CN109097462A - Ap1m2基因作为诊断青光眼的分子标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了AP1M2基因在制备诊断产品中的应用。该诊断产品可用于青光眼的诊断。通过检测AP1M2基因表达水平可以判断受试者是否患有青光眼或者将来患有青光眼的风险大小。本发明的诊断产品可实现快速、灵敏和准确的诊断效果。

Description

AP1M2基因作为诊断青光眼的分子标志物的应用

技术领域

本发明涉及青光眼诊断领域，更具体地，本发明涉及AP1M2基因作为青光眼的诊断工具。

背景技术

眼睛是人体十分重要的感觉器官，能够接受外部的光刺激，并将光冲动传送到大脑中枢而引起视觉。达芬奇曾说：“眼睛是心灵的窗户，通过眼睛，人们得以拥抱和欣赏世界的无限美妙，灵魂才得以安居于体内”。信息时代，人通过感觉器官从外界获得的信息中，大约90％是由眼睛来完成的。世界卫生组织的资料显示，眼科疾病已成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三位危害及影响人们生存质量的疾病。在所有眼科疾病中，青光眼则是首位不可逆转的致盲性眼病，其影响视觉质量的原因是通过威胁和损害视神经及其通路而导致失明，从而严重威胁人类的视觉健康，给个人、家庭和社会造成难以估量的损失。

青光眼造成的主要危害是影响视觉功能，即便是在发达国家中，也只有50％左右的青光眼患者能够得到及时的诊断和治疗，而且，青光眼的发病因素、遗传学规律等均不明了，因此我们要科学地掌握其发生发展规律，从而进行早期诊断和早期治疗，避免青光眼患者的失明。目前，青光眼的诊断主要是依靠病史、形态学和功能学方面的检查，如眼压测量、超声生物显微镜、眼底照相、光学相干断层扫描和视野检查等。虽然这些检查可以诊断青光眼，但研究表明，通过形态学和功能学手段诊断的青光眼，患者视觉功能的损害已经超过50％。而青光眼相关的生化检查、血清学筛查及检测标准仍处于相对空白状态，因此寻找一种高灵敏度和高特异性的标志物对青光眼诊断和监控尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过检测AP1M2基因或蛋白表达差异来诊断青光眼的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的产品在制备青光眼诊断工具中的用途。

进一步，所述检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的产品包括检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合AP1M2基因的核酸或者能够结合AP1M2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测AP1M2基因的表达水平；所述物质能够检测AP1M2蛋白的表达水平。

本发明的检测AP1M2基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(AmplificationRefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增AP1M2基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测AP1M2蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的检测AP1M2蛋白的产品包括特异性结合AP1M2蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测AP1M2蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的AP1M2蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对AP1M2蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyteFluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

进一步，所述检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的产品可以是检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为青光眼患者或诊断该受试者患有青光眼的风险高。

作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织，具体的，所述组织是视神经乳头组织。

本发明还提供了一种诊断青光眼的工具，所述工具能够检测受试者样本中AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合AP1M2基因的核酸或者能够结合AP1M2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测AP1M2基因的表达水平；所述物质能够检测AP1M2蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述诊断青光眼的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断青光眼的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知AP1M2基因的异常与青光眼相关也属于AP1M2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗AP1M2抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合AP1M2即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制AP1M2功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗AP1M2抗体的其他性质同前面所述。

进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织，具体的，所述组织是视神经乳头组织。

本发明还提供了一种诊断青光眼的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取青光眼受试者的样品；

(2)检测受试者样品中AP1M2基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的AP1M2基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，AP1M2基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为青光眼，或该受试者被诊断为将来患有青光眼的风险高。

在本发明的上下文中，“诊断青光眼”既包括判断受试者是否已经患有青光眼、也包括判断受试者是否存在患有青光眼的风险。

本发明的“AP1M2基因”在NCBI上的信息为：Chromosome 19,NC_000019.10(10572671..10587315,complement)。

本发明的优点和有益效果：

本发明为青光眼疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供重要的参考依据，具有较大的实际临床价值，可以用于筛选出青光眼疾病的高危人群和复发人群，以期及早进行干预和治疗，减少非高危复发病人不必要的治疗和医疗花费。

附图说明

图1显示利用QPCR检测组织中AP1M2基因在青光眼患者和正常对照人群中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选青光眼患者和正常人群中差异表达的基因

1、样本收集

青光眼手术过程收集病变的视神经乳头组织共35例和正常外伤人的视神经乳头组织共25例作为对照。所有青光眼患者及其家属均签署了知情同意书。

2、总RNA提取

采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。加入TRIzol后室温放置10min，使样品充分裂解(注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。每1mlTRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。4℃12,000rpm离心15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。4℃8,000rpm离心5min，弃上清。室温放置晾干后，在沉淀内加入50μl RNase-free水，以充分溶解RNA，-70℃保存。

3、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、逆转录

逆转录采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，按照试剂盒提供的体系(20μl)(如表1所示)分别加入反应管中。

表1反应体系

试剂	体积
		5*PrimeScript<sup>TM</sup> buffer	4μl
5*PrimeScript<sup>TM</sup> RT Enzyme mix I	1μl
		Oligo dT Primer(50μM)	1μl
Random 6mers(100μM)	4μl
		总RNA	2μl
Rnase free ddH<sub>2</sub>O	13μl

将以上体系置于无Rnase的0.2μl EP管中，按下面程序反转为cDNA：37℃15min，85℃5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

5、实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR反应体系(50μl)，配置如下：

SYBR Green Mix 25μl，AP1M2特异性的qRT-PCR的上游引物、AP1M2特异性的qRT-PCR下游引物、GAPDH特异性qRT-PCR上游引物、GAPDH qRT-下游引物各1μl，dNTP 2μl，cDNA2μl，ddH₂O 19μl。

PCR反应条件：

92℃5min，(92℃30s；58℃30s；72℃30s 40个循环)，72℃5min。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带。

AP1M2基因扩增引物

上游引物：5’-TAAGACAATAGAGGTATTCTG-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-GTAGACGATGACAAAGTT-3’(SEQ ID NO.2)，

GAPDH基因扩增引物

上游引物：5’-TCAAGATCATCAGCAATG-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5’-CGATACCAAAGTTGTCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

6、数据分析

基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数，分别确定对照人群和青光眼患者的ΔCt范围。ΔΔCT法进行相对定量。

7、结果

结果显示，35例青光眼患者中有32例患者的AP1M2基因mRNA水平明显低于对照人群的平均水平。统计结果如图1所示，与对照人群相比，青光眼患者AP1M2基因mRNA水平明显下调，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 青岛市海慈医疗集团

<120> AP1M2基因作为诊断青光眼的分子标志物的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taagacaata gaggtattct g 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagacgatg acaaagtt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaagatcat cagcaatg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgataccaaa gttgtcat 18

Claims (10)

1.检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的产品在制备青光眼诊断工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的产品包括检测AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为青光眼患者或者诊断该受试者患有青光眼的风险高。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是组织。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合AP1M2基因的核酸或者能够结合AP1M2蛋白的物质；所述核酸能够检测AP1M2基因的表达水平；所述物质能够检测AP1M2蛋白的表达水平。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增AP1M2基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

7.一种诊断青光眼的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中的AP1M2基因或AP1M2蛋白的表达水平的工具。

8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合AP1M2基因的核酸或者能够结合AP1M2蛋白的物质；所述核酸能够检测AP1M2基因的表达水平；所述物质能够检测AP1M2蛋白的表达水平。

9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增AP1M2基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是组织。