CN102850451B - 具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用 - Google Patents
具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于提供一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用，通过分泌表达的方式大量生产获得重组textilinin-1，其具有较高的抑制plasmin的生物活性。该重组textilinin-1可以作为止血药，用于手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基因重组方法制备具有抗纤溶酶活性的多肽textilinin-1。其关键是textilinin-1（Q8008）基因的密码子优化、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。重组textilinin-1可以作为止血药，用于控制手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
背景技术：
临床上，外科手术中如何减少血液的流失是需要密切关注的重要事件，尤其是对手术时间较长的心肺旁路手术，就更应该采取一定的措施，避免和减少患者的大量出血。减少外科手术中血液的用量能有效地降低因输血产生的大量问题和避免经血液传播疾病的感染，如乙型肝炎病毒，人免疫缺陷型病毒（HIV）和变型的克罗伊茨费尔特-雅各布病等。
止血药aprotinin（抑酞酶）在国外被常用于心脏外科手术中，主要用于体外循环下实施冠状动脉旁路移植术(CABG)的病人，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。但aprotinin有明显的副作用，可产生严重的不良反应，主要包括过敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心力衰竭、肾功能异常、急性肾衰竭等，目前已经停止使用。
目前在国内还没有发现有同类产品的研究和报告。澳大利亚研究的textilinin-1仍处于实验室研究阶段。初步试验结果证明：textilinin-1与aprotinin相比，在相同用量的情况下，其止血过程更安全可靠。
textilinin-1（Txln-1），是一种Kunitz-型蛋白酶抑制剂，是从澳大利亚棕蛇Pseudonaja textilis textilis 中提取的，具有59个氨基酸，分子量为6.7 kDa的多肽。这个分子被建议作为在外科手术中aprotinin的替代药物。虽然textilinin-1与aprotinin在蛋白序列上相似度只有47%。但在这两种多肽中，六对二硫键是高度保守的。因此，预期他们的分子空间折叠是相似的，只是分子表面特性有些不同。
textilinin-1 和aprotinin都具有强烈地抑制plasmin、elastase和trysin活性的作用。研究发现aprotinin对urokinase，thrombin和kallikrein比textilinin-1强。被textilinin-1抑制的plasmin将很快地被逆转，并比aprotinin易于控制，这可有助于控制血浆和损伤部位的抗纤维蛋白溶解活性。textilinin-1的这一特点降低了由于强烈抑制纤溶酶（aprotinin）而导致的血栓风险，使它成为减少手术中血液损失的安全治疗性药物。并且，由于textilinin-1相对于plasmin有更强的专一性，可以在较高的剂量使用而没有由于酶特异性差而导致的安全风险。与主要用于心脏外科手术中aprotinin相比，Textilinin-1可能作为更可靠和更安全的止血用药。
textilinin-1可引起预期的血块溶解抑制作用。在同样的摩尔浓度下，aprotinin的抑制作用显著低于textilinin-1。这也是早期用血浆凝块溶解实验所证明的。textilinin-1可抑制纤溶酶活性，并在小动物模型中能减少出血。textilinin-1同aprotinin一样，在5微摩的浓度下就能产生几乎完全抑制tPA诱导产生的全血凝块纤维蛋白的溶解。aprotinin能显著增加血浆aPTT，而血浆aPTT则不受textilinin-1的影响。在小鼠尾静脉出血动物模型中，静脉给药，textilinin-1和aprotinin都能起到相同的减少血液损失的作用。但textilinin-1可使小鼠止血时间更短。说明textilinin-1值得进一步研究，有望开发成为替代aprotinin的药物。
蛇毒中提取的Textilinin-1 为59个氨基酸的多肽，含有三对分子内二硫键，其天然核酸和氨基酸序列如下： 1 AAG GAC CGT CCG GAT TTC TGT GAA CTG CCT GCT GAC ACC GGA CCA 45 1 K D R P D F C E L P A D T G P 15 46 TGT AGA GTC AGA TTC CCA TCC TTC TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAA 90 16 C R V R F P S F Y Y N P D E K 30 91 AAG TGC CTA GAG TTT ATT TAT GGT GGA TGC GAA GGG AAT GCT AAC 135 31 K C L E F I Y G G C E G N A N 45 136 AAT TTT ATC ACC AAA GAG GAA TGC GAA AGC ACC TGT GCT GCC TGA 180 46 N F I T K E E C E S T C A A * 60 。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1，它能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，并具有较高的抑制plasmin的生物活性。该重组textilinin-1可以作为止血药，用于手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
本发明提供了一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1，其氨基酸序列为：
KDRPDFCELP ADTGPCRVRF PSFYYNPDEK KCLEFIYGGC EGNANNFITK EECESTCAA
其特征在于，所述具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1，是通过将人工合成的textilinin-1结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得，其中人工合成textilinin-1结构基因序列为：
1 AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45
46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90
91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135
136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。
本发明还提供了所述重组textilinin-1的制备方法，其特征在于，制备方法为：将人工合成的textilinin-1结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生重组textilinin-1，其中人工合成textilinin-1结构基因序列最好为：
1 AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 1 K D R P D F C E L P A D T G P 15 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 16 C R V R F P S F Y Y N P D E K 30 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 31 K C L E F I Y G G C E G N A N 45 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180 46 N F I T K E E C E S T C A A * 60。
优选地，本发明重组textilinin-1可以通过甲醇酵母菌以分泌表达的方式大量产生获得。
本发明提供的重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，依据textilinin-1的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成textilinin-1结构基因序列。
本发明提供的重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，将人工合成textilinin-1结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体pPIC9K或pPICZα中。
本发明提供的重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，可以利用酵母菌的α-信号肽，PHO1信号肽将重组textilinin-1移出细胞，其中在信号肽序列与textilinin-1序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列AAAAGA。
本发明提供的重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：其发酵工艺参数的优化为：表达时pH值为3-5，表达温度为23-25℃。
本发明提供的重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：其纯化工艺为阳离子交换和阴离子交换，优化地选用Capto MMC和Q hp作为纯化textilinin-1的填料。
本发明提供的具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1，在制造止血药物方面的用途。
本发明提供的具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1，可代替aprotinin止血药，作为副作用较低的止血药，用于外科手术中，尤其是用于体外循环下实施的冠状动脉旁路移植术(CABG)，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。
附图说明：
图1 重组质粒示意图；
图2 PCR鉴定阳性转化子电泳结果；
图3 HPLC色谱纯度分析图谱；
图4 textilinin-1活性测定分析图。
具体实施方式：
实施例1
根据美国Genebank中公开的textilinin-1（AF402324.1）的核酸序列，选择酵母菌喜好的遗传密码子，人工合成textilinin-1的结构基因序列。为使合成的目的基因重组到酵母菌分泌型表达载体pPICZα中，在基因的5′端添加XhoⅠ酶切位点，基因的3′端添加终止密码子TAATGA及酶切位点Not 
。另外，在XhoⅠ酶切位点与textilinin-1多肽的N-端第一个氨基酸密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA,这就确保了textilinin-1在分泌到发酵液时能够顺利地切除α-信号肽。重组质粒构建见图1。
将合成的textilinin-1基因及pPICZαA载体经XhoⅠ和Not 
双酶切，电泳、回收，将目的基因重组到pPICZαA中，转化到大肠杆菌Top10F’中，进行筛选。转化有pPICZαA的大肠杆菌Top10F’在LB+25ug/mg Zeocin的平板上的进行培养，挑取单菌落，在液体培养基中培养，提取质粒，XhoⅠ和Not 
双酶切检测或进行ɑ-factor priming和3’AOX1 priming PCR检测，说明pPICZαA中含有目的基因，可以用来转化Pichia pastoris X-33， KM71H或GS115宿主菌。
设计的textilinin-1序列及酶切位点（Xho1/Not1）：
Xho1 kex2 site Q8008Y
CTCGAGAAAAGAAAGGATAGACCAGATTTTTGTGAATTGCCAGCTGATACTGGTCCATGTAGAGTTAGATTTCCATCTTTTTACTACAACCCAGATGAAAAGAAGTGTTTGGAATTTATTTACGGTGGTTGTGAAGGTAACGCTAACAACTTTATTACTAAGGAAGAATGTGAATCTACTTGTGCTGCTTAAGCGGCCGC
Not1
实施例2
用DNA限制性内切酶SacI将pPICZα-Txn-1线性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit Version B中的方法制备酵母宿主感受态并进行转化，将转化后的细胞涂在YPD+500ug/ml Zeocin培养基上生长， 30℃下放置3-4天可出现单菌落。挑选菌落大而饱满的克隆进行表达筛选。
PCR鉴定阳性转化子(设阳性对照) 如图2所示，其中阳性克隆为 2 ,3 ,4 ,8 ,9 12 ,13, 15 ,14。
实施例3
种子液：在1.5L酵母氮源基础培养基中28℃发酵24小时后转到30L发酵液中进行发酵培养。培养基:H3PO4,27ml/L;CaSO4·2H2O, 0.9g/L; K2SO4，18g/L; MgSO4·7H2O, 15g/L; KOH, 4.13g/L;甘油40g/L; 4.4ml/L微量矿物质溶液。
在发酵过程中，用NH4OH调pH值，使其维持在5.0。30℃通氧剧烈搅拌（700rpm）发酵，添加消泡剂。发酵24小时后，加入含12ml/L微量矿物质的50%甘油，溶氧浓度为20%左右，继续培养10小时。当碳原饥饿30分钟后，加入甲醇诱导，此时将pH值调到4.0，表达温度调到23℃。刚开始的5小时加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母适应甲醇，100%甲醇含12ml/L微量矿物质溶液，其溶氧量在20%以上。继续发酵98小时， textilinin-1表达量达到0.4g/L。
在其它发酵条件都基本相同的前提下，首先对诱导温度进行了优化，在同样pH 6.0的条件下，优化诱导温度对textilinin-1产量的影响，确定了最佳表达温度为23℃。 其次进行了表达阶段pH的优化，在同样温度条件下，优化pH对textilinin-1产量的影响。下面是诱导表达阶段温度和pH优化实验数据：
结果表明：发酵的最优温度为23℃，最优pH为4。
实施例4
发酵液离心，收集上清液，经微滤后直接上阳离子交换柱，进行梯度洗脱，收集活性峰。然后上阴离子交换柱，梯度洗脱，收集活性峰。最后，经膜包浓缩后，低温保存。HPLC（ C18分析柱）检测纯度达97%以上，色谱分析报告如下，色谱图见图3。送样品测定氨基酸序列，结果同理论设计的完全一致。
结果表明：不同的填料对应的重组textilinin-1其纯化效率和收率都不同，在前期确定阳离子交换和阴离子交换纯化工艺的基础上，又进一步对同类填料进行了研究，并考虑了工艺的连贯性，最后确定采用Capto MMC和Q hp作为纯化重组textilinin-1的填料。整个工艺的收率达到55%以上。纯度达到95%以上。
实施例5
textilinin-1的体外活性测定采用发色底物法，具体方法如下：
酶抑制分析是在25℃条件下，反应体系为0.1mol/L Tris-HCL（pH7.4）含0.01%（V/V）Tween80, Plasmin 的浓度范围2—18nmol/L， textilinin-1浓度为16-410nmol/L，最后加入S2251的浓度为75umol/L。
重组textilinin-1、plasmin同时加入反应体系，最后加发色底物S2251,以1 min为间隔时间, 连续监测在405 nm波长下的吸收值变化。通过吸收值对时间作图所得直线的斜率,对textilinin-1的浓度进行线性回归，从而测得残留plasmin活性的百分比，见图4。
textilinin-1的活性单位定义为：能够抑制一个plasmin活性单位的50%活性所需要的抑制剂的量，为1个textilinin-1活性单位（1TU）。公式为Ui=（U0-U）/50%,其中U0是不加抑制剂时所测酶活性，U是加抑制剂时所测酶活性。
实施例6
按照临床研究指导原则，体内凝血试验采用小鼠断尾法。结合aprotini临床用量情况，小鼠用药剂量按人的用药剂量作相应的调整，20g小鼠的用药量为100ug。
取健康小鼠，随机分为7组，每组5只，经腹膜内的注射氯胺酮和甲苯噻嗪进行麻醉后，尾静脉注射aprotinin（100ug/100ul） 和重组textilinin-1（100ug/100ul），并于注射2分钟后，用剪刀在距小鼠尾尖0.3cm处剪断，收集自行流出的血液到已经称重的eppendoff管中，称量流出血液的重量。同时用生理盐水作为阴性对照，用aprotinin做阳性对照。结果见下表：
结果: 重组textilinin-1与approtinin一样，与阴性对照组相比，小鼠的出血量均有显著的降低，减少血液损失分别为56.2%和58.8%。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁诺康生物制药有限责任公司
<120> 具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用
<130> cckj 11/0224
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> PRT
<213> Pseudonaja textilis
<400> 1
Lys Asp Arg Pro Asp Phe Cys Glu Leu Pro Ala Asp Thr Gly Pro Cys
1 5 10 15
Arg Val Arg Phe Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Glu Lys Lys Cys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Ile
35 40 45
Thr Lys Glu Glu Cys Glu Ser Thr Cys Ala Ala
50 55
<210> 2
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggatagac cagatttttg tgaattgcca gctgatactg gtccatgtag agttagattt 60
ccatcttttt actacaaccc agatgaaaag aagtgtttgg aatttattta cggtggttgt 120
gaaggtaacg ctaacaactt tattactaag gaagaatgtg aatctacttg tgctgcttaa 180
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> Pseudonaja textilis
<400> 3
aaggaccgtc cggatttctg tgaactgcct gctgacaccg gaccatgtag agtcagattc 60
ccatccttct actacaaccc agatgaaaaa aagtgcctag agtttattta tggtggatgc 120
gaagggaatg ctaacaattt tatcaccaaa gaggaatgcg aaagcacctg tgctgcctga 180
Claims (5)
1.一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1的制备方法，其特征在于，制备方法为：将人工合成的textilinin-1结构基因克隆入酵母菌中，发酵，以分泌表达的方式大量产生重组textilinin-1，纯化，其中人工合成textilinin-1结构基因序列为：
1 AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45
46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90
91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135
136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180
所述酵母菌为毕赤酵母菌；其纯化工艺为阳离子交换和阴离子交换。
2.按照权利要求1所述重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：在毕赤酵母菌中实现分泌表达时，将人工合成textilinin-1结构基因插入到毕赤酵母菌表达载体pPIC9K或pPICZα中。
3.按照权利要求1所述重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：在毕赤酵母菌中实现分泌表达时，利用酵母菌的α-信号肽或PHO1信号肽将重组textilinin-1移出细胞，其中在信号肽序列与textilinin-1序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列。
4.按照权利要求1所述重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：其发酵工艺参数为：表达时pH值为3-5，表达温度为23-25℃。
5.按照权利要求1所述重组textilinin-1的制备方法，其特征在于：选用Capto MMC和Q hp作为纯化textilinin-1的填料。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 110171 No. 219 Youth Street, Shenhe District, Liaoning, Shenyang Patentee after: Liaoning Yuanda Nuokang Bio-Pharmaceuticals Co., Ltd. Address before: 110171 No. 219 Youth Street, Shenhe District, Liaoning, Shenyang Patentee before: Liaoning Nuokang Bio-pharmaceutical Co., Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 110171 Liaoning province Shenyang Hunnan Nanping Road No. 18-1 Patentee after: Liaoning Yuanda Nuokang Bio-Pharmaceuticals Co., Ltd. Address before: 110171 No. 219 Youth Street, Shenhe District, Liaoning, Shenyang Patentee before: Liaoning Yuanda Nuokang Bio-Pharmaceuticals Co., Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: No.18-1, Nanping East Road, Hunnan New District, Shenyang City, Liaoning Province Patentee after: Yuanda Life Science (Liaoning) Co.,Ltd. Address before: No.18-1, Nanping East Road, Hunnan New District, Shenyang City, Liaoning Province Patentee before: LIAONING GRAND NUOKANG BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |