KR102059895B1

KR102059895B1 - 세포를 유지하고 재순환시키기 위한 단방향 분리기

Info

Publication number: KR102059895B1
Application number: KR1020147022780A
Authority: KR
Inventors: 안드레 파스토르; 주리 셀레트즈키; 헬무트 브로드; 죄르그 카울링; 피터 콤머
Original assignee: 바이엘 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2019-12-27
Also published as: CN104471051A; ES2758739T3; EP2817405B8; AU2013224132B2; EP2817406A1; IL234070A0; CN104126001A; US9809792B2; US9840691B2; IL234150B; CA2864781C; EP2817405A1; WO2013124326A1; CA2864781A1; DK2817405T3; PL2817406T3; JP2015507926A; WO2013124329A1; BR112014020120A8; JP6239532B2

Abstract

본 발명은 층상 패키지를 갖는 경사진 채널-유형 고체 물질 분리기에서의 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트의 용도에 관한 것이다.

Description

세포를 유지하고 재순환시키기 위한 단방향 분리기 {ONE-WAY SEPARATOR FOR RETAINING AND RECIRCULATING CELLS}

본 발명은 반응기 혼합물로부터 고체를 유지하기 위한, 플레이트 스택을 함유하는 경사진 채널 고체 분리기에서의 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트의 용도에 관한 것이다.

동물 및 식물 세포를 배양하는 것은 생물학적 활성 물질 및 제약 활성 생성물의 제조에 있어서 매우 중요하다. 특별히, 성장 배지 중에서 자유 현탁 상태로 빈번하게 수행되는 세포의 배양이 요구되는데, 이는 미생물과는 대조적으로 세포는 기계적인 전단 응력 및 불충분한 영양소 공급에 대해 매우 민감하기 때문이다.

동물 및 식물 세포주는 통상적으로 배치로 배양된다. 이것의 단점은 끊임없이 변화하는 기질, 생성물 및 바이오매스 농도 때문에 세포의 최적 영양을 달성하는데 어려움이 있을 수밖에 없다는 것이다. 또한, 발효의 종료시에 부산물, 예를 들어 사멸한 세포의 구성성분이 축적되며, 이는 통상적으로 이후의 프로세싱에서 많은 노력을 들여 제거될 필요가 있다. 따라서 언급된 이유로, 특별히 예를 들어 단백질분해 공격에 의해 손상될 수 있는 불안정한 생성물을 제조할 때, 연속적으로 작동하는 생물반응기가 사용된다.

연속 생물반응기는 하기 요구사항이 충족될 때 높은 세포 밀도 및 연관된 높은 생산성을 달성하는 것을 가능하게 한다:

· 세포에 대한 기질, 특별히 용존 산소의 충분한 저전단 공급,

· 호흡 동안 발생하는 이산화탄소의 충분한 제거,

· 높은 세포 농도를 강화하기 위한 효과적인 저전단 폐쇄-방지 세포-유지 시스템,

· 생물반응기 및 유지 시스템의 장기간 안정성 (멸균, 유체역학).

연속 작동 모드 뿐만 아니라, 예를 들어 심지어 특별히 높은 세포 밀도를 갖는 예비배양물의 배양에도 효율적인 세포-유지 시스템을 갖는 생물반응기를 사용하는 것이 가능하다. 이 경우에, 세포-유지 시스템은 바이오매스가 실질적으로 없는 세포 배양 상청액을 제거하기 위해 반복-배치 모드로 불연속적으로 사용된다. 그 후에, 예비배양 반응기는 배양물을 단순 배치식 작동의 경우보다 높은 세포 밀도로 만들기 위해 새로운 성장 배지로 재충전될 수 있다.

연속적으로 작동하는 생물반응기에서 높은 세포 밀도 (밀리리터당 2천만개 초과의 생존 세포)가 달성될 수 있도록 하는 세포의 효율적인 유지가 필요하다. 이 경우에, 요구되는 유지도는 세포의 성장 속도 및 관류 속도 q/V (생물반응기 부피 V당 배지 처리량 q)에 좌우된다.

과거에, 연속적으로 작동하는 생물반응기를 위한 다양한 세포-유지 시스템이 제안되었고, 이는 대개 생물반응기 외부에 배치된다. 그 이유는 보수유지 및 세정 목적을 위한 세포-유지 시스템의 용이한 접근성 때문이다.

특별히 불충분한 산소 공급 및 생물반응기 외부로의 이산화탄소 제거로 인한 세포 손상을 최소화하기 위해, 작은 작업 부피 및 연관된 짧은 세포 체류 시간을 갖는 세포-유지 시스템을 갖는 것이 바람직하다.

고정된 막 및 이동가능한 막에 의한 교차 흐름 여과의 원칙에 따라 기능하는 장치인 막 필터 뿐만 아니라, 특정 원심분리기 및 중력 분리기가 선행 기술에서 사용된다.

막 필터를 사용하는 세포 유지의 경우에, 침착물 또는 오염물이 관찰되며, 이는 신뢰가능하고 보수유지가 없는 장기간 작동을 방해할 수 있다. 침착물은 막 표면을 가로지르는 충분히 빠른 흐름이 있을 때 감소될 수 있다. 이는 고정식 또는 진동식 작동에서 달성될 수 있다. 가로지르는 진동식 흐름이 있는 막 시스템의 예는 리파인 테크놀로지스 인크.(Refine Technologies Inc.)로부터의 교대 접선 흐름 (ATF) 시스템이다. 그러나, 막 표면을 가로지르는 빠른 흐름은 저전단 세포 배양의 기본 전제조건에 반하는 것이다.

원심력장에서 세포를 분리하기 위한 저전단 원심분리는 단지 몇 주에 걸쳐서만 보수유지 없이 작동하며, 원심분리 요소의 대체를 요구한다. 이는 오염의 위험을 증가시킨다.

세포의 배양에 주로 사용되는 중력 분리기는 침강 용기 및 경사진 채널 분리기이다. 단순 침강 용기와 비교하여, 대규모의 경사진 채널 분리기는 분리 표면적에 비해 상당히 낮은 부피의 이점을 갖는다. 한 문헌 (Henzler, H.-J., Chemie-Technik, 1, 1992, 3)은 역류식, 교차 흐름식 및 병류식으로 작동할 수 있는 경사 채널 분리기에서의 세포 유지를 기재한다. 흐름이 통과하는 채널 횡단면은 플레이트 또는 튜브에 의해 제공될 수 있다. WO1994026384 A1은 역류식 분리기에서 세포를 유지하기 위한 경사진 채널 분리기의 용도를 청구한다. WO2003020919 A2는 특히, 세포의 유지를 위한 역류식 및 교차 흐름식 분리기, 및 또한 다양한 예비분리기 (예를 들어, 히드로사이클론(hydrocyclone))와의 조합을 기재한다. 이들 공지된 경사진 채널 분리기는 스테인레스 스틸로 제조되며, 그의 요소는 절단되고, 노력을 들여 평활화되고, 경면 연마되고, 함께 용접된다.

경사진 채널 분리기는 외부 회로를 통해 생물반응기에 연결된다. 이러한 목적으로, 호스 라인 및 펌프가 요구된다.

중력 분리기에서의 세포의 대사 활성 및 부착성을 감소시키기 위해, 세포 배양 브로쓰를 그의 중력 분리기로의 경로 상에서 냉각시키는 것이 제안된다. 저온에서의 감소된 대사 활성은 생물반응기 외부에서의 세포의 체류가 연장되는 경우에 확실히 유리하다.

WO2009152990 (A2)은, 서로의 옆에 배열된 다수의 채널을 포함하며, 여기서 채널은 수직의 움푹한 실린더를 형성하고 움푹한 실린더의 세로축에 대해 10° 내지 60°의 각도 β로 기울어진 것인, 흐름이 통과하는 용기에서 세포를 유지하고 재순환시키기 위한 세포-유지 시스템을 기재한다. 흐름이 통과하는 용기는 세포 유지 및 재순환을 위한 생물반응기 또는 생물반응기-연결된 용기일 수 있다. 채널은 하부 말단에서 개방되어 있다. 상부 말단에서, 이것은 수확물 스트림이 용기로부터 운반될 수 있는 적어도 1개의 라인을 갖는 공통의 고리 공간으로 이어진다. 세포 및 세포 배양 용액의 분리는 채널에서 일어난다. 생물반응기로부터의 수확물 스트림의 연속적인 제거의 결과로, 세포 배양 용액 및 세포가 채널 내로 흡입된다. 세포는, 전형적인 경사진 채널 분리기에서와 같이, 기울어진 채널 및 슬라이드 내부에서 다시 채널 밖에서 유입되는 수확물 스트림에 대해 역류식으로 침강되고, 이에 따라 용기 내에 남는다. 세포로부터 분리된 세포 배양 용액은 채널을 통해 채널 위의 고리 공간 내로 운반되고, 결국 용기 밖으로 운반된다.

고도로 규제된 제약 제조에서, 세정 및 멸균된 생물반응기 및 생물반응기 요소, 예컨대 예를 들어 세포-유지 시스템을 제공하는 것은 대부분 많은 시간이 소요되고, 기술적으로 복잡하며, 인원 집약적이다. 다목적 유닛에서 또는 2개의 생성물 로트 사이에서의 생성물 교체 동안 교차 오염을 안전하게 회피하기 위해서는 세정 외에도 매우 복잡한 세정 검증이 요구되며, 이 검증은 아마도 공정 적합화의 경우에 반복될 필요가 있다. 스테인레스 스틸로 제조된 통상의 배치, 유가식 또는 관류 발효기의 세정 및 멸균을 위해서는, 일반적으로 소위 영구-고정 유닛에서 제자리-세정 (CIP) 기술이 제자리-증기 (SIP) 기술과 조합되어 이용된다. 연속 공정 제어의 경우에 충분한 장기간 멸균을 보장하기 위해, 오토클레이브 기술도 또한 이용되지만, 이는 반응기 또는 반응기 요소를 오토클레이브로 수송하는 불편함을 요구하며, 비교적 소형의 반응기 규모에 대해서만 적용가능하다. 오염의 위험은 노화되는 소모성 부품, 예를 들어 실링된 교반기 샤프트의 사용, 부적당한 멸균 또는 장비 수송, 오토클레이빙 후 연결 라인의 작동 또는 연결, 및 정기적인 샘플링의 경우에 특별히 중대하다.

배치 또는 유가식 모드로 사용되는 CIP/SIP 유닛의 경우에, 제조 절차에 의해 유발되는 반응기 정지시간은, 특별히 짧은 사용 기간으로 인한 빈번한 생성물 교체의 경우에 반응기 가용성에 유의하게 영향을 미칠 수 있다.

일회용 반응기에 대한 개념은 최대 청결 및 멸균을 보장하면서 빠르고 융통성 있는 제조 유닛 재탑재에 대한 요구를 충족시키는 것에 대한 시장에서의 증가하는 관심을 받고 있다.

선행 기술에서 비롯된 본 발명의 목적은 연속적으로 또는 배치식으로 작동하는 공정에서 동물, 특별히 인간, 및 식물 세포를 유지하고 재순환시키는 효율적인 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 기계적 전단 응력에 대한 세포의 민감성 및 세포에 대한 충분한 영양소 공급을 고려하고, 매우 큰 규모로 확대가능하고, 제약 업계의 보수유지, 세정 및 멸균 요구를 충족시키고, 이 방법의 이용은 복잡성 및 오류의 위험을 저하시키며, 이 방법은 최소한의 자원 사용으로 일회용 시스템으로서의 경제적 및 환경적 최적 이용 (제조 및 폐기처분)을 허용한다.

상기 언급된 목적은 반응기 혼합물로부터 고체를 유지하기 위한 플레이트 스택을 함유하는 경사진 채널 고체 분리기에서 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트를 사용함으로써 달성되었다.

특히 생물반응기 혼합물로부터의 세포의 유지를 위해, 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기는 하기 요소를 포함한다:

- 세포로부터 분리된 수확물 스트림 (70) (=수확물)을 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로부터 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루/이음부 (80)를 갖는 고체 분리기의 상부 영역, 이것이 연결되어 있는

- 작동 동안 수평선에 대해 30° 내지 80°의 각도 (10)로 기울어지는 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트로 구성된 플레이트 스택 (1)에 의해 형성된 분리 영역, 이것이 연결되어 있는

- 반응기 혼합물 (74)의 흐름 분배를 위한 1개 이상의 피드-스루 또는 이음부 (84)를 갖는 고체 분리기의 하부 구획, 이것 아래의

- 중력에 의해 세포를 수집하기 위한, 특별히 원추형 또는 피라미드형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57).

바람직하게는, 특별히 원추형 또는 피라미드형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)은 수직선에 대해 10° 내지 60°의 각도 (58, 59)를 갖는다. 각도 (58) 및 (59)는 개별적으로 선택될 수 있다.

재순환을 허용하기 위해, 고체 수집 영역 (57)은 세포를 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루 (89) 또는 아마도 이음부 (88)를 갖는다. 이음부의 예는 중심 흡입 포트이다.

단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트는 채널을 형성하고, 플레이트 스택 (1)은 바람직하게는 서로의 옆에 배열된 다수의 채널로 이루어진다.

채널은 하부 말단 및 상부 말단에서 개방되어 있다. 하부 말단에서, 채널은 원추형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 공통의 고체 수집 영역 (57)으로 이어진다. 상부 말단에서, 이것은 수확물 스트림이 용기로부터 운반될 수 있는 적어도 1개의 피드-스루 (80)를 갖는 공통의 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로 이어진다.

본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기의 채널에서, 세포 및 세포 배양 용액이 분리된다. 생물반응기로부터의 수확물 스트림의 연속적인 제거의 결과로, 세포 배양 용액 및 세포가 채널 내로 흡입된다. 세포는, 전형적인 경사진 채널 분리기에서와 같이, 기울어진 채널 및 슬라이드 내부에서 다시 채널 밖에서 유입되는 수확물 스트림에 대해 역류식으로 침강되고, 원추형으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)에 수집된다. 통상적으로, 고체 수집 영역 (57)은 수집된 세포의 흡입 제거 및 생물반응기 내로의 재순환을 위해 생물반응기에 연결된 1개 이상의 피드-스루/이음부 (88/89)를 갖는다.

플레이트 스택 (1)의 채널은 다각형, 타원형, 원형 또는 반원형 횡단면을 가질 수 있다 (도 4).

채널의 치수화 (수, 직경, 길이)는 각 경우에 유지할 세포의 성질, 생물반응기의 크기 및 처리량에 좌우된다.

채널 폭 d는 바람직하게는 채널의 폐쇄를 방지하기 위해 d ≥ 3 mm이다. 바람직한 실시양태에서, 3 mm 내지 100 mm, 바람직하게는 4 mm 내지 20 mm, 특히 바람직하게는 3-7 mm의 채널 폭을 갖는 채널이, 첫째로 폐쇄 상태를 안전하게 회피하기 위해, 둘째로 분리기 공간 및 생물반응기 공간 사이의 공간-시간 수율-감소 부피 비를 최소화하기 위해 사용된다.

요구되는 분리 표면적 A_erf는 식 1에 따라 침강 속도 ws, 관류 속도 q/V (생물반응기 부피 V당 배지 처리량 q) 및 생물반응기 부피로부터 주어진다. 계수 η는 수직 분리기에 대한 경사진 채널 분리기의 성능의 감소를 고려한다 (식 2).

직사각형 및 원통형 횡단면의 경우에 이론적인 분리 표면적 A_th는 문헌 (H.-J. Binder, Sedimentation aus Ein- und Mehrkornsuspensionen in schraeg stehenden, laminar durchstroemten Kreis- und Rechteckrohren [Sedimentation from single grain and multigrain suspensions in inclined, laminar-flow circular and rectangular pipes], Dissertation Berlin, 1980)에 공개된 접근법에 따라 식 3 및 4로부터 대략적으로 결정될 수 있다:

<식 1>

<식 2>

<식 3>

<식 4>

상기 식에서, Z는 채널의 수이고, β는 채널이 중력의 방향에 대해 기울어진 각도이고, d는 내부 직경이며, L은 채널의 길이이다. π는 원주율 (π = 3.14159...)이다.

채널 길이의 치수화는 층류 조건 (레이놀즈(Reynolds) 지수 Re < 2300)의 준수가 고려될 것을 요구한다.

이와 관련하여, 수확물 스트림 제거 부위 (=피드-스루/이음부 (80))에서의 동압력은 이상분배의 효율-감소 현상을 배제하기 위해 채널에서의 압력 강하보다 적어도 5 내지 10배 낮아야 한다. 충분한 압력 강하는 0.1 m 이상의 채널 길이의 경우에 기술적으로 구현가능한 것으로 간주될 수 있지만, 바람직하게는 0.2 m 내지 5 m의 채널 길이, 특히 바람직하게는 0.4 m 내지 2 m의 채널 길이가 구현된다.

감소된 압력 강하 때문에, 짧은 채널 길이 L은 분배 문제로 이어질 수 있고, 이는 특별히 수확물 스트림을 상부 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로부터 제거할 때 제거의 속도를 감소시키기 위한 분배 장치를 요구할 수 있다. 임의로, 피드-스루/이음부 (80)는 따라서 세포로부터 분리된 수확물 스트림 (70) (=수확물)의 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로부터의 균질화된 제거를 위한 흐름 변환기 (81)를 갖는다.

통상적으로, 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기는 1 내지 10⁶개, 바람직하게는 10 내지 100,000개, 특히 바람직하게는 10 내지 10,000개의 채널을 포함할 수 있다. 채널은, 필요한 경우에는, 공간 요구 사항 최적화를 위해 플레이트 스택 (1) 내의 1개 이상의 웹 플레이트를 가로질러 분포되어 있다. 바람직하게는, 플레이트 스택 (1)은 규모에 따라 1 내지 400개의 웹 플레이트, 특히 바람직하게는 1 내지 50개의 웹 플레이트를 포함한다.

지지 플레이트를 포함하는 단층 또는 다층 웹 플레이트로 이루어진 플레이트 스택 (1)의 폭 대 높이 비는 조정될 수 있다. 0.005 ≤ H/D ≤ 1.5, 바람직하게는 0.02 ≤ H/D ≤ 1.2, 특히 바람직하게는 0.1 ≤ H/D ≤1.0의 높이 대 폭 비 H/D를 갖는 정사각형, 원통형, 직사각형 또는 타원형 횡단면을 갖는 플레이트 스택 (1)이 바람직하게 사용된다.

바람직하게는, 분리 영역은 서로의 상단에 스택되고 기저체를 형성하는 다중 플라스틱 웹 플레이트를 포함한다.

다르게는, 플레이트 스택 (1)은 프로파일링된 플레이트 (340) 또는 (320)으로부터 형성될 수 있다 (도 4 참조). 프로파일링된 플레이트는 바람직하게는 평활한 측면 및 일정한 간격으로 연속적인 버팀대 및 홈을 갖는 측면을 갖는다. 채널은, 예를 들어 지지 플레이트 (30) 상에 1개 이상의 층으로 플레이트를 스택하여 형성된다. 이 경우에, 개방된 측면 상의 홈은 각각의 경우에 인접한 층의 평활한 측면에 의해 또는 고정자의 벽에 의해 폐쇄된다. 플레이트 스택 또는 서브스택을 단층 또는 다층 방식으로 압출하고 이들을 연결하여 플레이트 스택 (1)을 형성하는 것도 또한 가능하다.

웹 플레이트는 바람직하게는 접착제 접합 또는 용접에 의해 연결된다. 플레이트 스택은 주로 연결의 결과로서 공간적으로 고정되어야 한다. 또 다른 목표는 소위 사각 지대 (웹 플레이트의 외부 표면 주위의 분리에 이용되지 않는 공간)를 최소화하는 것이다. 그러나, 이 경우에, 상기 사각 지대의 완전한 회피가 절대적으로 필요하지는 않다. 적합한 접착제는 당업자에게 공지되어 있고 채널의 물질 및 표면 특성에 잘 맞는 접착제 성분이다. 보다 특히, 요구되는 FDA 품질 등급으로 시판되는 접착제를 사용하는 것이 바람직하다. 용접을 위해, 열 연결 기술, 예컨대 가열, 레이저 및 초음파가 사용될 수 있다. 특히 바람직한 연결 기술은 레이저 용접이고, 이는 또한 특별히 상기 목적에 적합한 장치의 크기로 플레이트 스택을 절단하는 것과 조합하여 이용될 수 있다. 용접 기술은 제약 공정 내로 도입되는 플라스틱의 수가 이 연결 기술에 의해 증가되지 않는다는 이점을 갖는다.

채널의 기하구조는 버팀대 높이 hs 대 채널 폭 d의 비에 의해 규정된다. 기술적으로 구현가능한 hs/d 비는 특성 (가단성, 탄성, 딥 드로잉에 대한 용량)에 따라 0.01 ≤ hs/d ≤ 5의 범위 내에 있다. 여기서, 2개의 치수 hs 및 d는 둘 다 3 mm 이상, 또는 바람직하게는 5 mm 이상이어야 한다는 점에 주목하여야 한다. 바람직한 hs/d 비는 0.5 내지 5이다. 버팀대 폭 bs는 필름 물질의 기계적 안정성에 의해 결정된다. 버팀대 폭 bs는 분리기 부피당 높은 분리 표면적을 허용하기 위해 최소화되어야 한다. 동시에, 이것은 형상의 변화 없이 하부 층과의 강제-피트 연결을 허용할 수 있도록 너무 낮게 선택되지는 않아야 한다. 압출된 플레이트 스택 (1)의 경우에, 또는 압출된 플레이트 서브스택 또는 웹 플레이트로부터 구축된 플레이트 스택의 경우에, 분리 표면적의 엄청난 손실 없이 작은 버팀대 폭으로 매우 높은 강성을 구현하는 것이 가능하므로, 이러한 제조 형태가 바람직하다.

프로파일링된 플레이트는 플레이트 제조 동안의 직접 성형에 의해, 또는 엠보싱된 뜨겁거나 또는 차가운 형성된 플레이트의 평활한 플레이트에 대한 (예를 들어, 접착제) 연결에 의해 제조될 수 있다. 엠보싱된 플레이트 및 평활한 플레이트의 물질 특성은 이들의 상이한 기능성 (엠보싱된 플레이트의 경우에는 우수한 슬라이딩 특성 및 형상 안정성, 평활한 플레이트의 경우에는 우수한 실링 특성)에 대해 최적으로, 즉 당업자에게 공지되어 있고 적절한 표면 품질을 갖는 적합한 물질을 선택함으로써 조정될 수 있다.

상업적으로 입수가능하고, 비용 효율적이고, 제약 공정에 적합한, 예를 들어 폴리카르보네이트로 구성된 플레이트 서브스택 형태의 플라스틱 웹 플레이트는 통상적으로 적절한 길이로 절단 또는 생성되어 서로에 부착됨으로써 플레이트 스택 (1)을 생성한다.

이들 웹 플레이트는 절단을 위한 연속 생성물로서 압출되고, 완성된 채널 기하구조 (침강 표면 구역) 및 이미 만들어진 표면 품질을 갖는다. 원하는 크기로의 절단, 보다 특히 요구되는 길이로의 절단은 통상적으로, 예를 들어 원형 톱 상에서 절단함으로써 달성된다. 통상적으로, 세로 버팀대는 첫째로 분리기의 하우징으로서의 역할을 하고, 둘째로 흐름 채널을 안정화하며, 가로 버팀대는 첫째로 분리기의 하우징으로서의 역할을 하고, 둘째로 분리 표면 구역을 형성한다.

플라스틱 웹 플레이트로부터 구축된 플레이트 스택은 채널 개구부의 평면이 플레이트 스택 (1)의 지지 표면에 대해 직각으로 있는 곧은 직육면체로서 (도 3), 또는 채널 개구부가 피팅된 상태로 수평면 상에 놓여 있는 기울어진 직육면체로서 (도 2) 구현된다. 하부 채널 개구부를 향한 침강-유도된 농도 구배를 방지하기 위해 후자의 해결책이 바람직하다. 채널은, 임의로 수평 분배기 (85)의 도움으로, 반응기 혼합물의 균질화된 흐름을 수신한다.

제1 실시양태 (도 1 내지 13)에서, 본 발명에 따른 일회용 경사진 채널 고체 분리기의 요소는 흐름이 통과할 수 있는 감마-멸균가능한 플라스틱 백 내에 피팅된다. 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트로 구성된 플레이트 스택 (1)은 플라스틱 백의 중심 영역의 상부 구획에 도입된다. 플라스틱 백은 또한 수확물 스트림 수집 영역 (56) 및 원추형으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역의 경계를 정하며, 고체 수집 영역 (57)은 바람직하게는 수직선에 대해 10° 내지 60°의 각도 (58, 59)를 갖는다. 플라스틱 백의 중심 영역의 하부 구획에서, 피드-스루 또는 이음부 (84)는 인피드 표면 구역 (510)을 통한 세포 배양 용액 (=공급물) (74)의 균일한 수평 흐름 분배를 위한 수평 분배기 (85)를 나타낸다.

이러한 실시양태에서, 상기 언급된 목적은 하기 부품을 갖는 흐름이 통과할 수 있는 감마-멸균가능한 플라스틱 백을 포함하는, 생물반응기 혼합물로부터 세포를 유지하고 재순환시키기 위한 일회용 경사진 채널 고체 분리기에 의해 달성된다:

- 플라스틱 백의 상부 영역에 있는, 세포로부터 분리된 수확물 스트림 (70) (=수확물)을 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로부터 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루/이음부 (80),

- 플라스틱 백의 중심 영역의 상부 구획에 있는, 작동 동안 수평선에 대해 30° 내지 80°의 각도 (10 = β)로 기울어지는 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트로 구성된 플레이트 스택 (1)에 의해 형성된 분리 영역,

- 플라스틱 백의 중심 영역의 하부 구획에 있는, 인피드 표면 구역 (510)을 통한 세포 배양 용액 (=공급물) (74)의 균일한 수평 흐름 분배를 위한 수평 분배기 (85)를 임의로 갖는, 반응기 혼합물 (74)의 흐름 분배를 위한 1개 이상의 피드-스루 또는 이음부 (84),

- 플라스틱 백의 하부 영역에 있는, 중력에 의해 고체를 수집하기 위한, 특별히 원추형 또는 피라미드형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57). 통상적으로, 고체 수집 영역 (57)은 세포를 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루 (89) 또는 이음부 (88)를 갖는다.

플라스틱 백의 상부 영역은 또한 위쪽으로 점차 가늘어질 수 있다.

플라스틱 백은 통상적으로 작동 동안 장치의 내부가 보이도록 허용하는 단층 또는 다층 투명 중합체 물질로부터 구현된다. s << 1 mm의 통상적인 낮은 필름 두께의 경우에, 중합체 물질은 비교적 작은 질량 분획을 갖는 장치를 허용한다. 이것은 획득하고 가공하기에 비용 효율적이며, 이는 일회용 시스템의 구축에 매우 적합하다. 사용된 분리기의 폐기처분 및 새로운 일회용 분리기의 사용은 따라서 사용된 분리 장치를 세정하는 것보다 경제적인데, 이는 특별히 일회용 분리기를 사용할 때 고가의 주사용수 (WFI)로의 세정 및 많은 시간이 소요되는 세정 검증이 적용되지 않기 때문이다. 본 발명에 따른 분리기는 바람직하게는 멸균-포장된다.

플라스틱 백에 특히 적합한 물질은 특허 명세서 US 6,186,932 B1, 칼럼 2 및 3에서 사용된, 그 안에 언급된 수송 백 (사쉐)을 위한 물질 및 물질 조합물이다. 그 안에 언급된 벽 강도도 또한 본 발명에 따른 분리 장치에 전용될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 플라스틱 백의 벽은 언폴딩 거동, 스트레칭 거동, 기체 확산, 안정성, 공정 적합성 (생성물 및 세포의 최소 흡착) 및 용접성에 관한 플라스틱 백의 특성을 개선하기 위해, 당업자에게 공지되어 있고 2개 이상의 층 (라미네이트 또는 공압출물)으로 이루어진 필름 복합 물질로 이루어진다.

채널 길이의 치수화는 층류 조건 (레이놀즈 지수 Re < 2300)의 준수가 고려될 것을 요구한다. 채널 길이 L은 이용가능한 백 내부의 길이 측정치 (= 백의 길이 LK)의 길이에 의해 결정된다. 구현할 백 길이 LK는 플라스틱 백에서 구현할 충전 수준 및 플라스틱 백에서 구현할 유체정역학적 압력에 의해 결정된다. 과도하게 높은 유체정역학적 압력은, 필요한 경우에, 적절하게 치수화된 비-생성물-접촉, 따라서 재사용가능한 인클로저로 전달될 수 있다.

채널 길이 L은 통상적으로 플라스틱 백의 길이 LK의 30% 내지 95%, 특히 바람직하게는 60% 내지 90%이다.

중합체 필름으로 구성된 플라스틱 백을 함유하는 본 발명에 따른 고체 분리기는, 예를 들어 US 6,186,932 B1에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있고, 이는 용접 솔기를 조정하는 것을 필요로 한다. 본 발명에 따른 분리 장치의 바람직한 실시양태를 제조하기 위한 예시적 실시양태가 하기 추가로 기재되어 있다.

피드-스루는 통상적으로 생성물-접촉 필름의 물질과 동일한 물질로 제조되며, 이는 상기 필름과 멸균성 및 강도의 관점에서 무결하게 용접되도록 하기 위한 것이다. 바람직한 생성물-접촉 필름 물질은 당업자에게 공지된 다양한 정도로 가교된 폴리에틸렌이다. 적용 및 공정 요구사항에 따라, 사용되는 외부 재킷 필름은 열 용접 방법의 사용 및/또는 보다 우수한 강도 및/또는 확산 특성을 위해 내부 필름에 대해 상승된 융점을 갖는, 당업자에게 공지된 다양한 물질이다.

웹 플레이트는 통상적으로, 기반을 제공하고 정확한 위치설정을 위해 접착 또는 용접에 의해 플라스틱 백에 연결될 수 있는 지지 플레이트 (30)에 접합된다.

3D 백 (4개의 필름 웹으로부터 함께 용접된 백)에서, 유리하게는 0.3 < H/D < 1.5, 바람직하게는 0.6 < H/D < 1.2, 특히 바람직하게는 0.9 < H/D < 1.0의 높이-대-폭 비 H/D를 갖는 정사각형, 원통형, 직사각형 또는 타원형 횡단면을 갖는 플레이트 스택 (1)을 사용하는 것이 가능하다.

보다 단순하고 보다 저렴한 2D 백 (2개의 필름 웹으로부터 함께 용접된 백)에 대해서는, 0.005 < H/D < 1, 바람직하게는 0.02 < H/D < 0.6, 특히 바람직하게는 0.1 < H/D < 0.4의 H/D 비를 갖는 직사각형 횡단면을 갖는 평면 플레이트 스택이 적합하다. 플레이트 스택의 높이에 따라, 2D 백의 제조를 위해 플레이트 스택과 점차 가늘어지는 시작점 사이에 특정 거리를 남겨둘 수 있다.

분리기의 제조를 위해, 피드-스루 및 추가의 이음부가 또한 제조되며, 적절한 경우에는 적절한 부위에서 플라스틱 필름에 피팅된다.

후속적으로, 플라스틱 백 (50)은 플레이트 스택 (1)을 둘러싸는 플라스틱 필름으로부터 함께 용접되어 용접 솔기 (55)를 갖는 플라스틱 백 (50)을 제공한다 (도 5).

이어서, 지지 플레이트를 포함하는 플레이트 스택 (1)은 통상적으로 플라스틱 백 (50)과 플레이트 스택 (1) 사이의 세포의 침투 및 이에 따른 오손을 방지하기 위해 플라스틱 백 (50)의 내부 표면에 대해 압입된다.

제조 방법의 제1 실시양태에서, 플라스틱 백 (50)은 플레이트 스택 (1) 상에 조여지고 (도 5), 형성된 폴드 (52)는 평평하게 압착되고, 1개 이상의 고정 스트랩 (60)을 사용하여 고정된다 (도 6). 백 및 플레이트 스택 주위에 단단히 랩핑되어 있는 플라스틱 필름은 고정 스트랩으로서도 또한 적합하다. 유리한 조임 특성은, 예를 들어 가정용 필름 또는 가요성의 얇은 실리콘 필름에서 발견된다. 백 벽에 대한 플레이트 스택 (1)의 용접은 또한 백과 플레이트 스택 사이의 단단한 연결을 확립하기에 적절할 수 있다.

작동을 위해, 본 발명에 따른 장치는 수평선에 대해 각도 (10) = β로 배향된다. 각도 β는 세포/고체의 침강 및 슬라이딩 거동에 의해 결정되며, 작동 동안 수평선에 대해 30° ≤ β ≤ 80°이다. 바람직한 실시양태에서, 각도 β는 수평선에 대해 35° 내지 75°, 특히 바람직하게는 45° 내지 60°이다.

작동 동안 각도 β를 보장하기 위해, 본 발명에 따른 고체 분리기는 작동 동안 프레임 (140)에 고정된다 (도 11 내지 13).

프레임 (140)은 통상적으로 프레임 바닥 (145), 및 바닥면에 대해 미리 정의된 각도 (10) (= β)를 갖는 지지부 (148)를 포함한다. 지지부 (148) 상에서, 수확물 스트림 수집 영역 (56) (상부) 및 고체 수집 영역 (57)이 둘 다 작동 동안 최소한의 주름과 함께 지지부 상에 기대어질 수 있도록, 지지 플레이트 (30)를 포함하는 플레이트 스택 (1)은 돌출부 (142) 및/또는 덮개 (110) 및 또한 고정 요소 (115)에 의해 미리 정의된 높이로 유지된다. 이는 사각 공간 및 상응하는 오손을 감소시킨다.

바람직한 실시양태에서, 프레임 (140)은 플레이트 스택 (1)을 수용하기 위한 하우징 (100) 및 덮개 (110)를 갖는다.

이 경우에, 조임 공정은 또한 본 발명에 따른 고체 분리기가 프레임 (140) 상에, 보다 특히 하우징 (100) 및 덮개 (110) (도 6 및 7) 내에 피팅되는 동안, 아마도 또한 고정 스트랩 (60)으로 랩핑하지 않으면서 일어날 수 있다. 여기서, 플라스틱 백 (50)은 하우징 (100)에 의해 지지 플레이트 (30) 및 플레이트 스택 (1) 상의 위치에 유지되고, 폴드 (52)는 덮개 (110)에 의해 플레이트 스택 (1) 상에 압착된다. 바람직하게는, 덮개 (110)는, 예를 들어 경첩에 의해 한쪽 측면에서, 1개 이상의 잠글 수 있는 고정 요소 (115)에 의해 다른쪽 측면에서 하우징 (130) 상에 고정된다. 이는 본 발명에 따른 고체 분리기를 가동하기 위해 프레임 (140)을 조작하는 것을 보다 단순하게 한다.

바람직한 실시양태에서, 덮개 (110)는 원추형으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)의 형상, 보다 특히 각도 (59)를 일정하게 유지하고 작동 동안 충전된 상태에서의 그의 팽창을 방지하는 확장부 (112) 및/또는 프레임워크 (130)를 갖는다. 이러한 형상-맞춤 용기는 특히, 대형 생물반응기에 연결할 때 예상되는 상대적으로 큰 유체정역학적 힘 하에서의 시스템의 작동에 유리하다.

본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기는 바람직하게는 세정 문제를 회피하기 위해 일회용 물품으로서 구현된다.

본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기의 보관은 공간을 절약하는데, 이는 이것이 어떠한 문제도 없이 서로의 상단에 스택될 수 있고, 단지 가동 동안에만 적절한 각으로 설치되기 때문이다. 이어서, 이것은 생물반응기 외부에 용이하게 연결되고 작동할 수 있다.

추가 실시양태 (도 14 및 15)에서, 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기의 상부 영역은 수집기이고, 이는 예를 들어 터닝 기계 상에서 특별히 폴리카르보네이트, 예컨대 마크롤론(Makrolon)®으로 구성된 플라스틱 중실 막대를 절단함으로써 호스 연결부를 갖는 물품으로부터 제조된다. 다량의 물품의 경우에 주로 적합한 추가의 방법은 사출 성형 공정이다. 수집기는 수확물 스트림 수집 영역 (56)에 연결된 세포로부터 분리된 수확물 스트림 (70) (=수확물)을 제거하기 위한 적어도 1개의 피드-스루인 피드-스루 (80)를 나타낸다. 수확물 스트림 수집 영역 (56)은 수집기 내의 오목부에 의해 형성되며, 이 오목부는 세포로부터 분리된 수확물 스트림 (70)을 제거하기 위한 피드-스루 (80)로 통한다. 상기 오목부의 횡단면은 통상적으로 원형 또는 정사각형이다. 바람직하게는, 횡단면은 상부 플러그 플레이트의 개구부의 크기에 적합화되며, 이로써 웹-플레이트 기저체의 모서리 치수에 적합화된다. 오목부의 높이는 불감 부피의 최소화 및 흐름 제어의 최적화와 관련하여 조정된다. 이는 통상적으로 1 내지 5 mm이다. 상기 오목부는 또한 깔때기-형상일 수 있다.

이러한 실시양태에서, 웹-플레이트 기저체의 상부 및 하부 말단은 소위 플러그 플레이트 내로 도입되고 그에 접착제로 접합된다. 플러그 플레이트는 또한 통상적으로 터닝 및 밀링 기계 상에서 절단함으로써 또는 사출 성형 공정으로 제조된다. 이것은 바람직하게는 수집기의 물질로 구성된다. 이것은 웹-플레이트 기저체의 하부 및 상부 말단의 플러깅을 위한, 바람직하게는 미리 정의된 각도의 정사각형 개구부를 나타낸다. 이것은 통상적으로 원형이다.

바람직하게는, 깔때기는 하부 구획 및 고체 수집 영역 (57)을 형성하며, 이것은 고체를 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루 (89)를 갖는다. 깔때기는 통상적으로 터닝 기계 상에서 절단함으로써 또는 사출 성형 공정으로 하부 호스 연결부로 제조된다. 이것은 바람직하게는 플러그 플레이트의 물질로 구성된다. 깔때기의 상부 영역은 인피드 표면 구역 (510)을 통한 세포 배양 용액 (=공급물) (74)의 균일한 흐름 분배를 위한 1개 이상의 피드-스루 또는 이음부 (84)를 나타낸다. 임의적인 수평 분배기는 측방향 연결부가 제자리에 접합되어 있는 2개 이상의 기하학적으로 분포된 구멍, 통상적으로 2개의 대향 구멍에 의해 형성될 수 있다. 깔때기는 접착제로 하부 플러그 플레이트에 접합된다.

수집기, 플러그 플레이트 및 깔때기는 통상적으로 경사진 채널 고체 분리기의 기계적 안정성을 위해 굽힘에 대해 저항성이다.

바람직하게는, 웹-플레이트 기저체는 보강 브래킷에 의해 안정화된다. 보강 브래킷은 웹-플레이트 기저체 및 상부 및 하부 플러그 플레이트에 대한 접착제 접합에 의해 부착되어, 경사진 채널 고체 분리기의 충분한 기계적 안정성을 보장한다.

선행 기술로부터의 스테인레스-스틸 경사진 채널 분리기와 비교하여, 기저체의 복잡한 제조 (절단, 다수의 용접 단계, 및 매우 평활한 마감을 위한 전해연마)는 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기 (=플라스틱-플레이트 분리기)의 경우에는 적용되지 않는다. 복잡한 용접은 단순한 접착제 접합에 의해 대체된다. 본 발명에 따른 경사진 채널 분리기를 제조하는 것은 나사결합 및 실링을 전혀 요구하지 않는다. 종합하면, 스테인레스 스틸 경사진 채널 분리기와 비교하여 플라스틱-플레이트 분리기의 제조로, 시간 및 재료비 관점에서 상당한 이점이 달성된다.

본 발명에 따른 상기 경사진 채널 고체 분리기는 통상적으로 하기와 같이 제조된다:

a. 웹-플레이트 기저체의 원하는 크기로의 절단, 보다 특히 톱질,

b. 웹-플레이트 기저체의 디버링 및 세정,

c. 하기 성분의 제조:

1) 깔때기

2) 2개의 플러그 플레이트

3) 수집기

4) 바람직하게는 보강 브래킷

d. 플러그 플레이트로의 웹-플레이트 기저체의 양방향 삽입, 및 바람직하게는 UV-경화 접착제, 예컨대 예를 들어 록타이트(Loctite) 3211을 사용한 접착제 접합,

e. 수집기에 대한 상부 플러그 플레이트의 접착제 접합,

f. 깔때기에 대한 하부 플러그 플레이트의 접착제 접합,

g. 보강 브래킷의 부착 및 접착제 접합.

작동을 위해, 경사진 채널 고체 분리기는 통상적으로 콘솔 상에 고정된다.

플라스틱 구축물 및 결과적으로 감소된 중량 때문에, 크기에 따라 스테인레스 스틸로 제조된 재사용가능한 콘솔이 설치하기에 충분하다. 통상적인 크기 (0.15 m²의 분리기 표면적)의 경사진 채널 분리기의 경우에, 대략 4 kg의 콘솔 포함 총 중량이 달성되었다 (동일한 크기, 대략 40 kg의 스테인레스 스틸과 비교). 이는 본 발명에 따른 일회용 경사진 채널 분리기를 이동식 수송 프레임이 필요없이 용이하게 수송가능하게 한다.

통상적으로, 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기는 외부적으로 생물반응기, 예를 들어 US 2009-0180933에 기재된 바와 같은 일회용 생물반응기에 호스 라인에 의해 커플링된다. 적어도 2개의 펌프, 바람직하게는 저전단 연동 펌프 (도 16)에 의해, 본 발명에 따른 분리기의 공급에 대한 보장이 달성된다. 펌프는 생물반응기 공간으로부터의 세포 배양 용액의 제거, 이것을 열 교환기를 통한 냉각 후에 분리기 장치로 공급하는 것, 분리기 장치로부터의 수확물 스트림의 제거, 및 고체 스트림 (=리턴 (70))의 생물반응기로의 리턴 수송을 허용한다. 요구되는 분리 표면적은 세포의 침강 특성 및 얻고자 하는 관류 속도 및 세포 농도에 의해 결정된다. 바람직한 관류 속도는 0.1 내지 40 l/일, 특히 바람직하게는 0.5 내지 20 l/일의 범위 내에 있다. 바람직한 생물반응기 부피당 분리 표면적은 세포의 침강 특성 (세포의 농도, 크기 및 응집 경향에 좌우됨)에 따라 0.1 내지 100 m²/m³, 특히 바람직하게는 2 내지 20 m²/m³의 범위 내에 있다.

기재된 방법은 세포를 유지하고 재순환시키기 위한 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기의 단순하고 비용 효율적인 제조를 허용한다. 넓은 한도 내에서 변동가능한 플레이트-스택 구성 때문에, 이어지는 장치의 기하구조가 용이하고 정확하게 규정될 수 있고, 스테인레스-스틸 시스템과는 대조적으로 초대형 생물반응기에 대해서도 또한 제공될 수 있다. 기재된 방법은 특히 일회용 요소의 비용 효율적인 제조를 허용하며, 그의 사용은 제약 가이드라인에 따라 세정된 유지 시스템을 제공하는데 요구되는 노력을 최소한으로 감소시키는 것을 가능하게 한다.

발효기에 대한 연결은 층류 캐비닛 내부 또는 외부의 다양한 제조업체 (폴(Pall), 사르토리우스(Sartorius), 콜더(Coulder))로부터의 호스 라인의 말단에 부착되어 있는 멸균 커플러에 의해, 바람직하게는 호스 용접에 의해 수행된다. 본 발명에 따른 고체 분리기에 부착되어 있는 호스 라인에는 따라서 바람직하게는 - 적어도 부분적으로 - 호스 용접-적합화 호스 요소가 제공된다. 또한, 현탁액을 운반하기 위해, 호스 라인은 통상적으로 분리기의 멸균성을 위협하지 않으면서 연동 펌프 내로 비침습적으로 삽입될 수 있는 (예를 들어, 버더(Verder)로부터의 버더프렌(Verderprene) 엘라스토머 호스로 구성된) 기계적 응력에 고도로 저항성인 적어도 2개의 특정 호스 요소를 함유한다. 연결, 작동 및 보수유지에는 문제가 없다. 일회용 요소로서의 본 발명에 따른 장치 또는 본 발명에 따른 장치의 일부분의 구현은 세정 문제를 배제시킨다.

플레이트 스택의 채널에서 및 원추형으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역의 내벽 상에서의 세포의 슬라이딩 거동을 개선하기 위해, 장치는 적합한 수단, 예를 들어 공압 또는 전기 진동기를 사용하여 진동하도록 제조될 수 있다.

기체 적용에 필요한 기포가 진입 개구부로부터 떨어진 채로 유지될 수 있는 경우에, 원칙적으로 호기성 생물반응기 내에서의 플레이트 스택 (1)의 직접적인 사용을 상상할 수 있다.

그러나 바람직하게는, 본 발명에 따른 분리기는 생물반응기 외부에서 사용하도록 의도된다.

본 발명은 생물반응기 및 본 발명에 따라 기재된 세포 분리 장치 중 하나로 이루어진 생물반응기 유닛을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 생물반응기는 일회용 반응기, 보다 특히 US 2009-0180933에 기재된 바와 같은 반응기이다.

생물반응기 유닛은, 예를 들어 공지된 방식으로 작동할 수 있는 관류 반응기이다. 성장 배지가 연속적으로 생물반응기로 공급되고, 세포 함량이 낮은 세포 배양 상청액이 연속적으로 제거된다. 관류 반응기는 이것이 생물학적 관점에서 유용하고 충분한 분리 표면적이 제공되는 경우에 높은 관류 속도 q/V (생물반응기 부피 V당 배지 처리량 q)로 작동할 수 있다. 이 경우에, 흐름은 연속적으로 분리기를 통과한다.

관류 반응기는 또한 배양물이 처음에는 배치 방식으로 높은 성장을 달성하도록 허용되는 방식으로 작동할 수 있다. 바이오매스의 뚜렷한 증가가 더이상 가능하지 않을 정도로 배지가 많이 소모되었을 때, 실질적으로 바이오매스가 없는 배양 상청액이 외부 세포 분리기를 통해 제거된다. 이어서, 생물반응기에서 획득된 공간은 새로운 성장 배지를 공급하기 위해 이용될 수 있고, 이는 추가의 성장 및 이에 따른 보다 높은 총 바이오매스 생산성을 허용한다 (반복-배치 모드). 이 경우에, 흐름은 배치 방식으로 세포 분리기를 통과한다. 이 방법은 기존의 예비배양 반응기의 생산성을 증가시킬 수 있기 때문에, 예를 들어 초대형 생물반응기에 접종하는 예비배양물에 적합하다.

생물반응기 상에서의 작동을 위해, 본 발명에 따른 경사진 채널 고체 분리기의 연속 흐름이 바람직하다.

생물반응기 또는 관류 반응기는 시험관내에서 자유 현탁 상태로 또는 마이크로담체 상에서 성장하는 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 바람직한 세포는, 예를 들어 유전자 변형의 결과로 특정 활성 제약 성분, 예컨대 바이러스, 단백질, 효소, 항체, 뉴런, 조직 세포 또는 진단 구조를 생산할 수 있는 원충 및 또한 인간 (신경, 혈액 또는 조직 세포, 및 또한 배아 또는 성인 기원의 줄기 세포), 동물 또는 식물 기원의 부착성 및 비부착성 진핵 세포를 포함한다. 특히 바람직하게는, 고성능 제약 생산에 적합한 세포, 예를 들어 섬모류, 곤충 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HKB 세포 (인간 HEK 293 세포주와 인간 버킷 림프종 세포주 2B8의 융합으로부터 생성됨), 하이브리도마 세포 및 또한 줄기 세포가 사용된다.

유닛의 대안적 실시양태에서, 배치식 작동에서의 본 발명에 따라 기재된 세포 분리기 중 하나는, 세포 제거 전에 발효 완료시, 필터에 적용할 세포 질량 및 이에 따라 요구되는 필터 표면적을 감소시킬 목적으로 추가의 생물반응기 또는 수확 탱크에 연결된다.

고체, 보다 특히 세포를 유지하고 재순환시키는 방법은, 통상의 Re < 2300에 따른 층류 상태의 보존을 허용하는 유량으로, 흐름이 통과하는 경사진 채널 고체 분리기에 연속 또는 배치 방식으로 공급될 고체-함유 배지 및 제거될 고체-무함유 배지와 함께 상기 경사진 채널 고체 분리기에서 수행되어, 중력장에 대한 분리된 세포의 효율을 감소시키는 재현탁을 회피한다.

레이놀즈 지수 Re는 식 7에 따라, 횡단면에 걸쳐 평균을 낸 유량 w, 흐르는 배지의 동점도 ν 및 채널의 내부 직경 d로부터 계산될 수 있다:

<식 7>

경사진 채널에서, 유량은 채널 중심에서보다 채널 내벽 상에서 더 낮다. 세포는 채널에서 침강하며, 하부 채널 말단으로의 흐름 방향에 대항하여 채널의 밑면 상에서 역슬라이딩한다. 세포가 사라진 세포 배양 용액은 채널에 의해 채널 위에 배열된 수확물 스트림 수집 영역 (56) 내로 방출되어, 결국 용기로부터 운반된다.

본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 생물반응기 외부에서 수행될 수 있다. 이를 위해, 세포를 함유하는 세포 배양 용액은 생물반응기로부터 본 발명에 따른 세포 분리기 내로 운반된다. 바람직하게는, 세포의 대사를 늦추고 이에 따라 생산성을 감소시키는 영양부족에 대응하기 위해, 세포는 분리기에 진입하기 전에 외부 용기에서 냉각된다. 냉각된 현탁액에서, 침강하는 세포에 산소를 공급하는 것은 요구되지 않는다. 대부분의 경우에, 세포 배양 용액을 분리기의 주위 온도로 냉각시키는 것으로 완전히 충분하므로, 목적하는 대사 효과 이외에도 대류가 안전하게 회피된다. 세포의 충분한 영양을 모니터링하기 위해, 분리기에는 예를 들어 산소 농도 및/또는 pH를 측정하기 위한 적어도 1개의 일회용 센서가 제공될 수 있다. 센서의 수용은 생물반응기 또는 수확 용기의 벽 및 연결 라인 둘 다에서 가능하다.

상기 방법은 흐름이 연속적으로 통과하는 멸균 플라스틱 백에서의 세포의 효과적인 유지 및 재순환을 허용한다. 유지 및 재순환 동안, 세포는 통상적으로 세포에 의해 양호하게 허용되는 적당한 전단력에 의해서만 영향을 받는다. 세포는 발효 온도 또는 감소된 온도 수준으로 분리 장치에서 유지되고, 영양소의 공급이 제공된다.

본 발명의 예시적 실시양태는 이하에서 본 발명을 그에 제한하지 않으면서 도면과 관련하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.

도 1. 플레이트 스택을 함유하는 본 발명에 따른 일회용 고체 분리기를 보여주는 다이어그램.

도 2 플레이트 스택 (1)을 보여주는 다이어그램 (종단면)

도 3 플레이트 스택 (1)을 보여주는 다이어그램 (종단면)

도 4 다양한 플레이트 스택 구축의 다이어그램 (도 3으로부터의 횡단면 AA')

도 5 플레이트 스택 (1)에 대한 플라스택 백 (50) 적용의 다이어그램 (도 3으로부터의 횡단면 AA')

도 6 및 도 7 플레이트 스택 (1) 상의 플라스틱 백 (50)의 조임 및 고정 (횡단면)

도 8 및 도 9 프레임워크 (130) 및 덮개 (110)를 사용한 플레이트 스택 (1) 상의 플라스틱 백 (50)의 대안적 조임 및 고정 (횡단면)

도 10 프레임 (140) 상의 플레이트 스택 (1)을 함유하는 본 발명에 따른 고체 분리기의 측면도.

도 11 프레임 (140) 상의 플레이트 스택 (1)을 함유하는 본 발명에 따른 고체 분리기의 정면도.

도 12 프레임워크 (130) 및 덮개 (110)를 갖는 프레임 (140) 상의 플레이트 스택 (1)을 함유하는 본 발명에 따른 고체 분리기의 종단면.

도 13 프레임워크 (130) 및 덮개 (110)를 갖는 그의 프레임 (140) 상의 플레이트 스택 (1)을 함유하는 본 발명에 따른 고체 분리기의 정면도.

도 14 그의 콘솔 상의 본 발명에 따른 고체 분리기의 종단면, 부감도, 횡단면 (A-A, C-C) 및 확대도 (D).

도 15 그의 콘솔 상의 본 발명에 따른 고체 분리기를 보여주는 3차원 다이어그램

도 16 관류 반응기의 공정 다이어그램. 생물반응기 유출구에서 세포의 호흡 활성을 감소시키기 위해, 제거 후에 가능한 한 빠르게 냉각 장치에서 그의 온도를 보다 낮은 수준으로 저하시킨다. 이는 세포 분리기 내의 세포가 생리학적으로 세포를 손상시킬 수 있는 산소-제한 상태에 너무 길게 머무는 것을 방지한다. 나타낸 예에서, 분리기 (640)는 분리 백 (620) 및 통합된 냉각 장치 (600)로 이루어진다. 액체는 생물반응기 (610) 사이로 흐르고, 분리기 (640)는 저전단 펌프 (630) 및 (631)에 의해 조정된다. 다른 연결, 예를 들어 생물반응기 유출구에서의 2개의 펌프 (630) 및 (631) 중 하나의 위치설정도 또한 상상할 수 있다.

1 플레이트 스택 / 분리기 표면 구역
5 버팀대 폭
8 플레이트 간격
10 각도
13 길이
15 폭
18 높이
30 지지 플레이트
50 플라스틱 백
52 잉여 / 폴드
55 용접 솔기
56 수확물 스트림 수집 영역
57 고체 수집 영역
58 각도
59 각도
60 고정 스트랩
70 수확물 스트림 (수확물)
74 생물반응기 혼합물 / 공급물
79 재순환
80 피드-스루
81 흐름 변환기
84 피드-스루
85 수평 분배기
86 유입 흐름
88 중심 흡입 포트
89 피드-스루
90 연결 플레이트
100 하우징
110 덮개
112 확장부
115 고정 요소
130 프레임워크
140 프레임
142 돌출부
145 프레임 바닥
148 지지부
200 진동기
210 어셈블리 플레이트
플레이트 스택의 프로파일
311 플레이트 스택
320 직사각형 프로파일
321 플레이트 스택
330 원형 프로파일
331 플레이트 스택
340 원형 프로파일
341 플레이트 스택
350 6각 프로파일
351 플레이트 스택
500 수집기
510 플러그 플레이트
520 깔때기
530 보강 브래킷
540 웹-플레이트 기저체
550 콘솔
600 냉각 장치
610 생물반응기
620 분리 장치
630, 631 펌프
640 분리기 = 분리 백 + 아마도 프레임 또는 용기에 통합된 냉각 장치.
650 배양 배지
본 발명으로 이어진 연구는 유럽 지역 발전 기금 (ERDF)의 일부로서의 지원 협정 "Bio.NRW: MoBiDik - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich" (Bio.NRW: MoBiDik - Modular bioproduction - Disposable and Continuous) (지원 번호 w1004ht022a)에 따라 투자받았다.

Claims

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하기 요소
- 세포로부터 분리된 수확물 스트림 (70) (=수확물)을 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로부터 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루/이음부 (80)를 갖는 고체 분리기의 상부 영역, 이것이 연결되어 있는
- 작동 동안 수평선에 대해 30° 내지 80°의 각도 (10)로 기울어지는 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트로 구성된 플레이트 스택 (1)에 의해 형성된 분리 영역, 이것이 연결되어 있는
- 반응기 혼합물 (74)의 흐름 분배를 위한 1개 이상의 피드-스루 또는 이음부 (84)를 갖는 고체 분리기의 하부 구획, 이것 아래의
- 중력에 의해 세포를 수집하기 위한 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)
을 포함하고,
여기서 웹 플레이트는 접착제 접합에 의해 연결된 것인,
반응기 혼합물로부터 고체를 유지하고 재순환시키기 위한 경사진 채널 고체 분리기.
제2항에 있어서, 고체 수집 영역 (57)이 원추형 또는 피라미드형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 것인 경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 있어서, 고체 수집 영역 (57)이 고체를 제거하기 위한 1개 이상의 피드-스루 (89) 또는 이음부 (88)를 갖는 것인 경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 있어서, 내부에 적어도 1개의 일회용 센서를 포함하는 경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 있어서, 분리 영역이 플레이트 스택 (1) 내에서 서로의 옆에 배열된 다수의 채널로 이루어진 것인 경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 있어서, 버팀대 높이 대 채널 폭의 비 hs/d가 0.01 ≤ hs/d ≤ 5이고, 여기서 2개의 치수 hs 및 d는 둘 다 3 mm 이상으로 제한되는 것인 경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 있어서, 흐름이 통과하는 감마-멸균가능한 플라스틱 백 (50)을 포함하고, 플라스틱 백 (50) 내에
- 플라스틱 백 (50)의 상부 영역에 있는, 고체로부터 분리된 수확물 스트림 (70)을 수확물 스트림 수집 영역 (56)으로부터 제거하기 위한 피드-스루/이음부 (80),
- 플라스틱 백 (50)의 중심 영역의 상부 구획에 있는, 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트로 구성된 플레이트 스택 (1)을 갖는 분리 영역,
- 플라스틱 백 (50)의 중심 영역의 하부 구획에 있는, 인피드 표면 구역 (510)을 통한 세포 배양 용액 (74)의 균일한 수평 흐름 분배를 위한 수평 분배기 (85)를 갖는 피드-스루 또는 이음부 (84),
- 플라스틱 백 (50)의 하부 영역에 있는, 중력에 의해 고체를 수집하기 위한 원추형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)
을 포함하는 경사진 채널 고체 분리기.
제8항에 있어서, 채널이 플라스틱 백의 길이 LK의 30% 내지 95%의 채널 길이 L을 갖는 것인 경사진 채널 고체 분리기.
제8항에 있어서, 고체 분리기를 수용하기 위한 용기를 포함하며, 여기서 용기는 고체 분리기를 수용하기 위한 적어도 하나의 내부를 갖고, 여기서 상기 내부는 고체 분리기의 형상에 의해 고체 분리기의 형상에 맞추어진 벽을 포함하고, 벽은 내부를 둘러싸고 이것과 외부 세계, 즉 고체 분리기를 위쪽으로부터 용기 내로 도입시키기 위한 개구부의 경계를 표시하는 것인, 경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 있어서,
- 고체 분리기의 상부 영역이 수확물 스트림 수집 영역 (56)을 갖는 수집기이고, 이것이
- 단층 또는 다층 플라스틱 웹 플레이트로 구성된 플레이트 스택 (1)에 의해 형성된 분리 영역에 연결되어 있고, 이것이 상단 및 하단에 있는 플러그 플레이트에 플러깅되는 웹-플레이트 기저체를 형성하고, 이것이
- 반응기 혼합물 (74)의 흐름 분배를 위한 1개 이상의 피드-스루 또는 이음부 (84)를 갖는 고체 분리기의 하부 구획에 연결되어 있고, 이것 아래에
- 중력에 의해 세포를 수집하기 위한 원추형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)이 있고,
- 여기서 하부 구획 및 원추형 방식으로 아래쪽으로 점차 가늘어지는 고체 수집 영역 (57)이 깔때기이며,
- 고체 분리기의 모든 요소가 플라스틱으로 구성된 것인
경사진 채널 고체 분리기.
제2항 또는 제3항에 청구된 바와 같은 경사진 채널 고체 분리기에 연결되어 있는 생물반응기를 포함하는 생물반응기 유닛.