CN1137897C - 重组人血小板生成素制剂的制备生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大规模生产重组人血小板生成素的制剂方法。该方法包括用特殊培养基，在特定培养条件下培养携带有编码人血小板生成素蛋白基因序列的被转化的哺乳动物细胞，以获得该蛋白质产物的高表达收获液。然后对富含人血小板生成素的收获液依次进行离子交换层析、反相高效液相层析及凝胶过滤纯化，以获得纯度高并具有高生物活性的重组人血小板生成素。

Description

重组人血小板生成素制剂的制备生产方法

本发明涉及利用携带编码人血小板生成素蛋白质的核苷酸序列的真核细胞表达系统，大规模生产重组人血小板生成素蛋白质的方法。特别是涉及以高产率为目的的分离和纯化高比活性人血小板生成素的方法。

人血小板生成素(hTPO)是一种刺激血小板前体——巨核细胞生长成熟及分化的一种细胞因子，是分子量为70-100千道尔顿的一种糖蛋白。该蛋白质作为一种正常激素，可刺激巨核细胞前体细胞的增殖和分化，并促进巨核细胞成熟，使其形态变大并多倍体化，并进一步产生血小板。因此临床上可用于治疗多种原因引起的血小板减少。美国专利号NO.5,986,049(ZymoGenetics，Seattle，USA)和美国专利号NO.5,744,587(ZymoGenetics，Seattle，USA.)分别公开了以亲和层析法纯化血小板生成素的方法，前者使用亲和层析和离子交换层析对哺乳动物的血小板生成素进行了纯化，所得TPO纯度达到90％以上。后者以吸附法、亲和层析和疏水层析法制备由BHK细胞表达的人血小板生成素，由700升收获培养基中获得了250毫克蛋白。

综上所述，这些现有材料所描述的工艺或者纯度达不到临床使用的要求，或者工艺复杂，产率较低，均不能获得令人满意的效果。特别是要以高收率、低成本获得高比活性的基因工程产品，对表达系统的选择，培养方法的确定，纯化工艺的建立等方面需进行深入研究和长期验证，否则要真正实现人血小板生成素的商品化并获取应有的利益将是不可能的。

迄今为止，已建立并在生产实践中成功地使用了许多从天然来源或从以DNA重组技术制备的转化体细胞及其培养物中分离和纯化所需目的产物的方法，这些方法包括盐析、超滤、电泳(如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、毛细电泳等)、柱层析(如离子交换层析、凝胶层析、高效液相层析、亲和层析等)。由于所需产物分子量大小、带电性和分子电荷数目、亲水性及等电点的不同，改变在分离和纯化产物时所需的方法或方法组合及它们的次序也将完全不同。因此在找到一套适合工业化生产规模使用的对重组菌株或细胞株的发酵培养条件，以提高产物表达效率，并且改进分离和纯化DNA重组产物，如目前已在临床应用中证实其效果十分显著的重组人血小板生成素(rhTPO)的方法，是一个本领域有待解决的问题。

本发明是通过采用本实验室构建的携带编码人血小板生成素蛋白质的核苷酸序列的真核细胞(CHO细胞)为表达系统，中国专利公开号为：CN1127785A，利用特定的培养基和培养条件及连续柱层析方法来实现的。其技术方案要点包括以下步骤：

取冻存的生产细胞株，39℃水浴，在无菌操作下离心。弃上清后加入适量的含5-20％胎牛血清的合成培养基，所使用的合成培养基是α-MEM培养基，还可以是DMEM培养基，F12培养基。并接种于细胞培养瓶中，在二氧化碳孵箱中37℃培养。待细胞生长良好并贴满培养瓶壁后，继续传代(传三代)培养。用显微镜观察细胞的状态，在细胞呈梭形，生长状态良好时，弃去旧培养基，用消化液将细胞消化，收集于接种瓶中。用于接种的细胞数量为2.5×10⁶个/毫升。

含人血小板生成素基因的重组细胞株的表达采用连续型细胞反应器(以下简称细胞罐)，加入纤维素载体片(Disc)、PBS缓冲液(pH6.5-7.5)，连好管路，高压灭菌。待细胞罐冷却至室温后接入主机，并连接空气、氧气、二氧化碳、氮气等四种气体。校正好pH电极和溶氧电极后，排出细胞罐内的PBS缓冲液，加入含5-20％胎牛血清的合成培养基，再将细胞接种液缓慢加入细胞罐中，调节搅拌转数为50转/分钟，温度为36-38℃，通入四种气体，控制溶氧在30-80％，pH6.5-7.5，进行贴壁培养一段时间。然后提高转数到80-100转/分钟，进行细胞罐内扩增培养7-12天。(有血清培养基可有效刺激细胞的分化和增殖)。将含胎牛血清的合成培养基更换为无蛋白的合成培养基，所使用的无蛋白培养基是BPT-6培养基，还可以是CD CHO Medium，CHO-III-PFM。用连续灌流培养基的培养方法，应用AFS软件控制细胞的发酵条件，包括温度、溶氧、pH值等。收获的培养基于4-8℃低温贮藏。本生产条件下收获的培养基中rhTPO的表达产量可达到1万工作单位/毫升培养液(相当于40毫克rhTPO蛋白/升培养液)。同时应用无蛋白的合成培养基可降低纯化过程中杂蛋白质的含量，增加各层析色谱柱的容量，延长其使用寿命，有效提高半成品的纯度。

取收获的培养基用滤膜过滤，以PELLICON超滤系统，10,000或30,000MWCO超滤板浓缩5-10倍。然后以15-20倍体积的pH5.5-6.5，10-20mM的缓冲液脱盐，所使用的缓冲液是柠檬酸缓冲液，还可以是磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液。浓缩脱盐液以一定的流速上预先用pH5.5-6.5，10-20mM的上述缓冲液平衡的阳离子交换层析柱，所使用的阳离子交换介质是SP Sepharose FF，还可以是CM Sepharose FF，Source15S，Source 30S，SP Sepharose HP。再用平衡缓冲液平衡层析柱。先用5-15倍柱体积含有0.05-0.2M NaCl的平衡缓冲液冲洗柱子，再用含0.05-0.2M NaCl和0.2-0.8％tween20和2-6M脲和0.5-1.5mM甘氨酸的平衡缓冲液洗脱，收集的洗脱峰直接上凝胶层析柱脱盐，所使用的凝胶层析介质是Sephadex G-25 Medium，还可以是Sephadex G-25Coarse，Sephadex G-25 Fine，Sephadex G-25 Superfine，Sephadex G-50Coarse，Sephadex G-50 Medium，Sephadex G-50 Fine，Sephadex G-50Superfine，用pH6.5-7.5，含10-30μM硫酸铜的10-20mM缓冲液洗脱，所使用的缓冲液是Tris-HCl缓冲液，还可以是磷酸盐缓冲液，柠檬酸缓冲液，收集洗脱峰。洗脱峰直接上预先以上述缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，所使用的层析介质是Q Sepharose FF，还可以是DEAESepharose FF，Source 15Q，Source 30Q，Q Sepharose HP。上样结束后先用2-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，再用3-10倍柱体积的含4-8M脲和0.5-1.5mM甘氨酸和2-6mM醋酸和10-30μM硫酸铜的溶液冲洗，最后以3-10倍柱体积的含0.08-0.25M NaCl的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱峰，加入EDTA至终浓度0.5-1.5mM，放置过夜。反相高效液相层析柱(孔径300，粒度12-15μm)用A液(含0.01-0.03％tween20和5％异丙醇的10-20mM Tris-HCl溶液，pH6.0-7.0，其中的异丙醇还可以是乙醇，乙腈)充分平衡，所使用的反相层析介质是Polymeric C₄Protein，还可以是Sourse 15 RPC，Sephasil Protein C₄。直接泵入阴离子交换柱的洗脱峰样品，以A液洗平，然后用B液(含0.01-0.03％tween20和95％异丙醇的10-20mM Tris-HCl溶液，pH6.0-7.0，其中的异丙醇还可以是乙醇，乙腈)进行梯度洗脱(0％-100％B)，收集30-60％B时的洗脱峰。HPLC活性峰直接上凝胶层析柱，所使用的凝胶层析介质是Sephacryl S-200 High Resolution，还可以是Superdex 200 prep grade，Sephacryl S-300 High Resolution，Superose 12 prep grade，Superose6 prep grade，Sephadex G-150，Sephadex G-200。用含100-200mMNaCl，pH6.4-7.4，10-20mM的缓冲液洗脱，所使用的缓冲液是磷酸盐缓冲液，还可以是柠檬酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液。收集蛋白峰(即rhTPO)。取样测定rhTPO的比活、蛋白含量，经质检合格后将rhTPO中加入稳定剂，所使用的稳定剂是0.25-2％的人血白蛋白，还可以是明胶，聚山梨醇酯类，糊精。无菌过滤后制成rhTPO成品制剂。经本工艺纯化的rhTPO，其纯度可达100％，比活可达到3×10⁵工作单位/毫克蛋白。

工作单位是经依赖细胞测得的体外活性计算而来。

下面借助实施例进一步举例描述本发明，但这些实施例并不以任何方式限制本发明。

实施例一：细胞的增殖

取冻存细胞株，39℃水浴，无菌操作下离心(1000转/分钟×5分钟)。弃上清后加入5毫升含5％胎牛血清的α-MEM培养基(每10升含α-MEM100.2克，胎牛血清500毫升，葡萄糖35克，碳酸氢钠22克)吹打均匀，接种于100毫升细胞培养瓶中，再加10毫升含5％胎牛血清的α-MEM培养基，于37℃、含5％CO₂的二氧化碳孵箱(Forma公司生产)中培养。待细胞生长状态良好，贴满培养瓶壁后，传入四个500毫升培养瓶中，并在细胞再次贴满瓶壁时，传入32瓶500毫升的培养瓶。用显微镜观察细胞生长状态，当细胞处于对数生长期时，弃去旧培养基，用消化液(每升含有EDTA 0.2克，葡萄糖1克，胰酶2克，pH7.6)将细胞消化，收集于接种瓶中。用于接种的细胞数量为2.5×10⁶个/毫升，共900毫升。

实施例二：重组人血小板生成素的表达

细胞罐采用容积为5升的连续型细胞反应器(CELLIGEN PLUS，NBS公司制造)，加入150克纤维素载体片(Disc，LifeGen Inc.生产)、3.5升的PBS缓冲液(pH7.0)，连好管路，在121℃、15磅下高压灭菌1.5小时。待细胞罐冷却至室温后接入主机，连接空气、氧气、二氧化碳和氮气等四种气体，校正好pH电极和溶氧电极。排出细胞罐内的PBS缓冲液，加入2500毫升含5％胎牛血清的α-MEM培养基，再将900毫升细胞接种液缓慢加入细胞罐中，调节转数为50转/分钟，通入四种气体(氧气、氮气、二氧化碳气和压缩空气)，控制溶氧50％，pH7.0，使细胞贴壁生长四小时。然后提高转数到80转/分钟，继续扩增培养十天。将培养基更换成无蛋白的合成培养基(每10升含BPT-6培养基165克，碳酸氢钠24克，丁酸钠0.55克)，用连续灌流培养基的培养方法，应用AFS软件(NBS公司设计生产)控制细胞发酵条件(温度37℃、溶氧50-80％、pH6.8-7.4，培养基灌流量为3升/天)，收获液于4-8℃低温下贮藏。

实施例三：rhTPO的超滤

取收获培养基40升，用1.0微米的预滤器过滤。以PELLICON超滤系统，一块30,000MWCO超滤板在以6升/分钟的流速浓缩至4升。然后在同样的流速下以80升的pH6.0，20mM柠檬酸缓冲液脱盐。

实施例四：阳离子交换层析纯化rhTPO

将浓缩脱盐液上样于体积为1000毫升预先用pH6.0，20mM柠檬酸缓冲液平衡好的SP阳离子交换层析柱，流速20毫升/分钟，用3升的平衡缓冲液平衡SP Sepharose Fast Flow柱。接着先用10升的0.1MNaCl-20mM柠檬酸缓冲液，pH6.0冲洗柱子，再用5升的0.1M NaCl-0.5％tween 20-4M Urea-1mM Gly的20mM Citra洗脱，洗脱流速60毫升/分钟。

实施例五：凝胶层析纯化rhTPO

收集的洗脱峰上4000毫升的Sephadex G-25柱，用20mM Tris-HCl-20μM硫酸铜，pH7.0洗脱，流速40毫升/分钟，收集脱盐峰。

实施例六：阴离子交换层析纯化rhTPO

脱盐峰直接上预先以20mM Tris-HCl，pH7.0平衡好的300毫升的Q Sepharose FF层析柱，上样流速10毫升/分钟，上样结束后先用1升的20mM Tris-HCl，pH7.0冲洗柱子，再用1500毫升的6M Urea-1mMGly-5mM HAc-20μM硫酸铜溶液冲洗，接着用20mM Tris-HCl，pH7.0的平衡液将柱床pH洗至7.0，以1500毫升的0.14M NaCl-20μM硫酸铜-20mM Tris-HCl，pH7.0洗脱，洗脱流速20毫升/分钟，收集洗脱峰，加入EDTA至终浓度1mM，无菌过滤，放置过夜。

实施例七：高效液相层析纯化rhTPO

HPLC柱填料为C₄(孔径300，粒度15μm，Separation Group生产)，柱体积100毫升，先用1000毫升的A液(5％异丙醇-0.01％tween20-10mM Tris-HCl，pH6.4)充分平衡后，直接泵入Q柱的洗脱峰样品，上样流速7毫升/分钟，以500毫升的A液洗平，然后用2000毫升的A液和2000毫升的B液(95％异丙醇-0.01％tween20-10mM Tris-HCl，pH6.4)进行梯度洗脱(0％-75％B)，洗脱流速7毫升/分钟，收集45％异丙醇时的洗脱峰。

实施例八：凝胶层析纯化rhTPO

HPLC活性峰分数次上Sephacryl S-200 High Resolution柱，柱体积375毫升，每次上样5-10毫升，用150mM NaCl-10mM PB(pH6.8)洗脱，洗脱流速3毫升/分钟，收集蛋白峰(即rhTPO)，将几次收集的蛋白峰合并，混合均匀，即得到rhTPO半成品。

实施例九：rhTPO的制剂

取样测定rhTPO的比活、蛋白含量，经质检合格后向rhTPO中加入0.5％的人血白蛋白做为稳定剂，无菌过滤后制成rhTPO成品制剂。

经本工艺纯化的rhTPO，由40升发酵培养液可获得蛋白260毫克，其纯度可达100％，比活可达到3×10⁵工作单位/毫克蛋白。

Claims (16)

1.一种表达人血小板生成素的方法，包括对于含有编码人血小板生成素或其突变蛋白的核苷酸序列的CHO细胞进行培养，其特征在于，先用含有胎牛血清的营养培养基将含有编码人血小板生成素或其突变蛋白的核苷酸序列的CHO细胞接种在细胞罐内扩增培养，再将培养基更换成无蛋白的合成培养基，连续灌流培养。

2.据权利要求1的方法，其中所述的营养培养基是α-MEM培养基，还可以是DMEM、F12培养基，其中含有胎牛血清50-200毫升/升、葡萄糖1-10克/升、碳酸氢钠2-4克/升。

3.根据权利要求1的方法，其中所述的无蛋白培养基是BPT-6培养基，还可以是CHO-III-PFM、CD CHO Medium培养基，其中含有碳酸氢钠2-4克/升、丁酸钠0.01-0.25克/升。

4.根据权利要求1的方法，携带编码人血小板生成素或其突变蛋白核苷酸序列的CHO细胞的表达应用一种可连续培养的生物反应器(CELLIGEN PLUS，NBS公司制造)，用连续灌流培养基的培养方法，应用AFS软件控制细胞的发酵条件，使转数为50-100转/分钟、温度为36℃-38℃、溶氧为30％-80％、pH值为6.5-7.5、灌流速度为每日0.5-15升。

5.一种纯化用权利要求1、2、3、4方法表达的人血小板生成素的方法，包括对权利要求1、2、3、4方法表达出来的发酵液进行分离，其特征在于，发酵液依次经过超滤、阳离子交换层析、凝胶层析、阴离子交换层析、反相高效液相层析和凝胶过滤层析，最终加入人血白蛋白保护剂制成rhTPO成品制剂。

6.根据权利要求5的方法，发酵液首先经过超滤浓缩及脱盐，其中，浓缩倍数为5-10倍，脱盐液为pH5.5-6.5的10-20mM的柠檬酸缓冲液，还可以是磷酸盐缓冲液、Tris.HCl缓冲液。

7.根据权利要求5的方法，其中的阳离子交换介质为SP Sepharose Fast Flow，还可以是CM Sepharose FF、Source 15S、Source 30S、SP Sepharose HP，在阳离子交换层析步骤中使用了含NaCl和tween 20和脲和甘氨酸的柠檬酸缓冲液进行洗脱活性峰，其中的柠檬酸缓冲液还可以是磷酸盐缓冲液、Tris.HCl缓冲液，以使该层析步骤后所得产物的纯度达到20-30％。

8.根据权利要求5或权利要求7的方法，其中的试剂浓度分别为，0.05-0.2M的NaCl，0.2％-0.8％的tween 20，2-6M的脲，0.5-1.5mM的甘氨酸，柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris.HCl缓冲液的浓度为10-20mM，缓冲液的pH值为5.5-6.5。

9.根据权利要求5的方法，其中在阳离子交换层析步骤后，使用了凝胶色谱柱进行脱盐，所使用的凝胶介质是Sephadex G-25 Medium，还可以是SephadexG-25 Coarse，Sephadex G-25 Fine，Sephadex G-25 Superfine，SephadexG-50 Coarse，Sephadex G-50 Medium，Sephadex G-50 Fine，Sephadex G-50Superfine，所使用的缓冲液是Tris.HCl缓冲液，还可以是柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液，浓度为10-20mM，含有10-30μM的硫酸铜，缓冲液的pH值为6.5-7.5。

10.根据权利要求5的方法，其中的阴离子交换介质为Q Sepharose FF，还可以是DEAE Sepharose FF、Source 15Q、Source 30Q、Q Sepharose HP，在阴离子交换层析步骤中，使用了含脲和甘氨酸和醋酸和硫酸铜的溶液洗脱杂蛋白，并用含NaCl和硫酸铜的缓冲液洗脱活性峰，以使该层析步骤后所得产物的纯度达到45-55％。

11.根据权利要求5或权利要求10的方法，在阴离子交换层析步骤中，洗脱杂蛋白的溶液中含有4-8M的脲、0.5-1.5mM的甘氨酸、2-6mM的醋酸、10-30μM的硫酸铜，缓冲液的pH值为4.0-5.0。

12.根据权利要求5或权利要求10的方法，在阴离子交换层析步骤中，洗脱活性峰的缓冲液是Tris.HCl缓冲液，还可以是柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液，浓度为10-20mM，含有0.08-0.25M的NaCl、10-30μM的硫酸铜，缓冲液的pH值为6.5-7.5。

13.根据权利要求5或权利要求10的方法，阴离子交换层析步骤中的活性峰应加入EDTA，加入的浓度为0.5-1.5mM。

14.根据权利要求5的方法，其中反相层析介质为Polymeric C₄ Protein，还可以是Sourse 15RPC、Sephasil Protein C₄，其孔径300，粒度12-15μm，在反相高效液相层析步骤中使用含有tween20和一种有机溶剂的缓冲液进行梯度洗脱，其中的有机溶剂是异丙醇，还可以是乙醇、乙腈，其中的缓冲液是Tris.HCl缓冲液，以使该层析步骤后所得产物的纯度达到95％以上，其中tween20的浓度为0.1-0.3毫克/毫升，Tris.HCl的浓度为10-20mM，有机溶剂的浓度为50-950毫升/升，缓冲液的pH值为6.0-7.0。

15.据权利要求5的方法，其中凝胶过滤层析步骤中使用的介质是SephacrylS-200 High Resolution，还可以是Superdex 200 prep grade、Sephacryl S-300High Resolution、Superose 12 prep grade、Superose 6 prep grade、SephadexG-150、Sephadex G-200，使用了含有NaCl的缓冲液进行平衡和洗脱，以使该层析步骤后所得产物的纯度达到100％，其中NaCl的浓度为100-200mM，缓冲液是磷酸盐缓冲液，还可以是柠檬酸缓冲液、Tris.HCl缓冲液，浓度为10-20mM，缓冲液的pH值为6.4-7.4。

16.根据权利要求5的方法，半成品中加入的保护剂为人血白蛋白，浓度为2.5-20毫克/毫升，还可以是明胶、聚山梨醇酯类、糊精。