MX2008015671A

MX2008015671A - Un metodo para incrementar el oxigeno disuelto en un recipiente de cultivo.

Info

Publication number: MX2008015671A
Application number: MX2008015671A
Authority: MX
Inventors: Mizhou Hui
Original assignee: Amprotein Corp
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2012-09-28
Also published as: ZA200810776B; EP2021459A4; BRPI0621678A2; CA2654577A1; JP2009539373A; CN101506349B; DK2021459T3; EP2021459B8; IL195568A0; ES2663202T3; WO2006138143A1; EP2021459B1; AU2006344392A1; RU2008152326A; EP2021459A1; CN101506349A

Abstract

Basado en el estudio de un sistema de biorreactor efectivo descubierto previo, se divulga un método para incrementar el oxígeno disuelto del medio de cultivo. Este método junto con la adición de un mezclado óptimo forma un fundamento teórico para el diseño de biorreactor efectivo y la construcción de prototipo.

Description

UN METODO PARA INCREMENTAR EL OXIGENO DISUELTO EN UN RECIPIENTE DE CULTIVO SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es la continuación de la solicitud de patente PCT/US06/22312 intitulada "recipientes de cultivo en suspensión", presentada el 8 de Junio del 2006.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un método para hacer biorreactores efectivos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el descubrimiento previo de los inventores descrito en una solicitud de patente PCT/US06/22312 intitulada "recipientes de cultivo en suspensión", los inventores han descrito un recipiente de cultivo de cuerpo amplio con un fondo frustocrónico invertido sobre plataforma agitadora orbital para el cultivo de células mamíferas en suspensión. De manera sorprendente, este sistema fue significativamente mejor que el biorreactor clásico y las botellas agitadoras de fondo plano. Los inventores han descrito este sistema haciendo el medio de cultivo ascendente hacia arriba sobre la pared del recipiente fácilmente con menos esfuerzo hidrodinámico. Este sistema creó una capa de medio de cultivo delgada amplia para la superficie extendida, aireación más grande y mejor mezclado.

De manera interesante, los inventores no supieron el mecanismo de acción exacto de este sistema de recipiente de fondo frustocrónico basado en agitador. En esta invención, los inventores han descubierto el mecanismo de acción. Basado sobre el mecanismo de acción, específicamente un método para incrementar el nivel de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, los inventores han diseñado y probado varios tipos de biorreactores de cultivo de células mamíferas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención describe el mecanismo de acción de los recipientes de cultivo en suspensión previamente descritos con un fondo frustocrónico inverso o de tronco invertido (solicitud de patente PCT/US06/22312 ) . Esta invención divulga un método para incrementar el oxígeno disuelto (DO) en el medio de cultivo, que forma un fundamento para diseñar y hacer biorreactores efectivos de cultivo de células mamíferas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 Un recipiente de cuerpo amplio con fondo frustocrónico invertido para el cultivo de células mamíferas en suspensión.

Figura 2a Ilustración de la tecnología de detección de sensor de conexión de DO/pH F'lurometrix.

Figura 2b Sistema de detección de sensor de conexión de DO/pH Fluorometrix .

Figura 3 Recipiente de cultivo de volumen de trabajo de 150 mi con fondo frustocrónico invertido sobre plataforma agitadora .

Figura 4 Uso de bomba de aire para burbujear el medio de cultivo en estado estático para incrementar el nivel de DO. Figuras 5a, b, c, d, e Características instantáneas de la superficie del medio capturadas con cámara digital Nikon. En un momento instantáneo, todas las fotografías mostraron nivel de superficie del medio titulado principalmente sobre un lado de la pared del recipiente. Esta característica del movimiento del medio incrementa el DO en el medio de cultivo al repetitivamente "barrer" o lavar la superficie del recipiente lisa expuesta al aire.

Figuras 6a, b Utilizando el movimiento de rodamiento de tubos de plástico titulados, el medio de cultivo dentro del tubo repetitivamente "barre" o lava la superficie de la pared de recipiente lisa expuesta al aire. Este movimiento incrementa el DO en el medio rápidamente a 100%.

Figura 7 Uso de tubos de plástico con fondo frustocrónico invertido (diámetro 3 cm) , las células CHOK cultivadas en suspensión fácilmente alcanzaron 2.2% pcv en 4 días de cultivo sobre la plataforma agitadora ajustable con DO constante de 100%. Esto creó un sistema de mini-biorreactor efectivo para la clasificación robusta de clon celular.

Figura 8a Un biorreactor de auto-rodamiento en forma de bola con movimiento hacia atrás y hacia adelante para el mezclado del medio de cultivo.

Figura 8b Un biorreactor de auto-rodamiento en forma de bola sobre plataforma agitadora orbital para el mezclado del medio de cultivo.

Figura 8c Un recipiente de biorreactor de auto-rodamiento en forma de cono con carriles orbitales proyectados interiores. Figura 9a Base de recipiente de 10 litros con fondo frustocrónico invertido para bolsa de cultivo de plástico. Figura 9b Base de recipiente de 10 litros con fondo frustocrónico invertido.

Figura 10a Clasificación robusta de clon celular con Flurometrix actual y sistema de mini-biorreactor de alto rendimiento con optimización del proceso.

Figura 10b Múltiples cavidades basadas en agitador con fondo frustocrónico para la clasificación robusta de lineas de células .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención está basada, por lo menos en parte, sobre el descubrimiento previo de que, sin la utilización de torre de control sofisticada y sondas de DO y pH relacionadas, las células mamiferas adaptadas en suspensión crecen significativamente mejor en recipientes de cultivo con un fondo frustocrónico inverso o de tronco invertido sobre una plataforma agitadora con cierta longitud de movimiento que en el biorreactor Applikon clásico asi como botellas agitadoras de fondo plano (Figura 1).

Con el fin de estudiar su mecanismo de acción, los inventores emplearon el sensor de DO, el sensor de pH y su sistema de detección (www.flurometrix.com) (Figuras 2a, b) . Los inventores también emplearon una cámara digital (Nikon) para capturar y estudiar el movimiento del medio de cultivo detallado durante el movimiento de agitación en los recipientes de fondo frustocrónico .

Primero, los inventores midieron el DO del medio de cultivo en el recipiente de volumen de trabajo de 150 mi con fondo cónico invertido (Figura 3). Los inventores encontraron que el nivel de DO fácilmente alcanzó 100% (Tabla 1). Los inventores luego utilizaron la bomba de aire para burbujear el medio de cultivo en un mismo recipiente en estado estático (Figura 4). Sorprendentemente esto no fue capaz de alcanzar 100% en un periodo de tiempo razonable (Tabla 2) . Los inventores estuvieron muy sorprendidos por este fenómeno puesto que los inventores utilizaron rutinariamente el método de burbujeo de aire para calibrar la sonda de DO en el biorreactor Applikon de 3 litros y asumieron que el DO alcanzó 100%. Debe haber un mecanismo de acción detrás de este fenómeno.

Tabla 1 Medio de cultivo fresco se adicionó en el recipiente de cultivo de volumen de trabajo de 150ml con fondo frustocónico invertido con agitación a 120 rpm (Figura 3).

Cada 30 minutos, se midió el DO.

Tabla 2 Medio de cultivo fresco se adicionó en el recipiente de cultivo de volumen de trabajo de 150ml con fondo frustocrónico invertido sin agitación. El burbujeo con bomba de aire se utilizó para adicionar DO en el medio (Figura Cada 30 minutos, se midió el DO.

En busca de la respuesta, los inventores utilizaron una cámara de alta velocidad para capturar el movimiento instantáneo del medio de cultivo en los recipientes de cultivo con el fondo frustocrónico invertido durante la agitación (Figuras 5a, b, c, d) (Figura 3). Todas las fotografías claramente mostraron que en un momento instantáneo, el medio de cultivo está principalmente sobre un lado de los recipientes de cultivo mientras que la mayor parte del otro lado está expuesta al contacto de aire. Debido al fondo cónico invertido, el movimiento de agitación fácilmente mueve el medio de cultivo ascendiendo sobre un lado de la pared del recipiente. Esto crea un movimiento circular de la corriente del medio, repetidamente "barriendo" o lavando la pared del recipiente expuesta al aire. Los inventores plantearon como hipótesis que este movimiento circular y su "barrido respectivo" incrementó el DO en el medio de cultivo.

El oxigeno disuelto (DO) se encuentra en burbujas microscópicas de oxigeno que son mezcladas en el agua o el medio de cultivo y ocurre entre las moléculas de agua. En el caso de los inventores de lo anterior, es posible que las burbujas de oxigeno diminutas se absorbieran sobre la superficie de vidrio o de plástico lisa y asi formaran una capa microscópica de burbujas de oxigeno durante el periodo de instantáneo de exposición al aire. Los inventores luego plantearon como hipótesis que la capa de burbujas de aire formadas instantáneas sobre la superficie lisa son tan diminutas que se asemeja al tamaño de burbuja microscópico del DO en el agua. Esta capa de burbujas microscópicas luego es "barrida" o lavada al circular la corriente del medio, haciendo de esta manera el oxigeno disuelto en el agua fácilmente. Este movimiento circular ocurre una y otra vez debido al fondo frustocrónico y el movimiento de agitación, incrementando de esta manera el nivel de DO más eficientemente que el burbujeo de aire directo en el medio incluyendo aspersión.

Para probar esta hipótesis, los inventores han empleado tubos de plástico de 12 mi (NUNC) con 4 mi de medio de cultivo y el tambor de rodillos en velocidad de 50 rpm (Figuras 6a, b) . En poco tiempo después de 10 minutos del rodamiento, todas las muestras del medio en los tubos han alcanzado 100% de DO. Este estudio mostró que el medio de cultivo o corriente del medio gue repetidamente barre o hace contacto con al superficie lisa expuesta al aire con cierta velocidad o fuerza incrementó el DO del medio de cultivo sorprendentemente efectivo.

Los inventores luego cultivaron células de suspensión CHOK en los tubos sobre el tambor de rodillos a velocidad de 60 y 100 rpm durante 4 días. Como es esperado, el DO ha alcanzado 100% en todos los casos durante estos 4 días de cultivo. Sin embargo, las células no crecieron en todo. Los inventores asi concluyeron que debe ser necesario el mezclado efectivo además del DO del medio suficiente para el cultivo de células en suspensión óptimo. Los inventores luego cultivaron las células en tubos de centrifuga de 50 mi (NUNC) con fondo f ustocrónico invertido sobre una plataforma agitadora ajustable durante 4 días (Figura 7). Todas las células crecieron y fácilmente alcanzaron 2.2% de volumen de célula empacado (pcv) . Este resultado indicó que el movimiento de mezclado es requerido además de suficiente DO para el cultivo de células en suspensión óptimo.

Basado en los descubrimientos anteriores, los inventores han diseñado varios tipos de biorreactores para construcción de prototipo. Para cada tipo, los inventores han incorporado el método para incrementar en DO en el medio de cultivo al utilizar repetidamente la corriente del medio para barrer o hacer contacto con la superficie lisa expuesta al aire con fuerza junto con el movimiento de mezclado del medio suficiente en consideración (Figuras 8a, b, c) . Los detalles además se describen en el Ejemplo 4.

Los inventores han examinado los detalles del proceso de cultivo por lotes al utilizar una linea de células en suspensión de CHOK que expresa TNFR2-Fc-IL-lra en un medio de cultivo en suspensión libre de suero. Claramente se mostró que los recipientes de cultivo con fondo frustocrónico invertido fueron ideales con nivel de DO óptimo, densidad de células y rendimiento del producto (Tabla 3) . Los detalles también se describen en el Ejemplo 1.

Ejemplo 1 Cultivo por lotes que estudia el recipiente de volumen de trabajo de 150ml con fondo frustocrónico invertido El uso de recipientes agitadores de volumen de trabajo de 150ml de escala pequeña para el cultivo por lotes de la linea de células de producción CHO que expresan candidatos de fármaco TNFR2-Fc-IL-lra se condujo en el medio de cultivo libre de suero B001 durante 8 días. El DO se midió cada día al utilizar el sistema de detección de sensor de conexión de DO Flurometrix (Figuras 2a, b) . Además del uso del sistema de detección Flurometrix, el pH también se detectó por un medidor de pH portable (Figura 2b). La glucosa se midió mediante un medidor de glucosa de un tocamiento (Figura 2b) . La tabla 3 claramente mostró que los recipientes de cultivo con fondo frustocrónico invertido fueron ideales con nivel de DO óptimo, densidad de células, y rendimiento del producto.

Tabla 3 Monitoreo de manera simultánea de DO, pH, glucosa. Velocidad de mezclado y temperatura en un proceso de cultivo por lotes en recipiente de volumen de trabajo de 150ml con fondo frustocrónico invertido.

I 1 Ejemplo 2 Elaboración de bolsas de plástico de cultivo de células de un solo uso sobre bases de recipiente de biorreactor con fondo frustocrónico invertido Bases de recipiente de biorreactor con fondo frustocrónico invertido y bolsas de plástico suaves (Figura 9a, b) se diseñaron y se construyeron. Estas bases y bolsas se diseñaron para el uso en plataformas agitadoras con longitud de movimiento ajustable. El fondo frustocrónico diseñado junto con la plataforma agitadora ajustable se propusieron para hacer al medio de cultivo ascender tan alto como sea posible y tan fácil como sea posible (uso de energía de agitación mínima) para incrementar el nivel de DO en el medio y cumplir con el reto de uso de alto nivel de 02 en la condición de cultivo de alta densidad de células. Bases de recipiente de tamaño de 3, 10, 20, 40, 100, 500 y 1000 litros y bolsas de plástico se han diseñado para la construcción de prototipo y la prueba. El objetivo de los inventores es construir biorreactores de cultivo mamífero de un solo uso, de menos fuerza cortante, efectivos en costo para R&D y usos industriales .

Ejemplo 3 Diseño de la placa de múltiples cavidades basada en agitador con fondo frustocónico invertido para la clasificación robusta de clones de producción después de la clasificación de titulo de expresión de proteína de alto rendimiento.

La robustez de una línea de células de producción es importante para la estabilidad del proceso de escalación y producir la expresión final de un fármaco de proteína dado. Entre las líneas de células de alta expresión clasificadas de miles de clones celulares, algunas de estas son líneas de células robustas que cumplen con el estándar de célula de producción industrial. Las líneas de células robustas seleccionadas son capaces de crecer en alta densidad por tiempos más largos y así generar >10 veces de título de expresión más alto que el título de expresión del clon celular clasificado original.

El sistema de mini-biorreactor actual (www . flurometrix . com) para la clasificación robusta de líneas de células y la optimización del proceso (Figura 10a) no es optimizado para el crecimiento celular de alta densidad de células y no tiene nivel de DO óptimo para soportar la población de células de alta densidad. Así no tiene clasificación de clones celulares robustos. Sin suficiente DO del medio, no hay manera de optimizar el proceso por lotes de alimentación en alta densidad de células.

La placa de múltiples cavidades diseñada sobre plataforma agitadora (Figura 10b) proporcionará suficiente DO en el medio debido al movimiento de agitación y el fondo frustocrónico de las cavidades de cultivo para soportar el crecimiento de alta densidad de células, de esta manera siendo capaz de clasificar una capacidad final de la linea de células dada para crecer en densidad más alta y ser distinguida de los clones celulares no robustos. Este sistema es fácil de manejar y además muy efectivo en costo.

Ejemplo 4 Diseño de biorreactores efectivos basados en el método para incrementar el DO en el medio de cultivo combinado con el movimiento de mezclado efectivo.

Basado en los experimentos de tambor de rodillos conducidos en lo anterior (Figuras 6a, b) , los inventores han descubierto en método para incrementar el DO en el medio de cultivo de células mamiferas. Los inventores luego han diseñado biorreactores de rodamiento (Figuras 8a, b, c) . La Figura 8a muestra un recipiente de biorreactor de auto-rodamiento en forma de bola al lavar repetitivamente la superficie interna del recipiente expuesta al aire. Este movimiento de rodamiento incrementa el DO en el medio de cultivo para soportar el crecimiento de alta densidad de células. Mientras que un movimiento hacia atrás y hacia delante a nivel del suelo hace al medio de cultivo bien mezclado durante el movimiento de rodamiento (Figura 8a). Conjuntamente soportan el cultivo de células en suspensión óptimo .

La Figura 8b muestra un recipiente de biorreactor de auto-rodamiento en forma de bola. Este movimiento de rodamiento incrementa el DO en el medio de cultivo al lavar repetitivamente la superficie interna del recipiente expuesta al aire para soportar el crecimiento de alta densidad de células. Mientras que una plataforma agitadora orbital al nivel del suelo hacia el medio de cultivo bien mezclado durante el movimiento de rodamiento. Conjuntamente soportan el cultivo de células en suspensión óptimo.

La Figura 8c muestra un recipiente de biorreactor de auto-rodamiento en forma de cono. Este movimiento de rodamiento incrementa el DO en el medio de cultivo al lavar repetitivamente la superficie interna del recipiente expuesta al aire para soportar el crecimiento de alta densidad de células. Mientras que los carriles orbitales proyectados interiores hacen al medio de cultivo que se mueva hacia arriba a la parte superior de un extremo mientras que rueda y cae nuevamente al extremo inferior. Este movimiento adicional ayuda al mezclado del medio de cultivo durante el movimiento de rodamiento. Conjuntamente soportan el cultivo de células en suspensión óptimo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar el oxigeno disuelto en un medio de cultivo para un cultivo en suspensión de células mamiferas y sin el uso de burbujeo de oxigeno o aire, caracterizado porque el cultivo de células es contenido dentro de un recipiente de cultivo que tiene paredes lisas.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque no incluye el uso de fuerza cortante significante sobre las células cultivadas.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el movimiento del medio de cultivo en un movimiento de barrido repetitivamente a través de la superficie lisa expuesta al aire de la pared del recipiente de cultivo.

A . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el movimiento comprende cualquiera de los siguientes movimientos: agitación, rodamiento, oscilación, movimiento hacia atrás y hacia delante, y fluyente .

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la superficie comprende vidrio.

6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la superficie comprende plástico.

. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la superficie comprende metal.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque incluye el mezclado del medio adicional para el crecimiento de células óptimo en el cultivo en suspensión.

9. Un recipiente para el cultivo en suspensión de células mamiferas, caracterizado porque es un contenedor en forma de bola de auto-rodamiento con movimiento hacia atrás y hacia adelante adicional.

10. Un recipiente para el cultivo en suspensión de células mamiferas, ca acterizado porque es un contenedor en forma de bola de auto-rodamiento con movimiento de agitación orbital adicional.

11. Un recipiente para el cultivo en suspensión de células mamiferas, caracterizado porque es un contenedor en forma de cono de auto-rodamiento con carriles orbitales proyectados interiores para el movimiento adicional del medio de cultivo.

12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se lleva a cabo en el recipiente de la reivindicación 9, 10 u 11.