CN107058227B - 一种人结直肠印戒细胞癌细胞系及其应用 - Google Patents

一种人结直肠印戒细胞癌细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人结直肠印戒细胞癌细胞系，动物模型及其应用。人结直肠印戒细胞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代。本发明公开的人结直肠印戒细胞癌细胞系具有临床上人印戒细胞癌的生物学形状，在哺乳动物中产生人结直肠印戒细胞癌，可用于制备人印戒细胞癌模型，可进一步用于筛选治疗罕见的人结直肠印戒细胞癌的候选药物。细胞系的建立为结直肠印戒细胞癌的研究提供新的更接近与临床肿瘤生物学特性的实验材料。

Description

一种人结直肠印戒细胞癌细胞系及其应用
发明所属领域：
本发明属于动物细胞系领域，特别涉及一种人结直肠印戒细胞癌细胞系的建立，及其动物模型和应用。
背景技术：
印戒细胞癌是结直肠腺癌的一种特殊亚型。根据2010年版WHO的组织学分类标准，印戒细胞癌被定义为组织内50％以上的肿瘤细胞由胞浆中富含黏蛋白的腺癌细胞构成，黏蛋白充满细胞质并使细胞核移位，在显微镜下呈典型印戒细胞样结构。原发于胃的印戒细胞癌在临床上最为常见，约占到所有印戒细胞癌的95％以上，其他印戒细胞癌也可出现于结直肠癌、卵巢癌、腹膜癌及胆囊癌中。在结直肠癌中，印戒细胞癌是极为少见的，占所有结直肠癌的1％左右。印戒细胞癌的发病年龄较传统腺癌明显提前，不同文献报道印戒细胞癌的平均发病年龄在52-67岁之间，小于40岁人群的发病率明显高于传统腺癌。
结直肠印戒细胞癌的预后比传统腺癌较差，5年生存率在0％-36％之间，平均存活时间为9-45个月。与传统腺癌相比，印戒细胞癌发现时的病期较晚，约60％的印戒细胞癌患者在确诊时已经处于III期或IV期，I-II期的印戒细胞癌比率仅有5％左右。此外，印戒细胞癌极易发生淋巴结转移及腹膜转移，转移率分别高达79％及35.7％，却较少发生肝转移。腹膜转移使患者丧失根治性手术的机会，且对化疗的敏感性差，因此导致印戒细胞癌患者的预后更差。
有关结直肠印戒细胞癌的发生、发展、转移和耐药的生物学机制目前尚不清楚。目前缺少用于结直肠印戒细胞癌发生机理及抗印戒细胞癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料，通过对美国典型培养物保藏中心ATCC、上海细胞库等国际上大型细胞库搜索，没有发现已经建立好的人结直肠印戒细胞癌细胞系。
由于临床上无法获得相同的病例，在方法学上无法进行比较；更由于伦理道德的限制，以人本身作为实验对象推动医学发展困难重重。
离体培养的人源肿瘤细胞可充分反映肿瘤的临床生物学特性，遗传性稳定的体外培养的人源肿瘤细胞对于药物的耐药性及敏感性具有很好的预测性，是研究结直肠印戒细胞癌的发生、发展机制和抗肿瘤药物筛选的理想实验材料。
疾病的动物模型是生物医学研究中建立的具有人体疾病的症状相似表现的动物实验对象和材料。采用动物模型对疾病进行研究具有样本数量大和性状一致性，能更方便，更有效地认识疾病的发生，发展规律，并提供预防和治疗方法。
由于病例数的限制，目前国内外多数研究都基于病例报道或者小规模的回顾性研究，对于其发生发展机制的生物学研究相对少见。另外，结直肠印戒细胞癌细胞与传统腺癌细胞从细胞形态和生长特性上都差别很大，对各种生长因子的需求亦不同，所以无法参考现有的建细胞系方法培养结直肠印戒细胞癌细胞。经查阅大量文献和专利数据，目前没有发现已经成功建立的结直肠印戒细胞癌细胞系。因此，也缺少直肠印戒细胞癌细胞的动物模型。因此，本领域的研究人员迫切需立结直肠印戒细胞癌细胞系，以及结直肠印戒细胞癌细胞的动物模型。
发明技术内容：
本发明的一个目的是提供一种新的人结直肠印戒细胞癌细胞系，该细胞系可稳定传代，可充分反映人结直肠印戒细胞癌的临床生物学特性。
本发明的另一个目的是提供一种人结直肠印戒细胞癌细胞的动物模型，该动物模型不仅充分反映肿瘤的临床生物学特性，对于药物的耐药性及敏感性具有很好的预测性，是研究结直肠印戒细胞癌的发生、发展机制和抗肿瘤药物筛选的理想动物模型。
本发明的再一个目的是建立动物模型的方法。
本发明的再一个目的是提供筛选治疗结直肠印戒细胞癌的候选药物的方法。
本发明的再一个目的是提供结直肠印戒细胞癌细胞及其动物模型的用途
本发明公开了一株人结直肠印戒细胞癌细胞系，细胞命名为人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201722。
本发明还公开了人结直肠印戒细胞癌细胞系的子代细胞系。子代细胞具有相同的遗传稳定性。
本发明公开的人结直肠印戒细胞癌细胞及其子代细胞系具有下列生物学特征：
1)将培养CSRCC01细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下可见CSRCC01细胞悬浮生长失去了接触抑制，呈恶性生长，具有悬浮生长的特点，部分细胞可见新月形细胞核，符合印戒细胞的特点；
2)CSRCC01细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现为非整倍体，染色体众数(M)集中在76-85之间，占70％；该CSRCC01细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征；
3)CSRCC01细胞免疫荧光染色显示，上皮细胞粘附分子(EpCAM，绿色，400×)呈细胞膜阳性，证明其上皮来源，黏液蛋白-2(Mucin-2，红色，400×)为胞浆内强阳性，将细胞核(DAPI，蓝色)挤向细胞的一侧，符合其印戒细胞癌的病理特征；
4)CSRCC01细胞的倍增时间约为48小时；
5)CSRCC01细胞周期分布比例是G1期占56.867％，S期占36.695％，G2/M期占6.438％
6)将5.0×106个细胞，细胞悬液和基质胶以1:1混合，皮下接种BALB/C裸鼠，第38天时肿瘤体积为1148.39±327.16mm3；
本发明的人直肠印戒细胞癌细胞系来源于新鲜的临床人结直肠印戒细胞癌手术切除送检确认标本。
本发明还公开了人结直肠癌印戒细胞癌细胞系的建立方法，包括以下步骤：获得新鲜的临床人结直肠印戒细胞癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，PBS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素)漂洗3次，每次5分钟，随后用置于消化液(含DMEM培养基、1％胎牛血清、500U/ml胶原蛋白酶IV、1.5mg/ml胶原蛋白酶II、125μg/ml II型中性蛋白酶，20ug/ml透明质酸酶及10μM Ly27632)中，37摄氏度水浴摇床消化30分钟，剧烈摇晃离心管收集消化下来的细胞团，用预冷的PBS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素)漂洗3次，每次应用离心机69g、4℃离心5分钟，细胞团用基质胶重悬，以200个细胞团/50μl基质胶的密度接种于24孔板，将24孔板于37℃放置5分钟使基质胶聚合，每孔加入500μladvanced DMEM/F12培养基[含体积百分比10％的胎牛血清、1×Normocin(Invivogen)、1×Gentamicin/Amphotericin B(Gibco)、10mM HEPES、10mM Glutamax、1×N2,1×B27,1mM N-乙酰半胱氨酸,50ng/ml表皮细胞生长因子,500ng/mL noggin,500ng/mL R-spondin]，于37℃培养箱体积百分比5％的CO2条件下培养。约14天后，可见细胞团增大，收集基质胶，应用预冷的PBS缓冲液漂洗3次，每次应用离心机69g离心5分钟，接种于培养瓶中，静置培养，可见印戒细胞悬浮生长。
本发明还公开了人结直肠癌印戒细胞癌细胞系的传代方法：将悬浮细胞及培养基收集、离心，PBS缓冲液漂洗1次，用advanced DMEM/F12培养基重悬并以1:5的比例接种于新的培养瓶内。
本发明还公开了人结直肠印戒细胞癌细胞的用途，该细胞用于在哺乳动物中产生人结直肠印戒细胞癌，其优选的哺乳动物是裸鼠。
在离体培养的人结直肠印戒细胞癌细胞中施加无细胞毒性测试化合物，导致人结直肠印戒细胞癌细胞数量减少或死亡的测试化合物就是治疗结直肠印戒细胞癌的候选化合物。
本发明还公开了一种建立人结直肠印戒细胞癌动物模型的方法,其特征在于，
包括步骤：
(A)将1—5.0×106个人结直肠印戒细胞癌细胞的细胞悬液和基质胶以1:1混合，皮下接种裸鼠；
(B)培养步骤(A)的裸鼠2-4周，获得人结直肠印戒细胞癌动物模型。
本发明公开的一个优选方法是：
(A)将5.0×106个保藏编号为CCTCC NO：C201722的细胞悬液和基质胶以1:1混合，皮下接种裸鼠；
(B)培养步骤(A)的裸鼠4周，获得人结直肠印戒细胞癌动物模型。
本发明进一步公开了一种筛选治疗结直肠印戒细胞癌的候选药物的方法，其特种在于，它包括步骤：
(A)将1—5.0×106个的人结直肠印戒细胞癌细胞的细胞悬液和基质胶以1:1混合，皮下接种裸鼠；
(B)培养步骤(A)的裸鼠2-4周，获得人结直肠印戒细胞癌动物模型；
(C)将测试化合物施用于步骤(B)的人结直肠印戒细胞癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(B)的人结直肠印戒细胞癌动物模型比较，其中施用后使结直肠印戒细胞癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗结直肠印戒细胞癌的候选化合物。
在步骤(C)中，将测试化合物施用于动物模型的方式选自：局部施用于人结直肠印戒细胞癌病灶处、静脉给药、口服给药。
在本发明中，结直肠印戒细胞癌也叫直肠印戒细胞癌细胞。
本发明的优点：于现有技术相比，本发明有如下优点：
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
1)本发明的人结直肠印戒细胞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，为结直肠印戒细胞癌提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。
2)本发明的细胞系具有高度成瘤性，可以成功制备结直肠印戒细胞癌动物模型，所制的动物模型可以用于基础研究及药物筛选。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用于分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，可以建立体外、体内两个相关联的抗结直肠印戒细胞癌药物筛选平台。
3)本发明提供的动物模型可以用于研究结直肠印戒细胞癌的发病机理和耐药机理，进而可以寻找结直肠印戒细胞癌转移和耐药特征性生物标志物。
4)本发明公开的细胞系是人结直肠印戒细胞癌的临床前期应用的理想细胞系。
生物材料的保藏
本发明的人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01，于2017年4月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C201722,研究者可依法从CCTCC获取该细胞，再现本发明。中国典型培养物保藏中心位于中国，武汉，武汉大学，邮编430072，EMAIL：cctcc@whu.edu.cn.
附图说明
图1是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01的形态学观察(100×)
图2是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞的染色体分析
图3是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞的免疫荧光染图
图4是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞的生长模式图
图5是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞周期分析图
图6是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞的成瘤性效果图，图中A表示终点时小鼠肿瘤；图中B表示人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞在裸鼠体内生长曲线(肿瘤体积)。
图7是人结直肠印戒细胞癌肿瘤模型的病理组织切片图，图中A表示临床上取得的肿瘤标本(100×)；图中B表示人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞在裸小鼠体内成瘤(100×)。
图8是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01动物模型体内给抗肿瘤药抑制癌细胞生长图。
图9是人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01在体外96孔板施加化疗药物5-FU,SN-38致癌细胞数量减少图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1培养基配制，试剂配制：
培养基配方
Figure BDA0001281686980000061
实施例2：人结直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01细胞的制备
人直肠印戒细胞癌细胞系来源于新鲜的临床人结直肠印戒细胞癌手术切除送检确认标本。
病人，女，43岁，降结肠癌双侧卵巢转移，病理诊断为粘液腺癌，部分为印戒细胞癌，浸润至粘膜下层，脉管神经未见侵犯，淋巴结0/22。
手术切除送检确认标本的使用获得病人知情同意。
从复旦大学附属肿瘤医院获得新鲜的临床结肠印戒细胞癌切除标本，立即浸润预冷的无菌PBS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素)中。在生物安全柜中，用新鲜的该无菌PBS缓冲液冲洗标本，切成20～50mg的小块，PBS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素)漂洗3次，每次5分钟，随后用置于消化液(含DMEM培养基、1％胎牛血清、500U/ml胶原蛋白酶IV、1.5mg/ml胶原蛋白酶II、125μg/ml II型中性蛋白酶，20ug/ml透明质酸酶及10μM Ly27632)中，37摄氏度水浴摇床消化30分钟，剧烈摇晃离心管收集消化下来的细胞团，用预冷的PBS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素)漂洗3次，每次应用离心机69g、4℃离心5分钟，细胞团用基质胶重悬，以200个细胞团/50μl基质胶的密度接种于24孔板，将24孔板于37℃放置5分钟使基质胶聚合，每孔加入500μl advanced DMEM/F12培养基[含体积百分比10％的胎牛血清、1×Normocin(Invivogen)、1×Gentamicin/Amphotericin B(Gibco)、10mM HEPES、10mM Glutamax、1×N2,1×B27,1mM N-乙酰半胱氨酸,50ng/ml表皮细胞生长因子,500ng/mL noggin,500ng/mL R-spondin]，于37℃培养箱体积百分比5％的CO2条件下培养。约14天后，可见细胞团增大，收集基质胶，应用预冷的PBS缓冲液漂洗3次，每次应用离心机69g离心5分钟，接种于培养瓶中，静置培养，可见印戒细胞悬浮生长。
传代培养：当成团悬浮印戒细胞布满培养瓶时，进行细胞传代，具体步骤如下：将悬浮细胞及培养基收集、离心，PBS缓冲液漂洗1次，用advanced DMEM/F12培养基重悬并以1:5的比例接种于新的培养瓶内。细胞生长状态良好，形态较为均一。传代至30代以上。
在本发明中，来源于肿瘤组织的原代培养基传代培养细胞呈上皮样，细胞形态较为均一，无接触抑制，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快；将该细胞系命名为人直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01，于2017年4月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201722。
实施例3人直肠印戒细胞癌细胞系CSRCC01的生物学特性
本发明采用含有胎牛血清、HEPES、Glutamax、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、表皮细胞生长因子、noggin及R-spondin的advanced DMEM/F12培养液培养CSRCC01细胞，使其能体外长期生长和稳定传代，当细胞传至20代以上，细胞形状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传性和组织来源鉴定，直至30代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的CSRCC01细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该CSRCC01细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。具体如下：
3.1形态学观察
将培养CSRCC01细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照。结果见图1(100×)，可见，CSRCC01细胞悬浮生长失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重贴生长的特点，部分细胞可见新月形细胞核，符合印戒细胞的特点。
3.2染色体的鉴定
将培养的CSRCC01细胞置于4℃孵育12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.4μg/ml，再于37℃孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2，可见，CSRCC01细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现为非整倍体，染色体众数(M)集中在76-85之间，占70％。可见该CSRCC01细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。
3.3免疫荧光染色
将CSRCC01细胞用基质胶重悬接种于24孔板中，待细胞增殖成团后，去除培养基，用4％多聚甲醛固定，脱水后进行石蜡包埋，切片进行免疫荧光染色。根据图3结果显示，上皮细胞粘附分子(EpCAM，绿色，400×)呈细胞膜阳性，证明其上皮来源，黏液蛋白-2(Mucin-2，红色，400×)为胞浆内强阳性，将细胞核(DAPI，蓝色)挤向细胞的一侧，符合其印戒细胞癌的病理特征。
3.4细胞动力学
将吹散的CSRCC01细胞以1×104/50μl基质胶的密度接种于24孔板中，进行培养，分别在24小时、48小时、96小时、144小时、162小时应用倒置显微镜拍照，追踪单个细胞的生长变化(图4A)，并计算每个100×视野下细胞团的克隆个数(图4B)。根据图4结果显示，CSRCC01细胞的倍增时间约为48小时。
3.5细胞周期分布。
收集约1-106细胞与15ml离心管中，离心弃上清。细胞沉淀用4ml-20℃75％乙醇重悬，4℃固定过夜。离心弃上清，加入3ml PBS水化15min，加入500μl PI染色液。混匀，室温孵育30分钟。用流式细胞仪检测。检测得到周期分布图(图5)和各周期分布比例(下表)。
周期分布 百分比
G1期 56.867
S期 36.695
G2/M期 6.438
3.6细胞的成瘤性
体外培养和收集CSRCC01细胞，皮下接种BALB/C(每只动物接种5.0×106个细胞，细胞悬液和基质胶以1:1混合，共接种5只动物)，每周两次测量肿瘤大小。接种约2周后，肿瘤开始形成并生长。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝(长×宽2)÷2，在第38天结束实验，这时的肿瘤体积为1148.39±327.16mm3，并且安乐死处死动物，无菌取瘤。可见该CSRCC01细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性(图6)。
实施例4：人直肠印戒细胞癌动物模型的建立
4.1体外培养和收集CSRCC01细胞，皮下接种BALB/C(每只动物接种5.0×106个细胞，细胞悬液和基质胶以1:1混合，共接种5只动物)，每周两次测量肿瘤大小。接种约2周后，肿瘤开始形成并生长。在第38天肿瘤体积为1148.39±327.16mm3(图6)。
4.2肿瘤的病理学鉴定
CSRCC01细胞在裸鼠皮下接种30天后形成的肿瘤，进行石蜡包埋茄片和H&E染色，结果见7。它们的病理诊断结果见下表1。可见临床标本(图7A)和CSRCC01细胞在裸小鼠体内所形成的肿瘤(图7B)结构类似，形成对应关系。
表1.各肿瘤标本的病理诊断结果
Figure BDA0001281686980000091
实施例5：预防和治疗人结直肠印戒细胞癌的候选药物的筛选
将CSRCC01细胞在裸鼠皮下接种成瘤，待皮下肿瘤长至150立方毫米左右，通过尾静脉给抗肿瘤药物5-FU组(30mg/kg),隔天给药，连续两周，同时对照以生理盐水作为对照组。图8结果显示给药组肿瘤生长明显受到抑制，提示CSRCC01细胞裸鼠荷瘤模型能用于体内候选药物的筛选。
实施例6：在离体培养细胞中进行预防和治疗人结直肠印戒细胞癌的候选药物的筛选
将悬浮CSRCC01细胞收集、离心，PBS缓冲液漂洗1次，用advanced DMEM/F12培养基重悬并以每孔1.0×104的密度接种于96孔板中，培养24后加入10微升不同浓度治疗大肠癌药物-5-FU(10μM)和伊利替康的活性成分SN38(10μM)，带培养5天后用MTT方法检测细胞存活。结果(图9)显示10um SN38(抑制率约为70％)和10um 5-FU((抑制率约为50％)能明显抑制CSRCC01细胞生长，呈现抗肿瘤活性。该结果提示CSRCC01细胞株可以用于结直肠印戒细胞癌的候选药物的筛选。

Claims (7)

1.一种人结直肠印戒细胞癌细胞，其特征在于，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201722。
2.如权利要求1所述的人结直肠印戒细胞癌细胞的子代细胞,其特征在于,所述子代细胞能够导致裸鼠产生人结直肠印戒细胞癌。
3.如权利要求1所述的人结直肠印戒细胞癌细胞的用途，其特征在于，用于在哺乳动物中产生人结直肠印戒细胞癌。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物是裸鼠。
5.如权利要求1所述的人结直肠印戒细胞癌细胞的用途，其特征在于，在离体培养的人结直肠印戒细胞癌细胞中施加无细胞毒性测试化合物，导致人结直肠印戒细胞癌细胞数量减少或死亡的测试化合物就是治疗结直肠印戒细胞癌的候选化合物。
6.一种建立人结直肠印戒细胞癌动物模型的方法,其特征在于，包括步骤：
(A)将1—5.0×106个权利要求1的人结直肠印戒细胞癌细胞的细胞悬液和基质胶以1:1混合，皮下接种裸鼠；
(B)培养步骤(A)的裸鼠2-4周，获得人结直肠印戒细胞癌动物模型。
7.根据权利要求6的方法,其特征在于，包括步骤：
(A)将5.0×106个保藏编号CCTCC NO：C201722的细胞悬液和基质胶以1:1混合，皮下接种裸鼠；
(B)培养步骤(A)的裸鼠4周，获得人结直肠印戒细胞癌动物模型。
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