CN102190704B - 蛋白层析系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白层析系统,包括若干层析柱和至少一条主干道管路,所述的每一个层析柱的柱前和柱后分别通过电动切换阀与主干道管路相连;所述的主干道管路还通过清洗泵连通清洗剂。所述的主干道管路为至少2条以上,分别通过电动切换阀连接至总干道管路,形成一套组合的多系统。主干道管路清洗泵可以定期将清洗剂泵入主干道管路,从而保持主干道管路的清洁,以确保蛋白质分离过程不被热原等物质污染、或多次使用之间的相互交叉污染。该系统可以让多个柱子同时工作,缩短工艺时间,增加设备的处理量和速度,可以快速进行蛋白质以及各种生物大分子的分离纯化,从动植物、微生物和基因工程发酵产物中获得蛋白药物、酶、抗体、疫苗等产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程产物分离纯化设备,具体涉及一种高通量多层析柱组合的蛋白层析系统。
背景技术
层析技术是现代化学工程和生物化工分离工艺中经常用到的单元操作。对于成分复杂的蛋白混合物(如血浆产品),分离其中有效成分难度大,工艺复杂,耗时多,分辨率差,效率低。在分离过程中通常要用到多根层析柱和多种互补的层析模式,包括离子交换、疏水、亲和、凝胶过滤和反相层析。使用传统的蛋白层析系统,在常规的操作中,每根层析柱分离的组分需要收集后,再注入下一根层析柱,在此过程中需要进行人工的换柱,造成分离速度慢,操作繁琐复杂,并且样品暴露在空气中,容易造成污染和活性损失。
目前国内外公司传统的蛋白层析系统在不同分离模式更换中存在层析柱的拆卸繁琐、多柱层析难以组合等问题,并且在流速范围、拓展性、层析柱兼容性等方面存在缺陷。
近年来国内外提出了一些多柱组合的层析系统,这些系统可以概括为两类:1)并联多柱层析系统,在单台系统上并联多根层析柱,所有层析柱同时工作,但进行的是相同的操作,如中国专利号为200720073590.6所公开的,这类系统只能提高层析的通量,而无法实现多种模式的分离;2)串联多柱层析系统,层析柱之间通过电动切换阀直接进行切换,即组分从一根层析柱直接通过电动切换阀注入另一根层析柱,如中国专利申请号为200910131502.7所公开的,每根层析柱只能依次按顺序进行操作,并且在同一时间只有一根层析柱在工作,这类系统通常只能连接二到三根层析柱,能采用的层析模式有限。
发明内容
本发明的目的是,鉴于传统设备难于短时间内分离多目标蛋白的缺陷,从而提供一种蛋白层析系统,该系统可组合多种分离模式,兼具任务多样化和分离过程高通量化的特点。
为实现上述目的,本发明提供了一种蛋白层析系统,其特征在于,该系统包括若干层析柱和至少一条主干道管路,所述的每一个层析柱的柱前和柱后分别通过电动切换阀与主干道管路相连;所述的主干道管路还通过清洗泵连通清洗剂。所述的层析柱包括:离子交换层析柱、疏水层析柱、亲和层析柱、凝胶过滤层析柱或/和反相层析柱。主干道管路清洗泵可以定期将清洗剂泵入主干道管路,从而保持主干道管路的清洁,消灭可能存在的死角,以确保蛋白质分离过程不被热原等物质污染、或多次使用之间的相互交叉污染。所述的主干道管路为至少2条以上,分别通过电动切换阀连接至总干道管路,形成一套组合的多系统。
作为上述技术方案的一种改进,所述的层析柱的柱前的电动切换阀,用于流动相储罐及其泵与主干道管路之间的切换。
作为上述技术方案的又一种改进,所述的层析柱的柱后的电动切换阀,设置于检测器之后,用于进行产物收集的出口与主干道管路之间的切换。
作为上述技术方案的再一种改进,所述的各个电动切换阀均由计算机工作站控制,实现多根层析柱之间或多条主干道管路之间的自动切换。
作为上述技术方案的一种选择,所述的泵、电动切换阀和检测器均配有RS-232、USB或RJ45接口,与计算机工作站连接并受其控制。
本申请的自动化、高通量、多柱组合的蛋白层析系统,通过一套计算机工作站控制,将多个层析柱集成在一台设备上,所有的层析柱通过一条主干道管路进行有效的连接,实现层析柱之间的自动切换,其中任意一根层析柱分离的组分可以通过主干道管路注入任何其他一根层析柱,进行进一步分离。主干道管路的设计省去了对每根层析柱有效组分的收集,再通过泵或者样品环注入下一根层析柱。层析柱之间实现了管道化联接,避免样品暴露在公气中造成的污染及活性损失。
还可以进一步通过一条总干道管路可以将上述的多个蛋白层析系统进行连接,形成一套组合的多系统,通过总干道管路,可以将其中一台系统分离的组分注入到任何一台其他的系统,不同的层析模式可以顺序、平行以及混合使用。
本发明的优点在于,该蛋白层析系统可以让多个柱子同时工作,缩短工艺时间,增加设备的处理量和速度。并且,可以通过计算机工作站控制设备,软件编辑方法,实现自动化操作。该系统包含了离子交换、疏水、亲和、凝胶过滤、反相等多种蛋白层析操作模式,多根层析柱之间通过切换能进行并联、串联和混联操作,可以快速进行蛋白质以及各种生物大分子的分离纯化,从动植物、微生物和基因工程发酵产物中获得蛋白药物、酶、抗体、疫苗等产品。
附图说明
图1为根据本发明的高通量多柱组合蛋白层析系统的实施例的示意图。
图2为本发明的层析系统中单根层析柱的流路连接示意图。
图3为本发明的层析系统的层析柱之间通过主干道管路进行切换的示意图。
图4为本发明的HTPS智能化层析工作站的软件界面图。
图5a为现有技术中纯化干扰素α2b的复性蛋白溶液的流程图。
图5b为利用本发明纯化干扰素α2b的复性蛋白溶液的流程图。
图6为利用本发明纯化干扰素α2b的复性蛋白溶液的层析谱图。
图7为利用本发明纯化血浆微量药用蛋白的流程图。
图8为利用本发明纯化血浆微量药用蛋白的层析谱图。
具体实施方式
下面将参考附图对本发明的实施例进行详细的介绍。
图1是根据本发明的高通量多柱组合蛋白层析系统的实施例的示意图。在图1中显示了4根层析柱通过一条主干道管路连接的流路,这些层析柱可以装填离子交换、疏水、亲和、凝胶过滤或反相层析等的任意一种层析介质,从而进行离子交换、疏水、亲和、凝胶过滤或反相层析等多种蛋白层析操作模式。
图2为图1中每一根层析柱的流图连接,流动相储罐可以存储洗脱液、再生液、平衡液、淋洗液或者料液,通过泵注入层析柱,层析柱出口与紫外检测器连接,在线检测流出的组分。
层析柱前和柱后都有电动切换阀与主干道管路相连,柱前电动切换阀可以选择来自泵或者主干道管路的液体,柱后电动切换阀可以选择将从层析柱流出的组分切换到出口进行产物收集,或者切换入主干道管路。主干道管路清洗泵可以定期将清洗剂泵入主干道管路,从而保持主干道管路的清洁,消灭可能存在的死角,以确保蛋白质分离过程不被热原等物质污染。
图3显示了本发明实施例的层析柱之间如何通过主干道管路进行串联,第1根层析柱的柱前电动切换阀和泵相连,柱后电动切换阀和主干道相连,在泵的推动下,分离组分切换入主干道管路,第2根层析柱的柱前电动切换阀和主干道管路相连,从第1根层析柱分离的组分由主干道注入到第2根层析柱,第2根层析柱的柱后电动切换阀连接到出口。同样,第2根层析柱的组分也可以通过主干道管路,注入第3根层析柱。由此可以推广到任意两根层析柱之间的串联。
整个系统通过一套计算机工作站控制,图4为本实施例的HTPS智能化层析工作站软件界面示意图。泵、电动切换阀和检测器配有RS-232接口,与层析工作站连接并受其控制。利用层析工作站可以进行系统的控制、层析方法编辑和运行、数据采集和处理,通过层析工作站进行层析方法编辑并运行,系统可以自动进行多柱组合蛋白层析操作。
应用上述本发明的高通量多柱组合蛋白层析系统,进行了干扰素α2b复性蛋白溶液的纯化。
图5a和b为现有的单柱蛋白层析系统和本发明的高通量多柱组合蛋白层析系统进行干扰素α2b复性蛋白溶液的纯化的步骤对比示例。
如图5a所示,干扰素α2b复性蛋白溶液由以下方法获得:干扰素α2b工程菌株接种于装有3ml液体LB培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)的试管中,37℃摇床240rpm培养过夜。次日将其转入装有100ml LB培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)的500ml摇瓶中,同样条件下培养4小时后转接二级种子液。OD600达1.0时按5%的比例,接入含60L发酵培养基的100L发酵罐继续培养,37℃,通气量为1.2vvm,转速400rpm。菌体进入对数生长期后加入1mM IPTG开始诱导,诱导5hr后停止。收集菌体(3,900rpm,4℃,30min),取一定量细胞,以1∶6(w∶v)的比例用25mM Tris-HCl(pH 8.3)充分悬浮,在冰浴中超声破碎。离心收集包涵体沉淀(12,000rpm,4℃,30min)。之后用包涵体洗涤液(2M尿素+2mM巯基乙醇+1mMEDTA-Na+0.5%Triton X-100)充分悬浮沉淀,洗涤包涵体,12,000rpm,离心30min。共洗涤包涵体3次。取一定量的包涵体,按1∶10(w∶v)的比例加入变性剂(6M盐酸胍+1%巯基乙醇(临用时加)+1mM EDTA-Na+25mM Tris-HCl,pH 8.3)。磁力搅拌数小时。12,000rpm,离心30min后收集上清,以1∶100(v∶v)比例加入4℃预冷的复性缓冲液(25mM Tris-HCl,pH 8.3,1mM EDTA-Na,0.5M精氨酸)中,充分搅拌,然4℃放置20小时,得到干扰素α2b复性蛋白溶液。
采用单柱蛋白层析系统分离纯化干扰素α2b复性蛋白溶液时先用阴离子交换介质DEAE,洗脱液用乙酸调pH4.5后透析脱盐,然后用阳离子交换介质CM进一步纯化,CM洗脱样品用低浓度磷酸盐缓冲液透析,脱盐同时将pH值置换到7.0,最后进行冷冻干燥。在这个过程中,由于干扰素等电点在6.0左右,DEAE洗脱样品的pH8.3,在透析脱盐之前需将pH快速调过干扰素素的等电点。在调节过程中,由于局部盐浓度过高,或者操作稍有不慎,极易形成蛋白沉淀,降低蛋白收率。同时透析过程需要中途多次更换缓冲液,并通常需要过夜,由于时间较长,透析过程还会造成干扰素活性收率下降。
图5b所示,对比采用高通量多柱组合蛋白层析系统,纯化干扰素α2b复性蛋白溶液步骤如下:
(1)干扰素α2b复性蛋白溶液500mL用泵以5mL/min流速进入DEAESepharose FF离子交换层析柱(1.6×10cm),20mM Tris-Cl,pH 8.3平衡,20mMTris-Cl+1M NaCl,pH 8.3洗脱;
(2)DEAE Sepharose FF离子交换层析柱洗脱峰对应的组分通过主干道管路注入Sephadex G25凝胶过滤层析柱(2.6×15cm)进行置换缓冲液,5mL/min流速,20mM NaAc-HAc,pH 4.5洗脱;
(3)Sephadex G25凝胶过滤层析柱洗脱峰对应组分通过主干道管路注入CMSepharose FF离子交换柱(1.6×10cm),5mL/min流速,20mM NaAc-HAc,pH 4.5平衡,20mM NaAc-HAc+1M NaCl,pH4.5洗脱;
(4)CM Sepharose FF离子交换柱洗脱峰对应组分通过主干道管路注入SuperdexG75凝胶过滤柱(2.6×20cm),5mL/min流速,2mM PBS,pH7.0洗脱。
图6为采用高通量多柱组合蛋白层析系统,纯化干扰素α2b复性蛋白溶液的层析谱图。
利用系统优势在DEAE和CM以及冷冻干燥前添加G25脱盐柱,整个纯化过程连贯进行。在柱组合蛋白层析系统条件下纯化干扰素的复性蛋白溶液时,DEAE洗脱组分通过主干道管路直接切换到已提前平衡的脱盐柱,这个过程与收集DEAE洗脱峰再用泵进料到脱盐柱相比,可大大加快层析过程,避免样品暴露在空气中所造成的活性损失,同时减少后者用泵进料所带来的峰扩散。
通过本实施例的高通量多柱组合蛋白层析系统纯化干扰素α2b复性蛋白溶液,产物的纯度达到了99%,蛋白收率和活性收率分别达到了47%和65%,相对于采用单柱蛋白层析系统,人工换柱结合透析脱盐的方式,蛋白收率和活性收率分别只有23%和29%,均提高了一倍以上。
本发明所述的高通量多柱组合蛋白层析系统可通过平行增加层析柱的数量实现多样品的平行分离或同样品多组分顺序分离,不仅仅局限于上述实施例所述的4柱组合层析系统。
另外,可以通过1条总干道管路分别与多台蛋白层析系统进行连接,形成一套组合的多系统,通过对多条主干道管路的连通控制,可以将其中一台系统分离的组分注入到任何一台其他的系统,不同的层析模式可以顺序、平行以及混合使用,通过HTPS智能化层析工作站软件对组合的多系统同时进行控制、数据采集和处理。
应用本发明所述的这种组合的多系统,以血浆蛋白制备低温乙醇工艺的废弃组分IV为原料,进行了白蛋白、AT-III、α1-AT、运铁蛋白、结合珠蛋白五种蛋白药物的纯化。图7为整个纯化步骤的示意图。
在本实施例中,组合了3台本发明所述的蛋白层析系统,第1台包括4根层析柱,第2台和第3台各包括3根层析柱。每台系统都包含各自的主干道管路,可以实现系统内层析柱之间的切换,将某根层析柱分离的组分注入任何其他一根层析柱;3台系统之间通过总干道管路进行连接,通过这条总干道管路可以将其中1台系统分离的组分注入任何其他1台系统。
纯化的整个步骤如下:
(1)血浆蛋白制备低温乙醇工艺的废弃组分IV经15%PEG4000沉淀后,离心取上清,用泵以10mL/min流速进料70ml至第1台系统的Sephadex G25凝胶过滤层析柱(5.0×18cm),用含1.6M硫酸铵的20mM pH7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗;洗脱峰对应的组分通过主干道管路注入Octyl Sepharose FF疏水层析柱(2.6×15cm),用含1.6M硫酸铵的20mM pH7.0的磷酸盐缓冲溶液淋洗,穿透峰对应组分通过总干道管路注入第2台系统的Sephadex G25凝胶过滤层析柱(5.0×18cm);Octyl SepharoseFF疏水层析柱再用50%梯度的20mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱,洗脱出峰对应组分通过总干道管路注入第3台系统的Sephadex G25凝胶过滤层析柱(5.0×18cm);Octyl Sepharose FF疏水层析柱最后用100%梯度的20mM pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱,洗脱峰对应的组分通过主干道管路注入本系统的Sephadex G25凝胶过滤层析柱(5.0×18cm),用20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗,洗脱峰对应的组分通过主干道管路注入本系统Heprin Sepharose FF肝素亲和层析柱(2.6×8.0cm),穿透峰收集,得到纯度为99%的白蛋白,用30%的含2M氯化钠的20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗去杂蛋白,用100%的含2M氯化钠的20mMpH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱,得到纯度为99%的AT-III。
(2)第2台系统的Sephadex G25凝胶过滤层析柱(5.0×18cm),接受从第1台系统的Octyl Sepharose FF疏水层析柱通过总干道注入本系统的组分后,用20mMpH 7.5的Tris-HCl缓冲液冲洗,洗脱峰对应的组分通过主干道管路注入本系统DEAESepharose FF离子交换层析柱(1.6×23cm),用30%梯度的含0.5M氯化钠的20mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱,洗脱峰对应组分通过主干道管路注入Superdex G75凝胶过滤柱(2.6×30cm),用20mM pH7.0的磷酸盐缓冲溶液析脱,得到纯度为99%的运铁蛋白。
(3)第3台系统的Sephadex G25凝胶过滤层析柱(5.0×18cm),接受从第1台系统的Octyl Sepharose FF疏水层析柱通过总干道注入本系统的组分后,,用20mMpH 7.5的Tris-HCl缓冲液冲洗,洗脱峰对应的组分通过主干道管路注入本系统的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱(1.6×23cm),穿透峰收集后得到纯度为95%的α1-AT,用20%含0.5M氯化钠的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗去杂蛋白,用50%含0.5M氯化钠的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱,洗脱峰对应组分通过主干道管路注入Superdex G75凝胶过滤柱(2.6×30cm),用20mM pH7.0的磷酸盐缓冲溶液析脱,得到纯度为95%的结合珠蛋白
图8为采用本发明组合的蛋白层析系统,以血浆蛋白制备低温乙醇工艺的废弃组分IV为原料纯化白蛋白、AT-III、α1-AT、运铁蛋白、结合珠蛋白五种蛋白药物的层析谱图。整个过程用时140分钟,加上平衡和再生,系统可以不到3个小时的时间完成5种蛋白的提纯,如果采用收集洗脱峰,人工换柱层析的方式,则至少需要3天。
从以上测试可以看出,本发明所述的高通量多柱组合蛋白层析系统,进行蛋白的分离纯化时,可组合多种分离模式,兼具任务多样化和分离过程高通量化的特点,不仅可以缩短层析分离的时间,减少工作量,同时能增加单位时间内可分离的目标蛋白的种类。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,都不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种蛋白层析系统,其特征在于,该系统包括若干层析柱和至少一条主干道管路,所述的每一个层析柱的柱前和柱后分别通过电动切换阀与主干道管路相连,任意一根层析柱分离的组分能通过主干道管路注入任何其他一根层析柱,进行进一步分离,层析柱之间通过切换能进行并联、串联和混联操作;所述的主干道管路还通过清洗泵连通清洗剂;
所述的主干道管路为至少2条以上,分别通过电动切换阀连接至总干道管路,形成一套组合的多系统;
所述的层析柱的柱前的电动切换阀,用于流动相储罐及其泵与主干道管路之间的切换;
所述的层析柱的柱后的电动切换阀,设置于检测器之后,用于进行产物收集的出口与主干道管路之间的切换。
2.根据权利要求1所述的蛋白层析系统,其特征在于,所述的各个电动切换阀均由计算机工作站控制,实现多根层析柱之间或多条主干道管路之间的自动切换。
3.根据权利要求2所述的蛋白层析系统,其特征在于,所述的泵、电动切换阀和检测器均配有RS-232、USB或RJ45接口,与计算机工作站连接并受其控制。
4.根据权利要求1所述的蛋白层析系统,其特征在于,所述的层析柱包括:离子交换层析柱、疏水层析柱、亲和层析柱、凝胶过滤层析柱或/和反相层析柱。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |