 또한 혈청-무첨가 현탁 배지 중에서 TNFR2-Fc-IL-lra를 발현하는 CHOK-현탁 세포주를 이용함으로써 배취-배양 프로세스(batch-culture process)의 상세를 조사하였다. 이것은 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 배양 용기가 최적 DO 레벨, 세포 밀도 및 생성물 수율을 가지는 이상적인 것임을 명백히 나타내었다(표 3). 이에 대한 상세는 실시예 1에 또한 기재되어 있다.

실시예 1

역원뿔대 형상 바닥을 구비한 150㎖ 작업 체적 용기를 연구하는 배취 배양

TNFR2-Fc-IL-lra 약물 후보를 발현하는 CHO 생산 세포주의 배취 배양을 위해 소규모 150㎖ 작업 체적 진탕기 용기를 이용해서, 혈청-무첨가 배지 B001에서 8일간 배양을 행하였다. DO는 플루로메트릭스 DO 패치 센서 검출 시스템을 이용해서 매일 측정하였다(도 2a 및 도 2b). 플루로메트릭스 검출 시스템을 이용한 이외에, pH는 또한 휴대용 pH 미터에 의해 검출하였다(도 2b). 당은 원-터치 당계(one-touch glucose meter)에 의해 측정하였다(도 2b). 표 3은 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 배양 용기가 최적 DO 레벨, 세포 밀도 및 생성물의 수율을 가지는 이상적인 것임을 명백히 나타내고 있다.

일수	1	2	3	4	5	6	7	8
DO(%)	100	100	100	100	100	100	100	100
pH	7.5	7.4	7.0	6.8	6.6	6.6	6.7	6.8
당(g/ℓ)	1.5	1.5	1.2	0.8	0.5	0.3	0.2	0.1
온도	37	37	37	34	34	34	34	34
혼합 속도(rpm)	120	120	120	120	120	120	120	120
발현 역가(㎎/ℓ)	22	55	115	220	415	530	705	750
세포 밀도(pcv%)	0.3%	0.7%	1.5%	2.8%	3.2%	3.6%	3.2%	2.8%
* 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 150㎖ 작업 체적 용기 내의 배치 배양 프로세스에서의 DO, pH, 당, 혼합 속도 및 온도를 동시에 모니터링하였다.

실시예 2

역원뿔대 형상 바닥을 구비한 생물반응기 용기 기저부 상의 1회용 플라스틱제 세표 배양백의 제조

연질 플라스틱제 백 및 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 생물반응기 용기 기저부(도 9a 및 도 9b)를 설계하여 구성하였다. 이들 기저부 및 백은 조정가능한 이동 길이를 가진 진탕기 플랫폼에 이용하도록 설계되어 있다. 조정가능한 진탕기 플랫폼과 함께 상기 설계된 원뿔대 형상 바닥은, 배지 중의 DO 레벨을 증가시키고 높은 세포 밀도 배양 조건에서 O₂의 높은 레벨 이용의 과제에 부응하도록, 가능한 한 높으면서 가능한 한 용이하게(최소 진탕 에너지의 이용) 배지를 오르도록 의도되어 있었다. 3, 10, 20, 40, 100, 500 및 1000ℓ 크기의 용기 기저부 및 플라스틱제 백은 원형 구조 및 시험을 위해 설계되어 있었다. 본 발명의 목적은 연구 개발(R&D) 및 산업상 이용을 위해 비용상 효율적이면서 전단력이 적은 1회용의 포유류 배양 생물반응기를 구성하는 데 있다.

실시예 3

고처리량 단백질 발현 역가 스크리닝 후의 생산 클론 로버스트성 스크리닝을 위한 역원뿔대 형상 바닥을 구비한 진탕기 기저의 다수의 웰 플레이트의 설계

생산 세포주의 로버스트성은 주어진 단백질 약물의 궁극적인 발현 수율 및 규모 증대 프로세스의 안정성을 위해 중요하다. 수천개의 세포 클론으로부터 스크리닝된 고발현 세포주 중에서, 이들 중 몇몇은 산업적인 생산 세포 표준에 부응하는 로버스트 세포주이다. 선택된 로버스트 세포주는 보다 긴 시간 동안 높은 밀도로 성장될 수 있고, 따라서, 원래의 스크리닝된 세포 클론 발현 역가보다 10배 미만으로 높은 발현 역가를 발생할 수 있다.

세포주 로버스트성 스크리닝 및 프로세스 최적화용의 현행 미니-생물반응기 시스템(www.flurometrix.com)(도 10a)은 높은 세포 밀도의 세포 성장을 위해 최적화되어 있지 않고, 높은 밀도의 세포 모집단을 뒷받침하기 위한 최적 DO 레벨을 가지지 않는다. 따라서, 이것은 로버스트 세포 클론의 스크리닝을 갖지 못한다. 충분한 배지 DO없이, 높은 세포 밀도로 유가식(fed-batch) 프로세스를 최적화하는 방법은 없다.

진탕기 플랫폼 상의 설계된 다수의 웰 플레이트(도 10b)는 높은 세포 밀도 성장을 뒷받침하도록 배양 웰의 원뿔대 형상 바닥 및 진탕 운동으로 인해 배지 중에 충분한 DO를 제공할 것이고, 이에 따라, 최고 밀도로 성장시키도록 부여된 세포주의 궁극적인 용량을 스크리닝할 수 있고 또한 비로버스트(non-robust) 세포 클론으로부터 구별될 수 있다. 이 시스템은 조작하기 용이하고 또한 비용상 매우 효율적이다.

실시예 4

효과적인 혼합 운동과 배합된 배지 중의 DO를 증가시키는 방법에 기초한 효과적인 생물반응기의 설계

상기에서 행한 롤러 드럼 실험(도 6a 및 도 6b)에 의거해서, 본 발명자는 포유류 세포 배지 중에서 DO를 증가시키는 방법을 발견하였다. 다음에, 본 발명자는 롤링 생물반응기를 설계하였다(도 8a, 도 8b 및 도 8c). 도 8a는 공기 노출된 용기 내면을 반복적으로 세정하는 것에 의한 볼형상 셀프-롤링 생물반응기 용기를 도시하고 있다. 이 롤링 운동은 높은 세포 밀도 성장을 뒷받침하도록 배지 중의 DO를 증가시킨다. 바닥 레벨에서의 전후진 운동은 롤링 운동 동안 배지를 충분히 혼합하는 한편(도 8a), 이들은 함께 최적의 세포 현탁 배양을 뒷받침한다.

도 8b는 볼형상 셀프-롤링 생물반응기 용기를 도시하고 있다. 이 롤링 운동은 높은 세포 밀도 성장을 뒷받침하도록 공기 노출된 용기 내면을 반복적으로 세정함으로써 배지 중의 DO를 증가시킨다. 바닥 레벨에서의 궤도형 진탕기 플랫폼은 롤링 운동 동안 배지를 충분히 혼합시키는 한편, 이들은 함께 최적의 세포 현탁 배양을 뒷받침한다.

도 8c는 콘형상 셀프-롤링 생물반응기 용기를 도시하고 있다. 이 롤링 운동은 높은 세포 밀도 성장을 뒷받침하도록 공기 노출된 용기 내면을 반복적으로 세정함으로써 배지 중의 DO를 증가시킨다. 안쪽으로 돌출된 궤도 레일은 배지를 상부 일단부까지 상승 이동시키는 반면, 롤링하면서 하단부까지 후퇴시킨다. 이 추가의 운동은 롤링 운동 동안 배지 혼합을 돕는다. 이들은 함께 최적의 세포 현탁 배양을 뒷받침한다.

Claims

산소 혹은 공기 버블링(bubbling)을 이용하는 일 없이 포유류 세포의 현탁 배양용의 배지 중에서 용존 산소를 증가시키는 방법에 있어서, 상기 세포의 배양물은 평활한 벽을 지닌 배양 용기 내에 수용되어 있는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 배양된 세포에 대한 충분한 전단력의 이용을 포함하지 않는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 배양 용기벽의 공기 노출된 평활한 표면을 반복적으로 가로지르는 스위핑(sweeping) 동작에 있어서의 배지의 운동을 포함하는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 운동은 진탕, 롤링, 요동, 전후진 운동 및 유동의 어느 하나를 포함하는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 표면은 유리를 포함하는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 표면은 플라스틱을 포함하는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 표면은 금속을 포함하는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 현탁 배양에서의 최적의 세포 증식을 위해 추가의 배지 혼합 단계를 포함하는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.
추가의 전후진 운동을 구비한 셀프-롤링(self-rolling) 볼형상 용기인, 포유류 세포의 현탁 배양용 용기.
추가의 궤도형 진탕 운동(orbital shaking motion)을 구비한 셀프 롤링 볼형상 용기인 포유류 세포의 현탁 배양용 용기.
배지의 추가의 운동용의 안쪽으로 돌출된 오비탈 레일을 구비한 셀포-롤링 콘형상 용기인 포유류 세포의 현탁 배양용 용기.
제8항에 있어서, 제9항, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항의 용기 내에서 수행되는 것인, 배지 중의 용존 산소를 증가시키는 방법.