CN118050528A - 一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于血小板生成素拟肽生物活性检测技术领域，具体涉及一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，包括BaF3细胞转导、BaF3(c‑mpl)细胞培养和用BaF3(c‑mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性；本发明的有益效果：血小板生成素拟肽能够与c‑mpl特异性结合，通过将c‑mpl转入BaF3细胞构建依赖细胞株来检测血小板生成素拟肽生物学活性，具有高特异性；BaF3(c‑mpl)细胞复苏后传代先给予足量细胞生长因子，再根据细胞传代情况递减细胞生长因子，确保细胞恢复正常的分化能力、生长控制能力和细胞周期调节能力，保证传代细胞进行血小板生成素拟肽生物学活性检测的准确性和灵敏度。

Description

一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法
技术领域
本发明属于血小板生成素拟肽生物活性检测技术领域，具体涉及一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法。
背景技术
血小板生成素拟肽是一种血小板生成素(TPO)受体激动剂，通过与TPO受体(c-mpl)特异性结合，活化细胞通路，刺激巨核细胞的增殖、分化和成熟，促进血小板的生成，能显著提高血小板的水平，降低出血风险。目前国内血小板生成素拟肽生物类药物都在临床研究阶段，各研究者或生产商对该类药物质量控制手段匮乏，所以尤其必要建立一种体外检测血小板生成素拟肽生物活性的优异方法。
现有的通过自身表达TPO受体的C17.2细胞和M07e细胞对血小板生成素拟肽进行检测的特异性低，并且存在检测灵敏度和准确性低等问题，所以提高血小板生成素拟肽体外生物学活性检测方法的特异性、灵敏度和准确度非常重要。
冷冻细胞复苏后的传代过程中可能会出现细胞异质性，细胞形态和功能的差异可能会增加。另外，复苏细胞的生长特性也可能会发生变化，例如传代细胞可能会失去分化能力、失去生长控制和细胞周期的正常调节等，这些因素都会影响传代细胞的活性检测结果。
发明内容
本发明针对上述的现有技术存在体外检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法缺乏，检测特异性、灵敏度和准确性低，以及细胞复苏后的传代过程中出现细胞异质性的问题，提供了一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，包括依次进行的BaF3细胞转导、BaF3(c-mpl)细胞培养和用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性；所述BaF3细胞转导后表达c-mpl基因的BaF3细胞为BaF3(c-mpl)细胞，并将所述BaF3(c-mpl)细胞加入细胞冻存液后在液氮中保存；
所述BaF3(c-mpl)细胞培养包括依次进行的BaF3(c-mpl)细胞复苏和BaF3(c-mpl)细胞传代；
所述BaF3(c-mpl)细胞复苏：取液氮保存的BaF3(c-mpl)细胞，37℃水浴使融化，离心收集细胞，用基础培养液悬浮，添加细胞生长因子至40ng/ml，转入T25细胞培养瓶，于37℃、5％二氧化碳条件下培养；
所述BaF3(c-mpl)细胞传代：观察细胞生长状态良好，汇合度达80%进行传代培养；所述传代培养步骤依次为取2.0～3.0 ml细胞液于T25细胞培养瓶，补加基础培养液至10ml，添加细胞生长因子至30ng/ml，于37℃、5％二氧化碳条件下培养48小时；后续传代均采用所述传代培养步骤，但每次传代减少10ng/ml的细胞生长因子添加量，依次递减至20ng/ml、10ng/ml，待细胞稳定传代后进行常规传代培养，细胞生长因子添加量为10～15ng/ml；常规传代时根据培养时间调整接种比例，培养时间为48～72小时；
所述用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性包括依次进行的检测用BaF3(c-mpl)细胞准备、样品溶液的制备、样品溶液的稀释、测定得数据、数据处理及分析；
所述样品溶液的制备包括对照品溶液的制备和供试品溶液的制备；所述对照品溶液的制备为取血小板生成素拟肽对照品1支，用2ml无菌注射用水复溶，用基础培养液稀释至30ng/ml作为对照品溶液；所述供试品溶液的制备为取供试品，用基础培养液稀释至30ng/ml作为供试品溶液；
所述样品溶液的稀释为采用横向布板，取所述对照品溶液和所述供试品溶液各100μl，分别加入两个96孔细胞培养板的测定首孔，除首孔外，其余测定孔各加入50μl基础培养液，首孔取50μl加入第2孔，混匀，再依次向右做2倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2个平行孔；各测定孔均保留50μl溶液；
所述测定得数据中利用酶标仪对各测定孔蛋白质含量进行检测，检测方法为终点法，检测波长为570nm，参比波长为630nm，检测区域应覆盖所有样品孔，板布局和浓度与实际一致，曲线拟合以OD570nm-OD630nm的平均值作四参数曲线拟合；
所述数据处理及分析分别以各测定孔蛋白质含量(ng/ml)的终浓度为横坐标，OD570nm-OD630nm的平均值为纵坐标，采用四参数法拟合各样品的标准曲线；记录各测定样品的半数有效剂量EC50(ng/ml)；按下式计算供试品相对生物学活性(%)：
。
作为优选，所述BaF3细胞转导包括依次进行的逆转录病毒转染BaF3细胞、确认逆转录病毒转染BaF3细胞效果、转染逆转录病毒BaF3细胞的筛选和克隆、确认c-mpl基因表达；
所述逆转录病毒转染BaF3细胞：将1×105BaF3细胞与0.5ml包装的逆转录病毒(SAMEN1406-GFP, SAMEN-MPL-Neo)混合，加入白介素-3，直至白介素-3的终浓度为0.5ng/ml；再加入聚凝胺至终浓度10μg/ml；混合均匀加入24孔板，将混合液放入37℃细胞培养箱培养过夜；加入1ml RPMI 1640培养基培养，将混合液放入37℃细胞培养箱培养；
所述确认逆转录病毒转染BaF3细胞效果：感染3天后观察到感染SAMEN-1406-GFP的细胞全表达GFP报告基因；将BaF3细胞和感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞移至10cm细胞培养板上，加入白介素-3至终浓度0.5ng/ml，加入遗传霉素至终浓度200ng/ml；用荧光激活细胞分选仪检测BaF3细胞的逆转录GFP转导效率；
所述转染逆转录病毒BaF3细胞的筛选和克隆：离心收集感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞，用10ml新鲜的含200ng/ml遗传霉素和0.5ng/ml白介素-3的RPMI 1640培养基重悬细胞，继续培养；用遗传霉素处理3-4周后，将感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞分散，扩增培养；离心收集细胞，加入细胞冻存液后在液氮中保存；
所述确认c-mpl基因表达：离心收集的细胞，裂解，进行免疫印迹法检测确定c-mpl基因表达，转导后表达c-mpl基因的BaF3细胞为BaF3(c-mpl)细胞。
作为优选，所述检测用BaF3(c-mpl)细胞准备要求检测用BaF3(c-mpl)细胞需满足以下条件：60代以内；显微镜下观察细胞形态良好；汇合度达80%；细胞计数仪测得活率不低于80%。
作为优选，所述测定得数据还包括取足量BaF3(c-mpl)细胞液，1000rpm离心10min，吸弃离心上清液，BaF3(c-mpl)细胞用10ml基础培养液悬浮，1000rpm离心10min，洗涤细胞1次；继续洗涤细胞3次；洗涤后的BaF3(c-mpl)细胞用基础培养液悬浮，使用细胞计数仪复测细胞活率，得出活细胞浓度；按公式计算后，用基础培养液将悬浮后的细胞稀释到2×105个/ml作为细胞工作液；取加有样品溶液的两个96孔板，每个测定孔各加入细胞工作液50 µl，96孔板最外一圈加入足量的无菌溶液作为蒸发孔，防止边缘效应，于37℃、5％二氧化碳条件下共培养40～48小时；每个测定孔中加入MTT溶液(5mg/ml)20µl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时；每个测定孔加入裂解液(20%SDS)100µl，于37℃裂解18～24小时；取出96孔板放入酶标仪进行检测。
作为优选，测定得数据中所述公式如下：
；
；
基础培养液用量(ml)= 细胞工作液体积(ml)- 悬浮细胞液体积(ml)。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
相比现有技术，利用本发明检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，
(1)该方法用于体外血小板生成素拟肽生物活性检测，解决了体外检测血小板生成素拟肽生物活性方法匮乏的问题；
(2)血小板生成素拟肽作为一种血小板生成素受体激动剂，能够与c-mpl特异性结合，通过将c-mpl转入BaF3细胞构建依赖细胞株来检测血小板生成素拟肽，具有高专属性；
(3)BaF3(c-mpl)细胞对重组小鼠白介素-3的依赖增殖效应具有专一性，所用的白介素-3均为重组小鼠白介素-3，有利于提高逆转录病毒转染BaF3细胞的稳定性；
(4) BaF3(c-mpl)细胞复苏后传代先给予足量细胞生长因子，再根据细胞传代情况递减细胞生长因子，确保细胞恢复正常的分化能力、生长控制能力和细胞周期调节能力，防止传代后出现细胞异质性，保证传代细胞进行血小板生成素拟肽生物学活性检测的稳定性；
(5)在用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性中，样品溶液稀释时，96孔板最外一圈加入足量的无菌溶液作为蒸发孔，防止边缘效应的影响，从而减少造成EC50值波动较大的情况，使检测方法更稳定；
(6)用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性时，样品溶液与检测用BaF3(c-mpl)细胞共培养40～48小时，该共培养时间段的BaF3(c-mpl)细胞具有很好耐用性，进一步保证了血小板生成素拟肽生物学活性检测的准确性和灵敏度；
(7)在数据处理及分析中，用对照品和供试品的半数有效剂量的蛋白质含量(EC50，ng/ml)直接进行供试品生物学活性计算，因为蛋白质是生物活性物质，所以无需再标定对照品活性值，该数据处理方法更简便，同时也减少了对照品标定活性值时的误差，使检测结果更准确；
(8)本发明中BaF3(c-mpl)细胞培养所用的细胞生长因子为血小板生成素拟肽；与现有技术中白介素-3作为细胞生长因子相比，培养的BaF3(c-mpl)细胞检测血小板生成素拟肽时出现更明显的S形曲线，所以添加的细胞生长因子血小板生成素拟肽培养的BaF3(c-mpl)细胞检测血小板生成素拟肽的专属性更好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍：
图1为实施例1提供的血小板生成素拟肽活性参考品作为供试品的四参数曲线；
图2为实施例1提供的血小板生成素拟肽原液缓冲液作为供试品的四参数曲线；
图3为实施例1提供的血小板生成素拟肽成品缓冲液作为供试品的四参数曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
下面结合附图1-图3对本发明作进一步的描述，检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，包括依次进行的BaF3细胞转导、BaF3(c-mpl)细胞培养和用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性；BaF3细胞转导后表达c-mpl基因的BaF3细胞为BaF3(c-mpl)细胞，并将BaF3(c-mpl)细胞加入细胞冻存液在液氮中保存
BaF3(c-mpl)细胞培养包括依次进行的BaF3(c-mpl)细胞复苏和BaF3(c-mpl)细胞传代。
BaF3(c-mpl)细胞复苏：取液氮保存的BaF3(c-mpl)细胞，37℃水浴使融化，离心收集细胞，用基础培养液悬浮，添加细胞生长因子至40ng/ml，转入T25细胞培养瓶，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。BaF3(c-mpl)细胞复苏中所用的基础培养液为含10%NBCS的RPMI1640培养液，所用细胞生长因子为血小板生成素拟肽。
BaF3(c-mpl)细胞传代：观察细胞生长状态良好，汇合度达80%进行传代培养；传代培养步骤依次为取2.0 ml细胞液于T25细胞培养瓶，补加基础培养液至10 ml，添加细胞生长因子至30ng/ml，于37℃、5％二氧化碳条件下培养约48小时；后续传代均采用传代培养步骤，但每次传代减少10ng/ml的细胞生长因子添加量，依次递减至20ng/ml、10ng/ml。待细胞稳定传代后进行常规传代培养，细胞生长因子添加量至10ng/ml；常规传代时根据培养时间调整接种比例，培养时间为48小时。
BaF3细胞转导包括依次进行的逆转录病毒转染BaF3细胞、确认逆转录病毒转染BaF3细胞效果、转染逆转录病毒BaF3细胞的筛选和克隆、确认c-mpl基因表达。
逆转录病毒转染BaF3细胞：将1×105BaF3细胞与0.5ml包装的逆转录病毒(SAMEN1406-GFP, SAMEN-MPL-Neo)混合，加入白介素-3至终浓度0.5ng/ml，加入聚凝胺至终浓度10μg/ml，混合均匀加入24孔板，将混合液放入37℃细胞培养箱培养过夜；加入1mlRPMI 1640培养基培养，将混合液放入37℃细胞培养箱培养。
确认逆转录病毒转染BaF3细胞效果：感染3天后观察到感染SAMEN-1406-GFP的细胞全表达GFP报告基因；将BaF3细胞和感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞移至10cm细胞培养板上，加入白介素-3至终浓度0.5ng/ml，加入遗传霉素至终浓度200ng/ml；用荧光激活细胞分选仪检测BaF3细胞的逆转录GFP转导效率。
转染逆转录病毒BaF3细胞的筛选和克隆：离心收集感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞，用10ml新鲜的含200ng/ml遗传霉素和0.5ng/ml白介素-3的RPMI 1640培养基重悬细胞，继续培养。用遗传霉素处理后，未感染的BaF3细胞死亡，但感染SAMEN-MPL-Neo的许多BaF3细胞仍然存活；用遗传霉素处理2周后，部分存活的BaF3细胞开始生长，提高遗传霉素浓度分别至500ng/ml、1mg/ml并不能抑制BaF3细胞生长；用遗传霉素处理3周后，将感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞分散，扩增培养；离心收集细胞，加入细胞冻存液后在液氮中保存。BaF3细胞转导中所用的白介素-3为重组小鼠白介素-3。
确认c-mpl基因表达：离心收集的细胞，裂解，进行免疫印迹法检测确定c-mpl基因表达，转导后表达c-mpl基因的BaF3细胞为BaF3(c-mpl)细胞。
用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性包括依次进行的检测用BaF3(c-mpl)细胞准备、样品溶液的制备、样品溶液的稀释、测定得数据、数据处理及分析。
检测用BaF3(c-mpl)细胞准备要求检测用BaF3(c-mpl)细胞需满足以下条件： 60代以内；显微镜下观察细胞形态良好；汇合度达80%；细胞计数仪测得活率不低于80%。
样品溶液的制备包括对照品溶液的制备和供试品溶液的制备；对照品溶液的制备为取对照品1支，用2ml无菌注射用水复溶，用基础培养液稀释至30ng/ml作为对照品溶液；供试品溶液的制备为取供试品，用基础培养液稀释至30ng/ml作为供试品溶液。
样品溶液的稀释为采用横向布板，取对照品溶液和供试品溶液各100μl，分别加入两个96孔细胞培养板的测定首孔，除首孔外，其余测定孔各加入50μl基础培养液，首孔取50μl加入第2孔，混匀，再依次向右做2倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2个平行孔；各测定孔均保留50μl溶液。
测定得数据为取足量BaF3(c-mpl)细胞液，1000rpm离心10min，吸弃离心上清液，BaF3(c-mpl)细胞用10ml基础培养液悬浮，1000rpm离心10min，洗涤细胞1次；继续洗涤细胞3次；洗涤后的BaF3(c-mpl)细胞用基础培养液悬浮，使用细胞计数仪复测细胞活率，得出活细胞浓度；用基础培养液将悬浮后的细胞稀释到2×105个/ml作为细胞工作液；取加有样品溶液的两个96孔板，每个测定孔各加入细胞工作液50 µl，96孔板最外一圈加入足量的无菌溶液作为蒸发孔(无菌溶液是基础培养基或无菌注射用水)，防止边缘效应，于37℃、5％二氧化碳条件下共培养40小时；每个测定孔中加入MTT溶液(5mg/ml)20µl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养6小时；每个测定孔加入裂解液(20%SDS)100µl，于37℃裂解24小时；取出96孔板放入酶标仪读板，检测方法为终点法，检测波长为570nm，参比波长为630nm，检测区域应覆盖所有样品孔，板布局和浓度与实际一致，曲线拟合以OD570nm-OD630nm的平均值作四参数曲线拟合。
测定得数据中公式如下：
；
；
基础培养液用量(ml)= 细胞工作液体积(ml)- 悬浮细胞液体积(ml)。
数据处理及分析分别以各测定孔蛋白质含量(ng/ml)的终浓度为横坐标，OD570nm-OD630nm的平均值为纵坐标，采用四参数法拟合各样品的标准曲线。记录各测定样品的半数有效剂量EC50(ng/ml)。按下式计算供试品相对生物学活性(%)：
。
实施例1
专属性(特异性)：考察血小板生成素拟肽的原液缓冲液或血小板生成素拟肽的成品缓冲液对检测结果是否存在干扰。取血小板生成素拟肽活性参考品 (批次：01，100μg/支)，加2ml无菌超纯水复溶，即浓度50μg/ml,用基础培养液预稀释至30ng/ml作为活性参考品溶液；假设血小板生成素拟肽原液缓冲液中蛋白含量为1.0mg/ml，用基础培养基分别预稀释至30ng/ml，作为原液缓冲液溶液；假设制剂成品缓冲液中蛋白含量为500μg /ml，用基础培养基分别预稀释至30ng/ml，作为成品缓冲液溶液。
以活性参考品溶液作为对照品，以活性参考品溶液、原液缓冲液溶液、成品缓冲液溶液为供试品，进行检测，分别以蛋白浓度为横坐标，OD570nm-OD630nm的平均值为纵坐标，采用四参数法拟合供试品及对照品的标准曲线。根据表1结果，原液缓冲液和成品缓冲液对应的检测结果中无S形曲线，活性参考品检测结果中出现特有的S形曲线，表明原液缓冲液或成品缓冲液对供试品检测结果无干扰，本发明的方法检测血小板生成素拟肽生物学活性的专属性好。
表1 专属性验证结果
注：图2和图3中蓝色线条和绿色线条几乎重合。
实施例2
BaF3(c-mpl)细胞耐用性：考察测活用细胞—BaF3(c-mpl)细胞在不同浓度对本发明的方法检测结果的影响，以及考察供试品与BaF3(c-mpl)细胞混合后的培养时间的不同对方法检测结果的影响。
取血小板生成素拟肽活性参考品 (批次：02，100μg/支)，加2ml无菌超纯水复溶，即浓度50μg/ml,用基础培养液预稀释至30ng/ml，制成活性参考品溶液，以该活性参考品溶液作为供试品。
(1)考察测活用细胞不同浓度对方法检测结果的影响。将洗涤三次后的BaF3(c-mpl)细胞重悬计数后，调整细胞悬液的浓度分别为 1.5×105个/ml、2.0×105、2.5×105个/ml，每个细胞浓度重复测定2次。以效价理论值的对数(横坐标)对其相对应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归，使用Graphpad Prism 9.5 进行统计作图，拟合的直线回归方程, 相对效价测定方法一般用几何标准偏差(GSD)或几何变异系数(GCV，%)表示。计算公式如下： GSD=antilog(SD)、GCV=(GSD-1)×100%。
根据表2，测活用细胞不同浓度下耐用性测试结果中相对效价测定值GCV%=1.1%，符合GCV%小于20%的范围。本发明的方法中测活用细胞浓度取2.0×105个/ml，检测血小板生成素拟肽生物学活性的BaF3(c-mpl)细胞耐用性好。
表2 测活用细胞不同浓度下耐用性测试结果
(2)考察供试品与BaF3(c-mpl)细胞混合后的培养时间的不同对方法检测结果的影响(测活用细胞浓度取2.0×105个/ml)。供试品与BaF3(c-mpl)细胞混合后于 37℃、5％CO2条件下分别培养40h、44h、48h，加入MTT。每个培养时间下测定2次。
根据表3，耐用性-供试品与BaF3(c-mpl)细胞不同共培养时间检测结果的 GCV%=5.4%，相对效价测定值的GCV%小于20%。本发明中检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法中供试品与细胞共培养时间为40～48h。下表3结果表明方法中选择的供试品与细胞的共培养时间下，BaF3(c-mpl)细胞具有很好的细胞耐用性。
表3 耐用性-供试品与细胞不同共培养时间测试结果
实施例3
相对准确度、中间精密度：考察本发明方法的相对准确度和中间精密度。取血小板生成素拟肽活性参考品 (批次：03，100μg/支)，加 2ml无菌注射用水复溶，用基础培养液分别预稀释至 20ng/ml(100%)、10ng/ml(50%)、32 ng/ml(160%)，作为对照品；取新批次血小板生成素拟肽活性参考品 (批次：04，100μg/支)，用 2 ml 无菌超纯水复溶后(c=50μg/ml)，用基础培养液分别预稀释至15 ng/ml(50%)、23.7ng/ml(79%)、30ng/ml(100%)、37.8ng/ml(126%)、47.4 ng/ml(158%)作为供试品；考察本发明方法的相对准确度时采用不同的对照品共测定了两次，考察本发明方法的中间精密度时每个供试品测定三次。
以各测定孔蛋白质含量(ng/ml)的终浓度为横坐标，OD570nm-OD630nm的平均值为纵坐标，采用四参数法拟合各样品的标准曲线。将对照品和供试品OD570nm-OD630nm的平均值代入各自的四参数标准曲线方程，记录各测定样品的半数有效剂量EC50(ng/ml)。以效价理论值的对数(横坐标)对其相对应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归，使用GraphpadPrism 9.5 进行统计作图，拟合的直线回归方程, 相对效价测定方法一般用几何标准偏差(GSD)或几何变异系数(GCV，%)表示。计算公式如下： GSD=antilog(SD)、GCV=(GSD-1)×100%。
表4结果表明，通过回收率考察相对准确度，回收率均在 80%～120%范围内，符合相对准确度要求。另外，表5结果表明，中间精密度RSD%为3.4%～15.3%，GCV%为 4.1%～12.3%，均满足≤20%的范围。综合上述，表明本发明的检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法稳定可靠。
表4 相对准确度结果汇总表
表 5 中间精密度结果汇总表
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其他领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (5)

1.一种检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，其特征在于，包括依次进行的BaF3细胞转导、BaF3(c-mpl)细胞培养和用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性；所述BaF3细胞转导后表达c-mpl基因的BaF3细胞为BaF3(c-mpl)细胞，并将所述BaF3(c-mpl)细胞加入细胞冻存液后在液氮中保存；
所述BaF3(c-mpl)细胞培养包括依次进行的BaF3(c-mpl)细胞复苏和BaF3(c-mpl)细胞传代；
所述BaF3(c-mpl)细胞复苏：取液氮保存的BaF3(c-mpl)细胞，37℃水浴使融化，离心收集细胞，用基础培养液悬浮，添加细胞生长因子至40ng/ml，转入T25细胞培养瓶，于37℃、5％二氧化碳条件下培养；所用细胞生长因子为血小板生成素拟肽；
所述BaF3(c-mpl)细胞传代：观察细胞生长状态良好，汇合度达80%进行传代培养；所述传代培养步骤依次为取2.0～3.0 ml细胞液于T25细胞培养瓶，补加基础培养液至10 ml，添加细胞生长因子至30ng/ml，于37℃、5％二氧化碳条件下培养48小时；后续传代均采用所述传代培养步骤，但每次传代减少10ng/ml的细胞生长因子添加量，依次递减至20ng/ml、10ng/ml，待细胞稳定传代后进行常规传代培养，细胞生长因子添加量为10～15ng/ml；常规传代时根据培养时间调整接种比例，培养时间为48～72小时；
所述用BaF3(c-mpl)细胞测定血小板生成素拟肽生物学活性包括依次进行的检测用BaF3(c-mpl)细胞准备、样品溶液的制备、样品溶液的稀释、测定得数据、数据处理及分析；
所述样品溶液的制备包括对照品溶液的制备和供试品溶液的制备；所述对照品溶液的制备为取血小板生成素拟肽对照品1支，用2ml无菌注射用水复溶，用基础培养液稀释至30ng/ml作为对照品溶液；所述供试品溶液的制备为取供试品，用基础培养液稀释至30ng/ml作为供试品溶液；
所述样品溶液的稀释为采用横向布板，取所述对照品溶液和所述供试品溶液各100μl，分别加入两个96孔细胞培养板的测定首孔，除首孔外，其余测定孔各加入50μl基础培养液，首孔取50μl加入第2孔，混匀，再依次向右做2倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2个平行孔；各测定孔均保留50μl溶液；
所述测定得数据中利用酶标仪对各测定孔蛋白质含量进行检测，检测方法为终点法，检测波长为570nm，参比波长为630nm，检测区域应覆盖所有样品孔，板布局和浓度与实际一致，曲线拟合以OD570nm-OD630nm的平均值作四参数曲线拟合；
所述数据处理及分析分别以各测定孔蛋白质含量(ng/ml)的终浓度为横坐标，OD570nm-OD630nm的平均值为纵坐标，采用四参数法拟合各样品的标准曲线；记录各测定样品的半数有效剂量EC50(ng/ml)；按下式计算供试品相对生物学活性(%)：
。
2.根据权利要求1所述的检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，其特征在于，所述BaF3细胞转导包括依次进行的逆转录病毒转染BaF3细胞、确认逆转录病毒转染BaF3细胞效果、转染逆转录病毒BaF3细胞的筛选和克隆、确认c-mpl基因表达；
所述逆转录病毒转染BaF3细胞：将1×105 BaF3细胞与0.5ml包装的逆转录病毒(SAMEN1406-GFP, SAMEN-MPL-Neo)混合，加入白介素-3，直至白介素-3的终浓度为0.5ng/ml；再加入聚凝胺至终浓度10μg/ml；混合均匀加入24孔板，将混合液放入37℃细胞培养箱培养过夜；加入1ml RPMI 1640培养基培养，将混合液放入37℃细胞培养箱培养；
所述确认逆转录病毒转染BaF3细胞效果：感染3天后观察到感染SAMEN-1406-GFP的细胞全表达GFP报告基因；将BaF3细胞和感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞移至10cm细胞培养板上，加入白介素-3至终浓度0.5ng/ml，加入遗传霉素至终浓度200ng/ml；用荧光激活细胞分选仪检测BaF3细胞的逆转录GFP转导效率；
所述转染逆转录病毒BaF3细胞的筛选和克隆：离心收集感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞，用10ml新鲜的含200ng/ml遗传霉素和0.5ng/ml白介素-3的RPMI 1640培养基重悬细胞，继续培养；用遗传霉素处理3-4周后，将感染SAMEN-MPL-Neo的BaF3细胞分散，扩增培养；离心收集细胞，加入细胞冻存液后在液氮中保存；
所述确认c-mpl基因表达：离心收集的细胞，裂解，进行免疫印迹法检测确定c-mpl基因表达，转导后表达c-mpl基因的BaF3细胞为BaF3(c-mpl)细胞。
3.根据权利要求2所述的检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，其特征在于，所述检测用BaF3(c-mpl)细胞准备要求检测用BaF3(c-mpl)细胞需满足以下条件：60代以内；显微镜下观察细胞形态良好；汇合度达80%；细胞计数仪测得活率不低于80%。
4.根据权利要求3所述的检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，其特征在于，所述测定得数据还包括取足量BaF3(c-mpl)细胞液，1000rpm离心10min，吸弃离心上清液，BaF3(c-mpl)细胞用10ml基础培养液悬浮，1000rpm离心10min，洗涤细胞1次；继续洗涤细胞3次；洗涤后的BaF3(c-mpl)细胞用基础培养液悬浮，使用细胞计数仪复测细胞活率，得出活细胞浓度；按公式计算后，用基础培养液将悬浮后的细胞稀释到2×105个/ml作为细胞工作液；取加有样品溶液的两个96孔板，每个测定孔各加入细胞工作液50 µl，96孔板最外一圈加入足量的无菌溶液作为蒸发孔，防止边缘效应，于37℃、5％二氧化碳条件下共培养40～48小时；每个测定孔中加入MTT溶液(5mg/ml)20µl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时；每个测定孔加入裂解液(20%SDS)100µl，于37℃裂解18～24小时；取出96孔板放入酶标仪进行检测。
5.根据权利要求4所述的检测血小板生成素拟肽生物学活性的方法，其特征在于，测定得数据中所述公式如下：
；
；
基础培养液用量(ml)= 细胞工作液体积(ml)- 悬浮细胞液体积(ml)。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1129805A (zh) * 1995-09-08 1996-08-28 济南金鲁生物工程有限公司 人促血小板生成素变异体、其cDNA克隆表达及检测方法
US6060052A (en) * 1995-10-30 2000-05-09 Systemix, Inc. Methods for use of Mpl ligands with primitive human hematopoietic stem cells
KR20040065249A (ko) * 1994-01-03 2004-07-21 제넨테크, 인코포레이티드 트롬보포이에틴
CN102321168A (zh) * 2011-08-17 2012-01-18 山东泉港药业有限公司 新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法
CN103305540A (zh) * 2012-03-14 2013-09-18 齐鲁制药有限公司 一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法
CN103555760A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 江苏康禾生物制药有限公司 一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂
CN104181290A (zh) * 2014-08-08 2014-12-03 北京泰德制药股份有限公司 一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040065249A (ko) * 1994-01-03 2004-07-21 제넨테크, 인코포레이티드 트롬보포이에틴
CN1129805A (zh) * 1995-09-08 1996-08-28 济南金鲁生物工程有限公司 人促血小板生成素变异体、其cDNA克隆表达及检测方法
US6060052A (en) * 1995-10-30 2000-05-09 Systemix, Inc. Methods for use of Mpl ligands with primitive human hematopoietic stem cells
CN102321168A (zh) * 2011-08-17 2012-01-18 山东泉港药业有限公司 新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法
CN103305540A (zh) * 2012-03-14 2013-09-18 齐鲁制药有限公司 一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法
CN103555760A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 江苏康禾生物制药有限公司 一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂
CN104181290A (zh) * 2014-08-08 2014-12-03 北京泰德制药股份有限公司 一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周婷;: "2E8细胞增殖法测定白介素-7生物学活性的建立与应用", 海峡药学, no. 05, 15 May 2015 (2015-05-15) *
王军志, 赵阳, 陈国庆, 饶春明: "重组人干细胞因子生物学活性测定的质量控制研究", 中国肿瘤生物治疗杂志, no. 04, 30 December 2001 (2001-12-30) *

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