KR101470795B1

KR101470795B1 - 당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101470795B1
Application number: KR1020140087583A
Authority: KR
Inventors: 박동호
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2014-12-08

Abstract

본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 조성물 및 당뇨망막병증 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.

Description

당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도{Markers for Diagnosing of Diabetic Retinopathy and Use Thereof}

당뇨병은 인슐린의 생성 혹은 이용 과정의 이상으로 혈당이 증가하고 그에 따른 다양한 급성, 만성 합병증을 동반하는 심각한 질환이다. 우리나라의 경우, 2005년 질병관리본부에서 시행한 국민건강영양조사에 따르면 30세 이상 남자의 9.0%, 여자의 7.2% 가 당뇨병 환자로 나타났다. 대한당뇨병학회가 발간한 '2007년 한국인 당뇨병 연구보고서'에 따르면, 당뇨의 유병률은 약 8%이고 매년 10%의 새로운 환자가 발생하고 있으며 당뇨 관련 의료비가 건강보험 비용의 약 20% (약 3조원)를 차지한다. 현재 400-500만 명으로 추산되는 당뇨 환자 수의 최근의 빠른 증가 속도를 고려할 때 10-20년 후 1000만 명에 이를 수 있다.

당뇨병의 이환 기간이 길어짐에 따라 전신의 다양한 합병증을 동반하게 되는데, 대표적으로 심혈관계 질환, 당뇨신증, 당뇨신경병증, 당뇨망막병증이 발생하게 된다. 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy, DR) 은 당뇨 환자에게서 당뇨 진단 10년 내에 60% 이상에서, 20년 내에 90% 이상에서 나타난다.

이중에서 당뇨망막병증은 당뇨병의 미세혈관 합병증(microangiopathy)의 하나로서, 망막 혈관의 투과성 변화와 혈관 폐쇄, 허혈 변화(ischemia), 신생혈관 생성(neovascularization) 및 섬유혈관 증식(fibrovascular proliferation)을 보이는 것이 특징이다.

당뇨망막병증은 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망병증(NPDR, non-proliferative diabetic retinopathy)과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR, proliferative diabetic retinopathy)으로 구분할 수 있다.

비증식성 당뇨망막병증(NPDR)은 망막 모세혈관의 폐쇄 및 투과성 변화 등으로 망막출혈, 미세혈관류(microaneurysm), 삼출물(exudate), 망막 부종(edema) 등이 나타나면서 조금씩 시력이 떨어지게 된다. 또한 황반부의 부종 (DME, 당뇨황반부종) 을 동반하게 되면 이 시기에서도 심각한 시력 저하를 보일 수 있다. 증식성 당뇨망막병증(PDR)은 망막의 광범위한 혈관 폐쇄에 따르는 허혈 (ischemia) 상태로 인해 신생혈관(neovascularization)이 증식하는 단계이다. 이러한 증식은 망막에서 유리체로 진행되고 섬유혈관 증식이 일어나 견인막에 의해 유리체출혈(vitreous hemorrhage)이나 망막이 원래 부착 부위에서 떨어지는 견인망막박리(tractional retinal detachment), 신생혈관녹내장 등의 합병증이 발생해 실명이 진행되는 단계이다.

한편, 비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 반면, 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 다소 상이하며, 또한 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 심화되는 것이 아닌바, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없으며, 비증식성 당뇨망막병증 진단용 마커가 반드시 증식성 당뇨망막병증 진단용 마커로 유용하지 않다.

비증식성 당뇨망막병증을 진단하기 위한 바이오마커에 대한 연구는 계속 진행 중에 있으나(한국등록특허 제10-1391506호, 제10-1343285호, 제10-1343137호), 증식성 당뇨망막병증을 진단하기 위한 바이오마커에 대한 연구는 아직까지 미비한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 증식성 당뇨망막병증의 진단에 유용한 바이오마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 증식성 당뇨망막병증에 특이 적인 단백질로서 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A)를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 증식성 당뇨망막병증(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료로부터 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A) 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 또는 비증식성 당뇨망막병증 시료와 비교하는 단계를 포함하는 증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 증식성 당뇨망막병증(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR) 진단용 조성물을 제공한다.

세마포린(Semaphorin)은 신경 성장 원추를 퇴축시키고 축색의 신장을 억제하는 내인성 단백질이다. 지금까지 알려진 약 20 종의 분자 종류 가운데, 클래스 3 서브패밀리로 지칭하는 유전자군이 잘 연구되고 있으며, 이들의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 강력한 생체외 신경돌기 신장 억제 활성이나 성장 원추 퇴축 활성을 갖는 것이 알려져 있다. 특히 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A)는 저농도에서 단시간에 배양한 신경세포의 성장 원추가 퇴축되도록 유도하는 것으로 알려진 단백질로서, 그 유전자 정보는 GeneBank Accession No. NM_006080, NP_006071, Uniprot: Q14563에서 검색할 수 있다.

이와 같이 SEMA3A의 신경 관련 기능은 알려져 있으나, 상기 유전자 또는 단백질이 증식성 당뇨망막병증 환자에게서 특히 많이 발현됨으로써 증식성 당뇨망막병증을 진단하는 바이오마커로 사용될 수 있음은 본 발명자들에 의해 처음 규명되었다.

본 발명에서 "당뇨망막병증"은 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하여 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 합병증이다. 당뇨망막병증은 심화 정도에 따라 비증식성 당뇨망막병증(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)과 증식성 당뇨망막병증(proliferative diabetic retinopathy, PDR)으로 구분될 수 있다.

비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 반면, 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 다소 상이하며, 또한 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 심화되는 것이 아닌바, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없으며, 비증식성 당뇨망막병증 진단용 마커가 반드시 증식성 당뇨망막병증 진단용 마커로 유용하지 않다는 문제점이 있었다.

본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로, 본 발명의 목적상 진단은 증식성 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다. 또한 진단용 마커에는 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 또는 비증식성 당뇨망막병증 개체에 비하여 증식성 당뇨망막병증을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"은 증식성 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 증식성 당뇨망막병증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제의 구체적인 예로는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 SEMA3A 유전자의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 구체적으로는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및서브유닛간 백본을 갖는 올리고머이다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 증식성 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 증식성 당뇨망막병증 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 본 발명에서는 SEMA3A 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정할 수도 있다.

상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자로서, 본 발명의 목적상 상기 SEMA3A 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물은 증식성 당뇨망막병증 소견이 있는 환자의 분리된 생물학적 시료에 사용하기 위한 것일 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"는 증식성 당뇨망막병증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 안방수, 혈액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 정상 대조군 환자, 비증식성 당뇨망막병증 환자, 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 안방수 및 혈장(plasma)에 포함된 SEMA3A 단백질의 농도를 비교분석한 결과, 증식성 당뇨망막병증 환자에게서만 유의적으로 높은 농도로 함유하고 있음을 확인하였다(도 1b).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는 증식성 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 구체적인 예로 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

또한, 상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 생물학적 시료로부터 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A) 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 또는 비증식성 당뇨망막병증 시료와 비교하는 단계를 포함하는 증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 SEMA3A는 그 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 및 비증식성 당뇨망막병증 개체군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 현저히 증가하는 특징을 가진다. 따라서 상기 세마포린 3A 유전자 또는 단백질의 발현 수준을, 정상 대조군 또는 비증식성 당뇨망막병증 시료의 세마포린 3A 유전자의 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 유전자 또는 단백질의 발현이 증가하면 증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 바람직하게 mRNA 발현 수준을 측정 및 비교할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨망막병증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨망막병증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.

본 발명의 SEMA3A 단백질 발현 수준은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에서 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명에서 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring)으로 정량을 실시한다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 보다 구체적으로 SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면, MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로, 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 따라서, 질량 분석시에 MRM 모드를 사용함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군 및 비증식성 당뇨망막병증 개체에서의 단백질 발현 수준과 증식성 당뇨망막병증 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 증식성 당뇨망막병증 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 증식성 당뇨망막병증 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명은 증식성 당뇨망막병증을 진단할 수 있는 마커를 제공함으로써, 기존의 비증식성 당뇨망막병증 진단 마커로는 진단할 수 없었던 증식성 당뇨망막병증 환자에 대한 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.

도 1a는 정상 대조군 환자, 비증식성 당뇨망막병증 환자 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 안방수(aqueous humor)에서 채취한 시료 내의 수용성 VEGF의 농도를 ELISA에 의해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 정상 대조군 환자, 비증식성 당뇨망막병증 환자 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 혈장(plasma)에서 채취한 시료 내의 세마포린 3A(SEMA3A)의 농도를 ELISA에 의해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 3에서 측정된 VEGF의 농도와 망막 모세혈관의 비관류 영역의 면적 간의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 실시예 3에서 측정된 SEMA3A의 농도와 망막 모세혈관의 비관류 영역의 면적 간의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 3a는 증식성 당뇨망막병증 환자에서의 망막 모세혈관의 비관류 영역을 나타낸 도이다.
도 3b는 비증식성 당뇨망막병증 환자에서의 망막 모세혈관의 비관류 영역을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 안구검사(Ophthalmic examinations) 및 참여 환자 선별

실시예 1-1: 안구검사

당뇨망막병증을 앓는 모든 개체를 대상으로 Snellen chart를 사용하여 최대 교정 시력(best-corrected visual acuity)을 포함한 안구검사를 실시하였고, 세극등 생체현미경(slit-lamp biomicroscopy), 광간섭 안구단층촬영(optical coherence tomography, OCT), 및 플루오레세인 혈관조영(Fluorescein angiography, FA)를 사용하여 확장성 안저검사(dilated fundus examination)를 실시하였다.

우선 SD-OCT(Spectralis OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)를 사용하여 중심 황반두께를 측정하였다. 황반 중심부위의 6 × 6 mm 영역을 대상으로 실험하였고, 각각 라인(line)당 1024 A-scans(Spectralis Acquisition and Viewing Modules, version 5.3.2; Heidelberg Engineering)으로 구성하였다. 황반 중심영역의 프로파일은 fast macular volume preset을 사용하여 측정하였으며, 25-line horizontal raster scan covering 20°× 20°로 구성하였다. 스캔본은 자동화된 실시간 feature가 가능한 고속 모드로 9 프레임으로 설정하여 수득하였다.

장치의 안구 추적 시스템(eye-tracking system)은 스캔본이 적절한 위치에서 수행되었는지 확인하기 위하여 사용하였다. 측정값은 VA 또는 눈과 관련된 다른 정보를 인지하고 있지 않은 숙련된 기술자에 의해 기록하였고, 16dB 점수 이상의 양질의 이미지만을 선별하였다.

실시예 1-2: 환자 선별

본 임상연구에 참여한 환자 중 당뇨망막병증 환자 전체에 대하여 상기 안구검사를 실시하고, 하기 기준에 의해 환자 100명 및 정상대조군 50명을 선별하였다.

(1) 중증 비증식성 당뇨망막병증 환자

정정된 Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) 등급에 따른 중증 비증식성 당뇨망막병증 환자로서, 스펙트럼 영역 빛간섭단층촬영(spectral-domain OCT)을 이용하여 측정한 중심영역 황반두께가 300 ㎛ 이상인 환자를 황반부종을 가진 환자를 중증 비증식성 당뇨망박병증 환자로 50명을 선별하였다.

(2) 증식성 당뇨망막병증 환자

안저 촬영(fundus photography) 및 플루오레세인 혈관조영(FA) (HRA; Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany)에서 보여지는 디스크 상에서의 신생 혈관(NVD) 또는 다른 영역에서의 신생혈관(NVE)의 증상을 가진 환자를 증식성 당뇨망막병증 환자로 50명을 선별하였다.

(3) 시험에서 제외된 환자

플루오레세인 혈관조영 또는 베바시주맙 항체의 사용금지 사유가 있거나; 베바시주맙, 라니비주맙, 페갑타닙 또는 레이저 광응고술 등의 항-혈관신생 치료를 포함한 처치를 이전에 받은 적이 있던 환자; 유리체 절체술을 받은 적이 있는 환자; 또는 조절불가능한 고혈압, 심근경색 또는 뇌혈관질환을 앓는 환자는 본 연구에서 제외하였다.

(4) 정상 대조군 환자

백내장 수술을 앞두고 있는 환자, 종합적인 안구검사에 근거하였을 때 망막혈관질환을 앓고 있지 않은 환자, 및 분석에 동의한 환자를 정상 대조군 환자로 50명을 선별하였다.

실시예 2: 시료 채취

실시예 2-1: 안방수 수집

희석시키지 않은 안방수(aqueous humor) 시료 0.1 내지 0.2 ㎖를 투베르쿨린 마이크로시린지에 부착된 30-게이지 바늘(gauge needle)을 사용하여 천자(limbal paracentesis)를 통해 흡입하였다. 시료는 즉시 무균 시험관으로 옮겼고, 시료를 분석하기까지 급속 냉동고에서 -80 ℃에서 보관하였다.

실시예 2-2: 플라즈마(혈장) 수집

헤모글로빈 간섭(hemoglobin interference)을 최소화하기 위하여, 혈장은 주정중정맥(antecubital vein)으로부터 혈액을 채취한 즉시 수득하였다.

실시예 3: VEGF 및 SEMA3A의 분석

상기 실시예 2에서 수득한 안방수 시료를 대상으로 VEGF의 농도는 인간 VEGF(Biosource, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에 대한 이뮤노어세이(immunoassay)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였고, 플라즈마(혈장) 내 SEMA3A 농도는 상용중인 ELISA 키트 (CUSABIO Biotech Co., Wuhan, China)를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, VEGF 어세이는 안방수 시료를 항-마우스 VEGF 폴리클로날 항체로 코팅된 플레이트의 각 웰에 접종하였고, 2시간동안 배양하였다. 세척 완충액으로 세척한 후, 용액을 100 ㎕의 효소-결합된 폴리클로날 항체와 함께 2시간동안 추가배양하였다. 이후 기질 용액(substrate solution)을 추가하였고 플레이트를 실온에서 30분동안 배양시켰다. 반응혼합물에서의 색의 강도는 multi-late reader를 사용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.

또한 SEMA3A의 분석을 위하여 환자로부터 채취한 플라즈마(혈장) 시료를 각 웰에 접종하고 2시간동안 배양하였다. 각 웰의 액체(liquid)를 제거한 후, 100 ㎕의 Biotin-antibody(1x)를 각 웰에 접종하였고, 1시간동안 추가로 배양하였다. 상기 프로세스를 2번 이상 반복한 후 세척 완충액으로 세척하였다. 100 ㎕의 HRP-avidin(1x)를 각 웰에 접종였고, 1시간동안 배양하였다. 정지액(stop solution)을 추가한 후, 광학밀도(optical density)는 microplate reader를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

그 결과, 약 10 pg/㎖의 VEGF 농도를 보인 정상대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)에 비하여 비증식성 당뇨망막병증 개체에서는 약 60 pg/㎖의 VEGF 농도를 보여 발현수준이 현저히 높았고, 이러한 비증식성 당뇨망막병증 개체에 비하여 증식성 당뇨망막병증 개체에서는 약 170 pg/㎖의 VEGF 농도를 보였는바, 발현수준이 현저히 높았다(도 1a).

반면, 세마포린 3A의 경우 정상대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 및 비증식성 당뇨망막병증 개체에서 발현수준은 약 0.25 내지 0.4 ng/㎖로 낮았으나, 증식성 당뇨망막병증 개체에서 1 ng/㎖로 특이적으로 발현수준이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1b).

실시예 4: 모세혈관 비관류 영역의 측정

당뇨환자 망막에서의 병리생리학적 변화를 살펴보면 모세혈관주위세포의 손실, 기저막 비후, 망막 혈관 자동조절기능의 손상, 모세순환이상, 미세혈관류, IRMA(intraretinal microvascular abnormalities) 등이 일어나며, 결국 망막 비관류 영역을 발생시킨다(Lip P.L. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 41:2115-2119 (2000); Hammes H.P. et al., Diabetes 51:3107-3112, 2002). 이런 변화들은 계속적인 진행을 통해 혈관 투과성의 증가, 만성 망막 저산소증 및 망막 허혈을 유도하여, 결국 황반부종 혹은 신생혈관이 형성되어 증식성 당뇨망막병증으로 진행된다(Aiello L.P. et al., Diabetes Care 21:143-156, 1998). 따라서 망막 비관류 영역의 발생 정도를 통해 증식성 당뇨망막병증의 진행 정도에 대하여도 진단할 수 있는바, 본 발명에서 망막 비관류 영역의 면적과 증식성 당뇨망막병증과의 관계를 확인함으로써 SEMA3A의 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로의 활용도를 확인하고자 하였다.

당뇨망막병증을 가진 환자를 대상으로 정맥 안저부분을 플루오레세인 혈관조영을 수행하였다. 동정맥 충만기(arteriovenous filling phase)의 완료 후, Heidelberg Retinal Angiography(HRA; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)를 사용하여 대표 이미지를 캡쳐하여 수득하였다.

혈관조영에서의 30°circles을 조합하였고, Early Treatment Diabetic Retinopathy Study의 프로토콜을 사용하여 7개의 표준영역(standard fields, 7SFs)을 제시하였다. 7SF 프로토콜은 망막의 7개 원 영역을 포함하는데, 3개는 황반에 수평으로 가로질러 있고(horizontally across), 4개는 시신경 유두(optic disc)의 부근에 있다. 종합한 이미지는 시각화(visualization)의 약 75°를 차지하였다.

모세혈관 비관류영역은 망막 모세혈관상의 드롭아웃(dropout)으로 정의하였다. 이 영역의 이미지는 면적 측정기능(area measurement function)을 사용하여 둘러싸여있고, 7SF의 총 이미지 영역은 픽셀로 계산되었다. 둘러싸인 혈관조영의 비관류 영역을 7SF ETDRS 프로토콜을 사용하여 평가하였고, 2명의 트레이너에 의해 계산되었다. 망막의 혈관 누수는 비관류로 고려하지 않았다.

그 결과, 측정된 VEGF의 농도와 망막 모세혈관의 비관류 영역의 면적 간에는 양의 상관관계를 가짐을 확인하였으며(도 2a), 측정된 SEMA3A의 농도와 망막 모세혈관의 비관류 영역의 면적 간에도 양의 상관관계를 가짐을 확인함으로써 증식성 당뇨망막병증의 진단 마커로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 2b).

또한, 비증식성 당뇨망막병증 환자에 비해 증식성 당뇨망막병증 환자에게서 비관류 영역이 넓음을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 제제로서, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드; 또는 세마포린 3A 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 증식성 당뇨망막병증(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR) 진단용 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 조성물은 증식성 당뇨망막병증 소견이 있는 환자의 분리된 생물학적 시료에 사용하기 위한 것인 조성물.
제4항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 안방수(aqueous humor), 혈장, 혈청 또는 혈액인 것인 조성물.
제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 증식성 당뇨망막병증 진단용 키트.
생물학적 시료로부터 세마포린 3A(Semaphorin 3A, SEMA3A) 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 또는 비증식성 당뇨망막병증 시료와 비교하는 단계를 포함하는 증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 세마포린 3A 유전자 또는 단백질의 발현 수준을, 정상 대조군 또는 비증식성 당뇨망막병증 시료의 세마포린 3A 유전자의 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 유전자 또는 단백질의 발현이 증가하면 증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 안방수(aqueous humor), 혈장, 혈청 또는 혈액인 것인 정보 제공 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인 증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
제10항에 있어서,
상기 유전자의 mRNA 수준 측정은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 이용하는 것인 증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
제10항에 있어서,
상기 mRNA 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 정보 제공 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
제13항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것인 정보 제공 방법.