CN115343464A - 一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CBA法的MOG‑IgG自身抗体的检测材料及其制备方法和应用，属于抗体检测技术领域。本发明将用于MOG‑IgG标准检测的亚型MOGα1重组载体与最长的亚型MOG10重组载体共转，得到能够同时过表达MOGα1和MOG10的细胞爬片(命名为MOGα1+10)用于CBA法检测MOG‑IgG，延长了爬片保质期，提高了检测灵敏度，同时在部分MOG‑IgG样品中阳性信号的特异性荧光染色形态更易与非特异性染色区别，这些特点有助于临床样品中MOG‑IgG的检测以及对应疾病的诊断、治疗和预后。

Description

一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于抗体检测技术领域，具体涉及一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料及其制备方法和应用。
背景技术
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)是一种特异性表达于中枢神经系统(central nervous system，CNS)少突胶质细胞上的髓鞘糖蛋白，定位于CNS髓鞘最外层，由于这种定位，它成为参与免疫介导脱髓鞘的主要靶抗原，可能参与髓鞘的完整和维持以及细胞间的通讯。另外，编码不同亚型的剪接转录变体也已被鉴定，包括alpha1、alpha2、alpha3、alpha5、alpha6、beta1、beta2、beta3、beta5和10，其中IgG反应最强的MOG亚型为alpha1(简称为MOGα1，目前用于MOG-IgG的标准检测)和beta1，而其他亚型被识别的频率较低；新发现的转录变体10代表最长的转录本，并翻译最长的亚型MOG10。
据2018年MOG脑炎国际专家共识研究表明，MOG-IgG具有直接的致病性影响，MOG-IgG现在被认为是一种疾病本身，不同于经典的MS和AQP4-IgG阳性的视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)，现在通常被称为MOG-IgG相关性脑脊髓炎(MOG-IgG-associated encephalomyel-itis，MOG-EM)。该专家共识针对MOG-IgG抗体的检测和MOG-EM的诊断进行了详细的推荐，将通过使用全长的人MOG蛋白作为靶抗原，用基于细胞的检测方法(cell-Based assay，CBA)检测到的MOG-IgG血清阳性作为MOG脑炎的诊断标准之一。
目前CBA法也是检测MOG-IgG的金标准，但使用CBA法检测抗体目前仍存在产品保质期有限、灵敏度不高，非特异性染色等缺陷。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料及其制备方法和应用，能够有效解决现有技术中检测MOG-IgG出现的保质期短、灵敏度不高以及非特异性染色的技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，该检测材料是能够同时过表达MOGα1和MOG10的检测材料。
优选地，该检测材料是将MOGα1基因的重组载体和MOG10基因的重组载体共转进细胞后获得的。
优选的，所述MOGα1基因的序列号为NM_206809.4。
进一步优选地，所述的MOGα1基因的重组载体为PCDNA3.1-MOGα1，还可以是17T2A-MOGα1。
优选的，所述MOG10基因的序列号为NM_001363610.2。
优选地，所述的MOG10基因的重组载体为PCDNA3.1-MOG10，还可以是17T2A-MOG10。
进一步优选地，所述细胞为HEK293T细胞。
优选的，所述PCDNA3.1-MOGα1与PCDNA3.1-MOG10共转时的质量总和可以为2-10ug，重组载体质量总和与PEI的质量比≤1；
进一步优选的，PCDNA3.1-MOGα1和PCDNA3.1-MOG10共转时的质量比为1：(1～3)。
进一步优选地，所述检测材料为细胞爬片。
本发明公开了基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料的制备方法，该方法是转染细胞的间接免疫荧光法，是将MOGα1基因的重组载体与MOG10基因的重组载体共转进细胞中，得到同时过表达MOGα1和MOG10的细胞，将转染的细胞固定后洗涤，加入抗原修复液进行终止处理，然后将洗涤后的爬片干燥后保存，即获得检测MOG-IgG自身抗体的细胞爬片(命名为MOGα1+10)。
上述加入抗原修复液进行终止处理，可以参考中国专利CN202111021983.3公开的一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用，按照其中的方法进行操作、处理。
优选的，所述转染所用细胞为HEK293T细胞。
优选的，在制备过程中，细胞培养皿可以为任意规格适用于细胞培养的皿或孔板；所述的爬片为经过多聚赖氨酸处理的任意尺寸无菌爬片。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将用于MOG-IgG标准检测的亚型MOGα1重组载体与最长的亚型MOG10重组载体共转，得到能够同时过表达MOGα1和MOG10的细胞爬片(命名为MOGα1+10)用于CBA法检测MOG-IgG，延长了爬片保质期，提高了检测灵敏度，同时在部分MOG-IgG样品中阳性信号的特异性荧光染色形态更易与非特异性染色区别，这些特点有助于临床样品中MOG-IgG的检测以及对应疾病的诊断、治疗和预后。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的MOGα1+10细胞爬片的保质期验证染色结果图；
图2为对比例1制备的MOGα1细胞爬片的保质期验证染色结果图；
图3为对比例2制备的MOG10细胞爬片的保质期验证染色结果图；
图4为对比例3制备的MOG10MOG10细胞爬片的保质期验证染色结果图；
图5为用MOGα1+10、MOGα1、MOG10、MOG10MOG10细胞爬片分别对比阳性样本检测灵敏度的染色结果图；
图6为用MOGα1+10、MOGα1、MOG10、MOG10MOG10细胞爬片分别检测阳性样本的特异性荧光染色形态的染色结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供一种用于CBA法检测MOG-IgG自身抗体的方法，将PCDNA3.1-MOGα1重组载体与PCDNA3.1-MOG10重组载体共转进293T细胞中，得到同时过表达MOGα1和MOG10的细胞爬片，与单独过表达MOGα1或MOG10的细胞爬片相比，保质期明显延长，在进一步的研究中发现，检测MOG-IgG抗体时，灵敏度有一定的提高，阳性信号特异性染色的特点更加突出，有利于结果的判断，能够在一定程度上减少假阳性和假阴性的出现。
本发明公开的制备MOGα1+10细胞爬片的步骤，具体步骤如下：
步骤1：取合适尺寸的经过酸碱和灭菌处理，再经多聚赖氨酸浸泡的爬片放置在细胞培养皿中；
步骤2：胰酶消化细胞后重悬细胞于DMEM-FBS高糖完全培养基中，将重悬好的细胞悬液铺到步骤1处理好的细胞培养皿中；
步骤3：待细胞生长至30％-40％时，通过瞬时转染转入重组载体，即将PCDNA3.1-MOGα1和PCDNA3.1-MOG10按质量比依次加入DMEM高糖基础培养基中，再加入一定量的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)，静止后加入步骤2已铺好细胞的爬片，4-6小时后更换为DMEM-FBS高糖完全培养基；
步骤4：待细胞生长至24～72h后，将生长好细胞的爬片使用甲醛溶液、多聚甲醛溶液或戊二醛溶液进行固定，洗涤后用抗原修复液进行终止处理，干燥后保存，即获得MOGα1+10细胞爬片。
优选的，上述步骤3还可以是先按照质量比将质粒PCDNA3.1-MOGα1和PCDNA3.1-MOG10分别加入DMEM高糖基础培养基中，再分别加入一定量的PEI，分别混匀静止后一起加入上述步骤2已铺好细胞爬片的培养皿中，4-6小时后更换为DMEM-FBS高糖完全培养基。
进一步优选的，所述DMEM-FBS高糖完全培养基由加入10％-15％FBS的DMEM高糖基础培养基配制而成。
优选的，制成MOGα1+10细胞爬片的步骤还可以是将通过稳定转染获得的稳定细胞系复苏，铺至爬片上，待细胞密度生长至≥80％，将生长好细胞的爬片使用甲醛溶液、多聚甲醛溶液或戊二醛溶液进行固定，洗涤后用抗原修复液进行终止处理，干燥后保存，即获得MOGα1+10细胞爬片。
上述细胞爬片的质检方法，具体步骤如下：
1)、取MOGα1+10细胞爬片，用PBST浸泡十分钟；
2)、一抗孵育：分别孵育已知的MOG-IgG阳性样本和已知的MOG-IgG阴性样本，孵育时间1小时；
3)、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
4)、二抗孵育：二抗孵育时间30min；
5)、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
6)、观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
7)、结果判读：若阳性样本的滴度与已知滴度一致，且阴性无假阳性则该爬片质检合格；否则该爬片质检不合格。
优选的，判断MOG-IgG阳性时，荧光信号清晰，一般定位在细胞膜上，形态不规则，且强于周边的细胞背景着色；部分阳性信号可分布在细胞突起上，呈现较完整的细胞形态。
进一步优选的，判断MOG-IgG阳性时，需要区分特异性阳性信号和非特异性染色，部分细胞由于非特异的膜定位着色而出现疑似阳性信号，略强于背景，切换至明场下观察所对应的细胞形态，若为边缘清晰的圆形或近似圆形，颜色较正常细胞略深，则为非特异性着色。
实施例1 MOGα1+10细胞爬片的制备及其效果验证
一、MOGα1+10细胞爬片的制备
1、质粒的构建
(1)从GenBank序列数据库中查得MOGα1的基因序列，参考序列号为NM_206809.4，合成该基因到PCDNA3.1载体上，选用的酶切位点是SalⅠ和NotⅠ，记为PCDNA3.1-MOGα1；查得MOG10的基因序列，参考序列号为NM_001363610.2，合成该基因到PCDNA3.1载体上，选用的酶切位点是SalⅠ和NotⅠ，记为PCDNA3.1-MOG10；
(2)将构建好的重组载体PCDNA3.1-MOGα1和PCDNA3.1-MOG10进行质粒大提，备用。
2、制片
(1)细胞培养
配制含10％-15％FBS的DMEM-FBS高糖完全培养基，待细胞汇合度约90％-100％时，按1:5～1:6传代至已铺好爬片的培养皿中，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)质粒转染
细胞生长至30％-40％时，取PCDNA3.1-MOGα1质粒4μg，PCDNA3.1-MOG10质粒5μg，依次加入DMEM高糖基础培养基，再加入10μgPEI，按照PEI转染方法进行转染，转染4-6小时后换成含10％-15％FBS的DMEM-FBS高糖完全培养基，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(3)细胞固定
约24～72h后，待细胞生长至汇合度≥90％，将生长好细胞的爬片使用甲醛溶液、多聚甲醛溶液或戊二醛溶液进行固定，用磷酸盐缓冲液洗涤后，用抗原修复液进行终止处理，干燥后保存，即获得MOGα1+10细胞爬片。
二、MOGα1+10细胞爬片的效果实验验证
1、MOGα1+10细胞爬片的保质期验证
取上述制备得到的MOGα1+10细胞爬片，分别放置在不同温度下，即37℃、4℃和-20℃保存，定期取出爬片验证阳性信号。
实验步骤：
1)取上述制备得到的MOGα1+10细胞爬片，用PBST浸泡十分钟；
2)一抗孵育：孵育阳性样本，时间1小时；
3)洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
4)二抗孵育：二抗孵育时间30min；
5)洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
6)观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：不同温度下放置的MOGα1+10细胞爬片，定期验证阳性信号的染色结果。37℃保存阳性信号可持续至少60天基本无变化；4℃保存阳性信号可持续至少365天基本无变化；而-20℃保存阳性信号可持续至少365天基本无变化，具体染色结果如图1所示。
2、MOGα1+10细胞爬片的检测灵敏度验证
用本实施例制备的MOGα1+10细胞爬片，分别检测30例MOG-IgG阳性样本。
实验步骤：
1)取MOGα1+10细胞爬片，用PBST浸泡十分钟；
2)一抗孵育：孵育阳性样本，时间1小时；
3)洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
4)二抗孵育：二抗孵育时间30min；
5)洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
6)观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：30例MOG-IgG阳性样本全部检出。
对比例1 MOGα1细胞爬片的制备及其效果验证
一、MOGα1细胞爬片的制备
1、质粒的构建
取实施例1构建好的质粒PCDNA3.1-MOGα1，备用。
2、制片
(1)细胞培养：和实施例1相同
(2)质粒转染
待细胞生长至30％-40％时，取PCDNA3.1-MOGα1质粒9μg加入DMEM高糖基础培养基，再加入10μgPEI，按照PEI转染方法进行转染，转染4-6小时后换成含10-15％FBS的DMEM-FBS高糖完全培养基，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(3)细胞固定：和实施例1相同；干燥后保存，即获得MOGα1细胞爬片。
二、MOGα1细胞爬片的效果实验验证
1、MOGα1细胞爬片的保质期验证
实验步骤：和上述实施例1中进行的MOGα1+10细胞爬片的保质期验证的实验操作步骤相同。
实验结果：不同温度下放置的MOGα1细胞爬片，定期验证阳性信号的染色结果。37℃保存阳性信号可持续至少21天基本无变化；4℃保存阳性信号可持续至少180天基本无变化；而-20℃保存阳性信号可持续至少180天基本无变化；具体染色结果如图2所示。
2、MOGα1细胞爬片的检测灵敏度验证
和上述实施例1中进行MOGα1+10细胞爬片的检测灵敏度验证的实验操作步骤相同。
实验结果：30例MOG-IgG阳性样本中29例染色结果为阳性，1例染色结果为阴性。
对比例2 MOG10细胞爬片的制备及其效果验证
一、MOG10细胞爬片的制备
1、质粒的构建
取实施例1构建好的质粒PCDNA3.1-MOG10，备用。
2、制片
(1)细胞培养：和实施例1相同
(2)质粒转染
待细胞生长至30％-40％时，取PCDNA3.1-MOG10质粒9μg加入DMEM高糖基础培养基，再加入10μgPEI，按照PEI转染方法进行转染，转染4-6小时后换成含10％-15％FBS的DMEM-FBS高糖完全培养基，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(3)细胞固定：和实施例1相同；干燥后保存，即获得MOG10细胞爬片。
二、MOG10细胞爬片的效果实验验证
1、MOG10细胞爬片的保质期验证
实验步骤：和上述实施例1中进行的MOGα1+10细胞爬片的保质期验证的实验操作步骤相同。
实验结果：不同温度下放置的MOG10细胞爬片，定期验证阳性信号的染色结果。37℃保存阳性信号可持续至少30天基本无变化；4℃保存阳性信号可持续至少180天基本无变化；而-20℃保存阳性信号可持续至少180天基本无变化，具体染色结果如图3所示。
2、MOG10细胞爬片的检测灵敏度验证
和上述实施例1中进行MOGα1+10细胞爬片的检测灵敏度验证的实验操作步骤相同。
实验结果：30例MOG-IgG阳性样本中28例染色结果为阳性，2例染色结果为阴性。
对比例3 MOG10MOG10细胞爬片的制备及其效果验证
一、MOG10MOG10细胞爬片的制备
1、质粒的构建
(1)将去掉终止密码子的MOG10基因插入到实施例1构建好的PCDNA3.1-MOG10，插入位点为NheⅠ和SalⅠ，记为PCDNA3.1-MOG10MOG10；
(2)将构建好的重组载体PCDNA3.1-MOG10MOG10进行质粒大提，备用。
2、制片
(1)293T细胞培养：和实施例1相同；
(2)质粒转染
待细胞生长至30％-40％时，取PCDNA3.1-MOG10MOG10质粒9μg加入DMEM高糖基础培养基，再加入10μgPEI，按照PEI转染方法进行转染，转染4-6小时后换成含10％-15％FBS的DMEM-FBS高糖完全培养基，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(3)细胞固定：和实施例1相同，干燥后保存，即获得MOG10MOG10细胞爬片。
二、MOG10MOG10细胞爬片的效果验证
1、MOG10MOG10细胞爬片的保质期验证
实验步骤：和上述实施例1中进行的MOGα1+10细胞爬片的保质期验证的实验操作步骤相同。
实验结果：不同温度下放置的MOG10MOG10细胞爬片，定期验证阳性信号的染色结果。37℃保存阳性信号可持续至少30天基本无变化；4℃保存阳性信号可持续至少180天基本无变化；而-20℃保存阳性信号可持续至少180天基本无变化，具体染色结果如图4所示。
二、MOG10MOG10细胞爬片的检测灵敏度验证
和上述实施例1中进行MOGα1+10细胞爬片的检测灵敏度验证的实验操作步骤相同。
实验结果：30例MOG-IgG阳性样本中28例染色结果为阳性，2例染色结果为阴性。
实验结果总结：
实验结论1
由上述实施例和对比例的实验结果可知，在不同温度下放置保存的MOGα1+10、MOGα1、MOG10、MOG10MOG10细胞爬片，随着时间的推移阳性信号会越来越弱直至没有，且温度越高阳性信号持续时间越短。共转的MOGα1+10爬片与单转的MOGα1、MOG10和MOG10MOG10相比，阳性信号持续时间明显增加，保质期明显延长。结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003796200210000121
实验结论2
由上述实施例和对比例的实验结果可知，用MOGα1+10、MOGα1、MOG10、MOG10MOG10细胞爬片分别检测30例MOG-IgG阳性样本，结果如下表2所示。
表2
MOGα1+10 MOGα1 MOG10 MOG10MOG10
阳性 30 29 28 28
阴性 0 1 2 2
其中，有1例仅在MOGα1爬片上未检出，有2例仅在MOG10和MOG10MOG10爬片上未检出，而用MOGα1+10细胞爬片30例全部检出。由实验结果可以看出，相比于单转的MOGα1、MOG10和MOG10MOG10，共转的MOGα1+10检测灵敏度更高，检测未知样本时更不易漏检阳性，染色结果如图5所示。
实验结论3
在免疫荧光细胞实验中，部分细胞会出现疑似阳性信号的圆球状非特异性着色，由上述实施例和对比例的实验结果可知，用MOGα1+10、MOGα1、MOG10、MOG10MOG10细胞爬片分别检测30例MOG-IgG阳性样本，发现其中约20％样本用单转的MOGα1、MOG10和MOG10MOG10爬片检测，阳性细胞染色形态呈似球状，而在共转的MOGα1+10上的阳性细胞染色形态呈略大的煎蛋样，更易与圆球状非特异性着色区分，降低了检测人员误判的风险，染色结果如图6所示。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，其特征在于，该检测材料是能够同时过表达MOGα1和MOG10的检测材料。
2.根据权利要求1所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，其特征在于，该检测材料是将MOGα1基因的重组载体和MOG10基因的重组载体共转进细胞后获得的。
3.根据权利要求2所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，其特征在于，所述MOGα1基因的重组载体为PCDNA3.1-MOGα1或17T2A-MOGα1；所述MOG10基因的重组载体为PCDNA3.1-MOG10或17T2A-MOG10；所述细胞为HEK293T细胞。
4.根据权利要求2所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，其特征在于，所述MOGα1基因的重组载体与MOG10基因的重组载体共转的质量总和为2～10μg；共转时，重组载体的质量总和与聚乙烯亚胺的质量比≤1。
5.根据权利要求2中任意一项所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，其特征在于，MOGα1基因的重组载体和MOG10基因的重组载体的质量比为1：(1～3)。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料，其特征在于，该检测材料为细胞爬片。
7.权利要求1～6中任意一项所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料在制备用于检测MOG-IgG自身抗体的试剂盒中的应用。
8.一种基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将MOGα1基因的重组载体与MOG10基因的重组载体共转进细胞中，得到同时过表达MOGα1和MOG10的转染细胞；
2)将转染细胞固定后洗涤，加入抗原修复液进行终止处理；
3)将步骤2)处理后得到的细胞爬片洗涤、干燥，获得基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料。
9.根据权利要求8所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述MOGα1基因的重组载体为PCDNA3.1-MOGα1或17T2A-MOGα1；所述MOG10基因的重组载体为PCDNA3.1-MOG10或17T2A-MOG10；所述细胞为HEK293T细胞。
10.根据权利要求8所述的基于CBA法的MOG-IgG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述MOGα1基因的重组载体与MOG10基因的重组载体共转的质量总和为2～10μg；共转时，重组载体的质量总和与聚乙烯亚胺的质量比≤1；MOGα1基因的重组载体和MOG10基因的重组载体的质量比为1：(1～3)。
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