CN103555760B

CN103555760B - 一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂

Info

Publication number: CN103555760B
Application number: CN201310491722.7A
Authority: CN
Inventors: 钟正明
Original assignee: JIANGSU KANGHE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: JIANGSU KANGHE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: CN103555760A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂。本发明的制备方法为：设计PCR引物扩增目的基因，构建重组表达质粒，筛选高表达细胞克隆，培养工程细胞，纯化。其中，纯化的步骤为：超滤浓缩、DEAE离子交换层析、Source15反相层析、超滤浓缩、分子筛层析。本发明还涉及一种含有重组人血小板生成素的制剂，所述的制剂为液体制剂，含有重组人血小板生成素、稳定剂和缓冲盐，稳定剂为磺丁基醚β环糊精，浓度为1～2wt%。本发明的方法制备得到的重组人血小板生成素的纯度为98.0～99.9%，活性为3.0×10⁵～3.6×10⁵U/mg，并且重组人血小板生成素的得率提高。

Description

一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂。

背景技术

上世纪50年代，Kelemen等发现并提出体内存在着一种能够刺激血液中血小板生成的体液因子，并命名为Thrombopoietin（TPO），它对巨核细胞系统的发育和成熟有明显促进作用，但由于来源不足和缺乏适当的纯化手段，一直没有得到高纯度的TPO样品，致使几十年来对其研究几乎没有进展。直到1994年，美国、日本等几个研究小组相继报道了人、鼠TPO cDNA的全长序列，并完成了基因克隆、表达、纯化和鉴定。

国际专利WO9518858公开了重组人血小板生成素cDNA序列及合成、所采用的质粒的构建及培养和纯化手段，该专利采用的纯化手段操作工序复杂、产率较低、蛋白纯度不能满足临床需要，700L培养液最后仅获得蛋白250mg，纯度仅能保证90%以上。

专利ZL01126803.4公开了一种新的重组人血小板生成素cDNA序列，该序列前N-39个氨基酸密码子发生了突变，从而可提高重组人血小板生成素的表达，但未见该专利公开其蛋白表达量和纯化方法。

专利ZL00109612.5公开了重组人血小板生成素特定的培养条件、纯化方法和制剂组成，该专利所采用的纯化工艺复杂，需经过超滤、阳离子交换层析、凝胶层析、阴离子交换层析、反相高效液相层析和凝胶过滤层析等多个步骤方可获可药用的蛋白，且最后40L培养液仅获得260mg蛋白，收率较低，不适合大规模生产。

综上所述，目前仍需对表达系统的选择、培养方法的选择、纯化工艺的建立等方面进行深入的研究已获得高收率、低成本的重组人血小板生成素。

专利ZL01126803.4公开了重组人血小板生成素制剂所采用的稳定剂为人血白蛋白，由于国内人血白蛋白资源紧张且存在一定的安全风险，因而我们对稳定剂进行了研究和选择，发现在柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲盐体系下，磺丁基醚β环糊精对重组人血小板生成素有良好的稳定作用。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出了一种重组人血小板生成素的制备方法。

本发明的第二发明目的在于提出了一种重组人血小板生成素的制剂。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

一种重组人血小板生成素的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）设计PCR引物扩增目的基因：将人胚肾细胞获得的TPO-cDNA序列与设计的引物进行

扩增，扩增重组人血小板生成素cDNA序列的PCR引物为：上游引物的核苷酸序列如

SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

（2）构建重组表达质粒：将质粒pL101和扩增得到的TPO-cDNA重组，得到重组pL101/TPO质粒；

（3）筛选高表达细胞克隆：pL101/TPO转化至CHO细胞后通过反复转染、硫氨甲硫氨酸筛选获得高表达的克隆细胞，作为工程细胞；

（4）培养工程细胞；

（5）纯化：培养获得的上清液依次采用第一次超滤、DEAE离子交换层析、Source15反相层析、第二次超滤浓缩、分子筛层析的纯化手段获得重组人血小板生成素。

本发明的第一优选技术方案为：在步骤（4）中，工程细胞的培养条件为：采用ExCell325-PF无血清培养基，葡萄糖的添加量为0.5～1.5g/L，无水碳酸氢钠的添加量为1.0～2.5g/L。

本发明的第二优选技术方案为：在步骤（5）中，DEAE离子交换层析的条件为：用平衡缓冲液平衡层析柱（填料DEAE-Sepharose FF，层析柱规格XK50/100），经过第一次超滤后的样品上柱，流速20～30ml/min；上样完毕，用平衡缓冲液冲洗至UV值接近基线；用洗涤缓冲液洗涤样品，流速为40～50mL/min；用平衡缓冲液平衡柱子，流速40～50mL/min；平衡完毕，用洗脱液洗脱，流速40～50mL/min；收集洗脱过程的紫外峰。其中，平衡缓冲液为20mmol/L PB的溶液，pH7.0；洗涤缓冲液为含有6mol/L Urea、1.2mmol/L甘氨酸、0.6ml/LHAc的混合溶液，所述的洗脱液为含有20mmol/L PB、150mmol/LNacl的混合溶液，pH7.0；用量为3～5个柱体积。

本发明的第三优选技术方案为：在步骤（5）中，Source15RPC反相层析的条件为：用平衡缓冲液平衡Source15RPC反相层析柱，流速20～30mL/min；样品上柱，流速10～20mL/min；用平衡缓冲液冲洗至UV值接近基线，流速20～30mL/min；连续梯度洗脱样品，起始梯度100%Buffer A、0%Buffer B；最终梯度0%Buffer A、100%Buffer B；梯度时间60min，流速30mL/min；收集洗脱梯度从45%Buffer B到75%Buffer B的蛋白洗脱峰；梯度结束，换用梯度，从0%Buffer A、100%Buffer B到100%Buffer A、0%Buffer B，梯度时间10min；BufferA为5mmol/L Tris/Hcl溶液，pH8.5，Buffer B为85%乙醇溶液。其中，平衡缓冲液为5mmol/LTris/HCl的溶液，pH8.5，用量为3～5个柱体积。

本发明的第四优选技术方案为：在步骤（5）中，所述的S-200分子筛层析（填料粒径为10μm～40μm，层析柱规格XK50/100）的条件为：柠檬酸缓冲液平衡柱子，把得到的超滤浓缩液分几次上样，上样体积为柱体积的3～5%，流速为5～10mL/min；上样完毕，用柠檬酸缓冲液洗脱，流速5～10mL/min，收集洗脱峰。其中，柠檬酸缓冲液为含有20mmol/L柠檬酸、150mmol/L NaCl的混合溶液，pH6.9。

本发明的第五优选技术方案为：本发明制备得到的重组人血小板生成素的纯度为98.0～99.9%，活性为3×10⁵～3.6×10⁵U/mg。

本发明还涉及采用制备方法制备的重组人血小板生成素的制剂，所述的制剂为液体制剂，所述的制剂中含有重组人血小板生成素、稳定剂和缓冲盐，所述的稳定剂为磺丁基醚β环糊精，所述的缓冲剂为柠檬酸与柠檬酸钠组成的缓冲体系。

其中，所述制剂中每毫升含有重组人血小板生成素40～80μg、柠檬酸钠5.2～6.6mg、柠檬酸0.04～0.08mg、NaCl5.2～6.6mg、磺丁基醚β环糊精10～20mg；优选含有重组人血小板生成素60μg、柠檬酸钠5.8mg、柠檬酸0.06mg、NaCl5.8mg、磺丁基醚β环糊精10～15mg，pH为6.4～7.4，优选6.8～7.2。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明：

本发明在文献（Genebank L33410,Human c-mpl ligand(ML)mRNA,complete cds）报道TPO的cDNA序列的基础上，从新设计引物，构建新的TPO的cDNA序列，并构建了该重组蛋白的真核细胞表达载体，转染CHO细胞，经大量筛选，获得了一株可稳定高表达重组蛋白的细胞株，表达产物经初步鉴定，确定为完整的目的蛋白分子。在此基础上，本发明开发了相应的CHO细胞无血清高密度连续培养技术，高效表达重组蛋白，根据该蛋白的特性，又开发和优化了下游纯化技术，进行了中试工艺研究，经离子交换层析、反相层析和分子筛层析，获得了纯度和其它主要理化、安全及活性指标满足临床试验用途基本要求的重组蛋白，其纯度在98%以上，原液蛋白表达量在60mg～100mg/L水平，50L培养液可获得纯度98%以上的TPO为800～1200mg。

本发明针对人胚肾细胞获得的TPO-cDNA序列5’-端起始密码子ATG附近的序列及3’-端终止密码后的序列设计PCR引物，示意图如图1所示。

5’-端引物为：5’-ACGCCCGGGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTG-3’；

3’-端引物为：5’-ACGTGATCAT GATGTCGGCA GTGTCTGAGA-3’。

本发明选用表达载体pL101，总长约9kb，该质粒的示意图如图2所示。该质粒带有人巨细胞病毒（CMV）增强子、SV40病毒的加“polyA”信号，另外还有谷氨酰胺合成酶基因作为基因扩增及筛选标志。此外，还有一些在大肠杆菌中扩增质粒所必须的元件，如青霉素抗性基因、原核复制起始点等。该质粒转染至CHO细胞后，在不含有谷氨酰胺的培养基中，加入谷氨酰胺合成酶的抑制剂硫胺甲硫氨酸（MSX），可杀死未转染入该质粒的细胞，从而筛选出含有该质粒细胞克隆。将质粒pL101和扩增得到的TPO-cDNA重组，得到进行Bcl I和smaI双酶切后按照质粒pL101操作说明书将扩增的TPO-cDNA插入到质粒pL101获得pL101/TPO。pL101/TPO转化至CHO细胞后通过反复转染及硫氨甲硫氨酸筛选获得高表达的克隆细胞，作工程细胞。扩增的工程细胞，采用连续灌注悬浮培养工艺，采用ExCell325-PF无血清培养基，添加的葡萄糖量为0.5～1.5g/l，添加的无水碳酸氢钠量为1.0～2.5g/l。培养结束获得的上清液依次采用了超滤、DEAE离子交换层析、Source15反相层析、超滤浓缩、分子筛层析的纯化手段获得纯度大于98%的重组人血小板生成素。

本发明还涉及该重组人血小板生成素的制剂，所述的制剂中含有重组人血小板生成素、稳定剂和缓冲盐，所述的稳定剂为磺丁基醚β环糊精，所述的缓冲剂为柠檬酸与柠檬酸钠组成的缓冲体系，稳定剂的浓度为1～2wt%。其中，所述制剂中每毫升含有重组人血小板生成素40～80μg、柠檬酸钠5.2～6.6mg、柠檬酸0.04～0.08mg、NaCl5.2～6.6mg、磺丁基醚β环糊精10～20mg；优选含有重组人血小板生成素60μg、柠檬酸钠5.8mg、柠檬酸0.06mg、NaCl5.8mg、磺丁基醚β环糊精10～15mg，pH为6.4～7.4。

采用本发明的稳定剂对于人血小板生成素具有非常好的稳定作用，并且价格低廉，安全性高。而普遍采用的人血白蛋白不仅资源紧张，并且具有一定的安全隐患。

附图说明：

图1为PCR引物设计示意图；

图2为质粒pL101结果示意图；

图3为SEC-HPLC检测DEAE离子交换层析收集液的色谱图；

图4为SEC-HPLC检测S-200分子筛层析洗脱液的色谱图。

下面的实施例将对本发明作更具体的解释，但本发明并不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。

实施例1：重组人血小板生成素的制备

1.以下为国外报道的人TPO cDNA序列，针对其5’-端起始密码子ATG附近的序列及3’-端终止密码后的序列设计了一对PCR引物，示意图如图1。

上游引物为：5’-ACGCCCGGGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTG-3’其中CCCGGG为sma I酶切位点；

下游引物为：5’-ACGTGATCAT GATGTCGGCA GTGTCTGAGA-3’其中TGATCA为Bcl I酶切位点。

2.构建重组表达质粒：

将人胚肾细胞获得的TPO-cDNA与设计的引物进行cDNA扩增。表达载体为pL101，总长约9kb，示意图如图2。带有人巨细胞病毒（CMV）增强子、SV40病毒的加“polyA”信号，另外还有谷氨酰胺合成酶基因作为基因扩增及筛选标志。此外，还有一些在大肠杆菌中扩增质粒所必须的元件，如青霉素抗性基因、原核复制起始点等。该质粒转染至CHO细胞后，在不含有谷氨酰胺的培养基中，加入谷氨酰胺合成酶的抑制剂硫胺甲硫氨酸（MSX），筛选出含有该质粒细胞克隆。

3.筛选高表达细胞克隆：

将质粒pL101和扩增的TPO-cDNA进行Bcl I和sma I双酶切后按照质粒pL101操作说明书将扩增的TPO-cDNA插入到质粒pL101获得pL101/TPO。装有rh-TPO cDNA的表达载体pL101/TPO，经细菌培养、QIAGEN公司试剂盒纯化，获得可用于转染CHO细胞的高纯度质粒。将CHO传代入60mm培养皿中，待细胞生长至50～60%满时，准备进行转染。

取无血清DMEM培养基各0.3mL，分别加入2支无菌冻存管中，分别加入转染用质粒10μL和Lipofectamine^TM20μL，室温放置30min，将两管混合，室温继续放置5～10min。将培养皿中的含血清培养基吸掉，用不含血清的培养基轻轻冲洗细胞，加入2mL无血清培养基和混合好的试剂。将细胞置37℃二氧化碳培养箱中继续孵育5～12h。加入5mL完全培养基，继续培养48h。将细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，传代入100mm培养皿中继续培养过夜。次日，细胞贴壁后，更换培养液。换为含10%透析血清（GIBCO BRL）的DMEM培养液，加入25μmol/L的筛选剂硫氨甲硫氨酸(MSX，sigma)。约10～14天后，细胞开始大量死亡，并出现一些小岛状的克隆。用记号笔在平皿底部标记肉眼可见的克隆，用克隆环挑选克隆，加入24孔培养板中培养。待细胞在24孔培养板中生长至半满以上后，取上清检测TPO活性，挑选出阳性克隆。并进一步反复比较各克隆的目标蛋白活性，筛选出3～5个最高的表达细胞株，编号，冻存细胞。反复重复上述转染、筛选过程，比较各批保留的相对较高表达量的细胞克隆，从至少5批转染和400个原始克隆中最终筛选出3个表达量最高的克隆。将最终确定的3个克隆用1个月以上的时间，逐步适应到无血清培养基。并用无血清冻存液冻存细胞。继续对上述3个细胞克隆及其产物进行比较，确定一个表达量最高的克隆。

细胞株经鉴定后，将在含有筛选剂，但不含有血清的培养基中培养扩增，冻存，建立原始细胞库。原始细胞库的细胞用不含有血清、不含有筛选剂的培养液培养扩增，冻存，建立主细胞库。主细胞库的细胞复苏后，应冻还，同时扩增建立生产用细胞库。

4.培养工程细胞：

细胞罐采用溶积为10L的连续细胞反应器（B.BRAUN生物反应器），加入ExCell325-PF无血清培养基7L（每升中另加入葡萄糖0.9g，无水碳酸钠1.8g）。将已经过方瓶培养的1800ml细胞接种液加入其中，控制反应器专属50～60rp/min，温度37±0.3℃，含氧量40±5%，pH7.2～7.4，日灌流量10L，日收获上清液10L。

5.纯化：

5.1培养上清超滤浓缩：

连接好管道和蠕动泵，以70L/m²注射用水冲洗滤膜，开始浓缩离心后的培养上清，至体积小于500mL，将超滤液用纯水稀释5倍，继续超滤浓缩至原体积，收获超滤浓缩液，以500mL缓冲液（20mmol/L PB，pH7.0）冲洗出残留浓缩液。以70L/m²注射用水（事先经0.45μm滤膜过滤）冲洗滤膜后，用40℃预热的0.1mol/L NaOH（体积按10L/m²）循环清洗滤膜及管道1h，滤膜4℃保存于0.1mol/L NaOH中。将浓缩后上清9000rpm，20min离心。

5.2DEAE离子交换层析：

用3个柱体积平衡缓冲液（20mmol/L PB，pH7.0）平衡柱子（填料DEAE-Sepharose FF，层析柱规格XK50/100），流速50mL/min；超滤后样品上柱，流速30mL/min；上样完毕，用平衡缓冲液冲洗柱子，至UV值接近基线，流速50mL/min；用3个柱体积洗涤缓冲液（6mol/LUrea，1.2mmol/L甘氨酸，0.6ml/L HAc）洗涤样品，流速50mL/min；用3个柱体积平衡缓冲液平衡柱子，流速50mL/min；平衡完毕，用洗脱液（20mmol/L PB，150mmol/LNacl，pH7.0）洗脱柱子，流速50mL/min；收集洗脱过程的紫外峰；3个柱体积2mol/L Nacl溶液再生柱子，流速50mL/min；用5个柱体积注射用水冲洗柱子，流速50mL/min；离子交换柱使用多次后应用0.5mol/L NaOH清洗再生柱子，流速50mL/min，清洗完毕用注射用水冲洗柱子流速50mL/min。层析结束用3个柱体积的20%乙醇保存柱子，流速50mL/ml，收集液采用SEC-HPLC检测，色谱图如图3所示。

5.3Source15RPC反相层析（FineLine Pilot35）：

用3个柱体积平衡缓冲液(5mmol/L Tris/HCl,pH8.5)平衡柱子，流速30mL/min；样品上柱，流速20mL/min；用平衡缓冲液冲洗柱子，至UV值接近基线，流速30mL/min；连续梯度洗脱样品，起始梯度100%Buffer A（5mmol/L Tris/Hcl，pH8.5）、0%Buffer B（85%乙醇溶液）；最终梯度0%Buffer A、100%Buffer B；梯度时间60min，流速30mL/min；收集洗脱梯度从45%Buffer B到75%Buffer B的蛋白洗脱峰；梯度结束，换用梯度，从0%Buffer A、100%Buffer B到100%Buffer A、0%Buffer B，梯度时间10min。梯度结束，Buffer A冲洗2个柱体积，流速30mL/min；使用2个柱体积0.5mol/L NaOH溶液清洗再生柱子，流速30mL/min，然后，再次以5个柱体积Buffer A平衡柱子，流速30mL/min；换用梯度，从100%Buffer A、0%Buffer B到0%Buffer A、100%Buffer B，梯度时间10min，梯度结束，3个柱体积BufferB平衡并保存柱子，流速30mL/min；

5.4超滤浓缩

连接好管道和蠕动泵，以70L/m²注射用水冲洗滤膜，开始浓缩合并的反相层析洗脱液，至体积小于100mL，收获超滤浓缩液，以50mL20mmol/L柠檬酸缓冲液（内含150mmol/LNaCl，pH6.9）冲洗出残留浓缩液。以70L/m²注射用水（事先经0.45μm滤膜过滤）冲洗滤膜后，用40℃预热的0.1mol/L NaOH（体积按10L/m²）循环清洗滤膜及管道1h，滤膜4℃保存于保存液0.1mol/L NaOH中。

5.5S-200分子筛层析

用20mmol/L柠檬酸缓冲液（内含150mmol/L NaCl，pH6.9）平衡柱子（填料粒径为10μm～40μm，层析柱规格XK50/100），流速10mL/min。把超滤浓缩液分几次上样（上样体积不大于柱体积的5%），流速10mL/min。上样完毕，用20mmol/L柠檬酸缓冲液（内含150mmol/LNaCl，pH6.9）洗脱柱子，流速10mL/min，收集洗脱峰。洗脱液采用SEC-HPLC检测，色谱图如图4所示。层析结束，用3个柱体积的20%乙醇保存柱子，流速10mL/min。上述5天获得的50L培养液共分离得rh-TPO约为1020mg，蛋白纯度为98.5%，活性为3.6×10⁵U/mg。

实施例2：

按照表1的比例，取实施例1制备得到的重组人血小板生成素进一步制备液体制剂，制备方法为：先按重量比配制含有柠檬酸钠、柠檬酸、NaCl的缓冲溶液，然后按重量比加入重组人血小板生成素、磺丁基醚β环糊精；最后经除菌过滤后灌装。

表1：

实施例3：稳定性试验

按照实施例2的配方制备得到的重组人血小板生成素的液体制剂，模拟上市包装，置密封洁净容器中，在温度2℃～8℃条件下放置24个月，在试验期间分别于第3、6、9、12、18、

24个月末取样一次，对各检验项目进行检验。结果表2所示：

表2：

实施例4：稳定性对比试验：

按照实施例3的制备方法、表3所示的配方制备重组人血小板生成素的液体制剂：

表3：

模拟上市包装，置密封洁净容器中，模拟上市包装，置密封洁净容器中，于25℃±2℃、75%RH条件下放置6个月，在试验期间分别于1、2、3、6个月末取样一次，对稳定性重点考察项目进行检验。结果表4所示：

表4：

上述稳定性试验结果说明，采用本发明的稳定剂的添加比例制备得到的制剂稳定性最强，磺丁基醚β环糊精添加量过少时稳定性效果略差，进一步增加用量也没有达到增加稳定性的效果。采用本发明的稳定剂制备制剂的稳定性高于其他几种稳定剂。

Claims

1.一种重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计PCR引物扩增目的基因：将人胚肾细胞获得的TPO-cDNA序列与设计的引物进行扩增，扩增重组人血小板生成素cDNA序列的PCR引物为：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

（2）构建重组表达质粒：将如图2所示的质粒pL101和扩增得到的TPO-cDNA重组，得到重组pL101/TPO质粒；

（4）培养工程细胞；采用ExCell325-PF无血清培养基，葡萄糖的添加量为0.5～1.5 g/L，无水碳酸氢钠的添加量为1.0～2.5 g/L；

（5）纯化：培养获得的上清液依次采用第一次超滤、DEAE离子交换层析、Source 15 RPC反相层析、第二次超滤浓缩、S-200分子筛层析的纯化手段获得重组人血小板生成素。

2.根据权利要求1所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，DEAE离子交换层析的条件为：用平衡缓冲液平衡层析柱，经过第一次超滤后的样品上柱，流速20～30 ml/min；上样完毕，用平衡缓冲液冲洗至UV值接近基线；用洗涤缓冲液洗涤样品，流速为40～50 mL/min；用平衡缓冲液平衡柱子，流速40~50 mL/min；平衡完毕，用洗脱液洗脱，流速40～50 mL/min；收集洗脱过程的紫外峰。

3.根据权利要求2所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，平衡缓冲液为20 mmol/L PB的溶液，pH 7.0；洗涤缓冲液为含有6 mol/L Urea、1.2 mmol/L甘氨酸、0.6 ml/L HAc的混合溶液，所述的洗脱液为含有20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl的混合溶液，pH 7.0；用量为3～5个柱体积。

4.根据权利要求1所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，Source 15 RPC反相层析的条件为：用平衡缓冲液平衡Source 15 RPC反相层析柱，流速20～30 mL/min；样品上柱，流速10～20 mL/min；用平衡缓冲液冲洗至UV值接近基线，流速20～30 mL/min；连续梯度洗脱样品，起始梯度100% Buffer A、0% Buffer B；最终梯度0% Buffer A、100% Buffer B；梯度时间60 min，流速30 mL/min；收集洗脱梯度从45% Buffer B到75% Buffer B的蛋白洗脱峰；梯度结束，换用梯度，从0% Buffer A、100% Buffer B到100% Buffer A、0% Buffer B，梯度时间10 min；

Buffer A为5 mmol/L Tris/Hcl溶液，pH 8.5，Buffer B为85%乙醇溶液。

5.根据权利要求4所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，平衡缓冲液为5 mmol/L Tris/HCl的溶液，pH 8.5，用量为3～5个柱体积。

6.根据权利要求1所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述的S-200分子筛层析的条件为：柠檬酸缓冲液平衡柱子，把得到的超滤浓缩液分几次上样，上样体积为柱体积的3～5 %，流速为5～10 mL/min；上样完毕，用柠檬酸缓冲液洗脱，流速5～10 mL/min，收集洗脱峰。

7.根据权利要求6所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲液含有20 mmol/L柠檬酸、150 mmol/L NaCl的混合溶液，pH 6.9。

8.根据权利要求1～7任意一项权利要求所述的重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，所述的重组人血小板生成素的纯度为98.0～99.9 %，活性为3.0×10⁵～3.6×10⁵U/mg。